İzolasyon, Transfeksiyon ve Yetişkin Fare ve Sıçan Kardiyomiyositlerinin Uzun Süreli Kültürü

Özet

Burada, yetişkin fare ve sıçan kardiyomiyositlerinin izolasyon, transfeksiyon ve uzun vadeli kültürü için bir protokol sıyoruz.

Özet

Erişkin memeli kardiyomiyositlerin (CMs) ex vivo kültürü, kardiyak biyolojinin in vitro çalışması için en uygun deneysel sistemi sunmaktadır. Erişkin memeli CM'ler en az proliferatif kapasiteye sahip ölümcül farklılaşmış hücrelerdir. Erişkin CM'lerin mitotik sonrası durumu sadece kardiyomiyosit hücre döngüsünün ilerlemesini kısıtlamakla kalmamış, aynı zamanda CM'lerin verimli kültürünü de sınırlandırır. Ayrıca, yetişkin CM'lerin uzun vadeli kültürü CM proliferasyonu ve gen ekspresyonunun analizi gibi birçok çalışma için gereklidir.

Fare ve sıçan kardiyomiyosit izolasyonu için kullanılan iki en çok tercih edilen laboratuvar hayvanlarıdır. Sıçan CM'lerinin uzun süreli kültürü mümkün olsa da, yetişkin fare CM'leri ölüme duyarlıdır ve normal koşullarda beş günden fazla kültürlenemez. Bu nedenle, yetişkin murine CMs için hücre izolasyonu ve uzun vadeli kültür protokolü optimize etmek için kritik bir ihtiyaç vardır. Bu değiştirilmiş protokol ile, 20 günden fazla hem yetişkin fare yi hem de fare CM'lerini başarılı bir şekilde izole etmek ve kültüretmek mümkündür. Ayrıca, izole CM siRNA transfeksiyon verimliliği önemli ölçüde önceki raporlara göre artmıştır. Yetişkin fare CM izolasyonu için Langendorff perfüzyon yöntemi optimal enzim çözeltisi ve tam ekstrasellüler matriks ayrışması için yeterli zaman ile kullanılmaktadır. Saf ventriküler CM'ler elde etmek için, her iki atria diseksiyon ve kaplama ile devam etmeden önce diseksiyon ve atılır. Hücreler verimli ve hızlı bağlanmaya olanak sağlayan laminin kaplı bir plaka üzerinde dağıtıldı. CMs siRNA transfeksiyon önce 4-6 saat yerleşmek için izin verildi. Kültür medyası 20 gün boyunca her 24 saatte bir yenilendi ve daha sonra, CM'ler Troponin ve KI67 gibi hücre döngüsünün belirteçleri gibi kardiyak spesifik belirteçler için sabit lendi ve lekelendi.

Giriş

Kalp hastalıkları dünya çapında önde gelen ölüm nedenlerinden biridir. Kardiyak yaralanmanın hemen hemen her türü erişkin kardiyomiyosit (CM) kaybıile sonuçlanır. Erişkin memeli kalpler yetişkin CM¹senescent doğası nedeniyle kardiyak yaralanma onarmak mümkün değildir. Böylece, yetişkin memeli kalp herhangi bir hakaret CMs kalıcı bir kaybına yol, azaltılmış kalp fonksiyonu ve kalp yetmezliğine yol açan. Yetişkin memelilerin aksine, zebra balığı ve yeni kalpler gibi küçük hayvanlar mevcut CM çoğalması^2,3,4ile kardiyak yaralanmalarını yenileyebilirler. Hem proliferatif hem de proliferatif olmayan yaklaşımlar la kardiyak yaralanmalar için yeni bir terapötik müdahale bulmak için dünya çapında bir çaba devam etmektedir. Son yıllarda, genetik fare modelleri çeşitli kardiyak yaralanma ve onarım çalışma geliştirilmiştir. Ancak, in vivo hayvan modelleri kullanarak ikincil etkileri bir hücre özerk mekanizma deşifre etmek için ek karmaşıklığı ile pahalı bir yaklaşım olmaya devam etmektedir. Ayrıca in vivo sistemleri, CM'den kardiyoprotektif sinyalizasyona neden olan farmakolojik bir müdahalenin CM'ye özgü etkilerini analiz etmek zordur.

Ayrıca, cm proliferasyon analizleri yapmak için yetişkin CM'lerin uzun vadeli kültürü gereklidir. CM proliferasyon tahlilleri hücrelerin hücre döngüsüne indüklenen ve bundan sonra doğru veri elde etmek için en az 4-5 gün gerektirir. Ayrıca, elektrofizyolojik çalışmalar, ilaç taraması, toksisite çalışmaları ve Ca⁺⁺ homeostaz çalışmaları için izole CM'ler kullanan çalışmalar tüm gelişmiş bir kültür sistemi 5 ihtiyacı vardır^5,6,7. Ayrıca, son çalışmalar CMs salgılanan sitokinlerin kardiyoprotektif önemini göstermektedir (kardiyokines)^8,9. Kalp onarımı ve rejenerasyonu sırasında bu kardiyokinelerin terapötik rolünü ve moleküler mekanizmasını araştırmak için uzun süreli bir kültür gereklidir.

Yetişkin sıçan CMs bir in vitro sistem^10,,11,,12tek hücreli izolasyon ve uzun vadeli kültür için yeterince sağlam . Ancak, yetişkin fare CMs in vitro tahliller için büyük ilgi vardır, genetik olarak değiştirilmiş fare modelleri çeşitli durumu nedeniyle, hangi tasarım ve sıçan CM ile mümkün değildir çeşitli yenilikçi analizlerin yürütülmesi için izin verir¹³. Yetişkin fare CM izolasyon aksine, yetişkin fare kalplerden tek hücreli süspansiyon elde etmek oldukça zordur, ve kültür yetişkin fare CMs uzun vadeli kültür daha da zordur.

Bir Langendorff sistemi kullanarak fare ve sıçan kalplerinden Yetişkin CM izolasyon u daha önce CM fonksiyonu^5,14,,15çalışma kurulmuştur. Burada, hem sıçanlardan hem de farelerden yetişkin CM izolasyonprotokollerinin yanı sıra izole edilmiş hücrelerin değiştirilmiş uzun vadeli kültürü, transfeksiyonu ve CM çoğalmasını ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Protokol

Tüm deneyler, ABD Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nun yönergelerine uygun olarak yapılmalıdır. Videoda görüntülenen tüm protokoller Cincinnati Üniversitesi, Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Yetişkin farelerden (ve sıçanlardan) kalp çıkarma öncesi hazırlık

1. Sırasıyla fare ve fare izolasyonu için Tablo 1 ve Tablo 2'deverilen tariflere göre karşılık gelen perfüzyon, enzim ve durdurma çözeltilerini hazırlayın. Herhangi bir kontaminasyon veya çözülmemiş partikülleri temizlemek için çözeltileri 0,22 m filtreden filtreleyin.
2. 15 dakika boyunca %70 alkolle ıslatarak cerrahi aletleri temizleyin ve sterilize edin ve daha sonra çift distile su ile yıkayın. Temiz bir kağıt havlu üzerinde kuru hava araçları bırakın.
3. Su banyosunu 37 ºC'ye önceden ısıtın. İşlem sırasında perfüzyon aparatı ile ılık suyun kesintisiz dolaşımını sağlamak için su banyosundaki su seviyesini kontrol edin.
4. Perfüzyon cihazını %70 alkolle 5 dk. Tekrarederek temizleyin.
   NOT: Borunun temizlenmesine yardımcı olan akış hızını artırın.
5. Alkol aktıktan sonra, 10 dakika boyunca çift distile su çalıştırarak alkol kalıntıları temizleyin.
6. Eksizyondan sonra kalbi temizlemek için 3 adet orta boy tek kullanımlık polistiren tartım tabakları ayarlayın. Bulaşıkları 20 mL miyosit tamponu ile doldurun.
7. Pasteur pipet yardımı ile her çan ara2-3 damla heparin ekleyin ve birden fazla kez pipetleme tarafından iyice karıştırın.
8. Künt iğne kanüllü 10 mL'lik bir şırınga alın.
   NOT: Temiz ve steril bir iğnenin ucunu keserek künt bir iğne kanüli hazırlanabilir. Fare ve sıçan için kanül yapmak için sırasıyla 21 G iğne ve 14 G iğne kullanıldı.
9. Şırıngayı perfüzyon tamponuile doldurun (Tablo 1). Şırıngadan hava kabarcıklarını çıkarın ve açılı bir pozisyonda üçüncü tabağa yerleştirin. Bantla sabitleyin.
   NOT: Sıçanlar için miyosit perfüzyon tamponu yerine A Çözeltisi (Tablo 2) kullanılmıştır.
10. Cerrahi bir dikiş ile gevşek bir düğüm hazırlayın ve iğne etrafında yerleştirin.
11. Anestezi enjeksiyonundan 20 dakika önce intraperitoneal enjeksiyon ile fareye heparin (100 USP ünitesi/fare) enjekte edin.
12. Perfüzyon aparatı aracılığıyla miyosit perfüzyon tamponu(Tablo 1)dolaşın. Akış hızını 3 mL/dk'ya düşürün.
    NOT: Sıçanlar için miyosit perfüzyon tamponu yerine A Çözeltisi (Tablo 2) kullanılmıştır.
13. 5 dakika sonra perfüzyon tamponu enzim solüsyonu ile değiştirin (Tablo 1). İşlem sırasında enzim çözeltisini oksijenle doygunlayın. 3 mL/dk akış hızı kullanın.
    NOT: Fare CM izolasyonu için bunun yerine E (Tablo 2) çözeltisi kullanın.
14. Anestezi intraperitoneal enjeksiyon ile fare anestezi. Terminal cerrahisi için IACUC tarafından önerilen uygun dozda anestezi kullanın.
15. Bir parmak sıkışması bir yanıt eksikliği ile anestezi yeterli derinliği onaylayın. Sonra fareyi cerrahi platforma koy.

2. Erişkin farelerden (ve sıçanlardan) kalp çıkarma

1. % 70 alkol ile silerek cildi sterilize.
2. Göğsü dikkatlice aç.
3. Kalbi çıkar. Eksizyon sırasında kalp dışı dokulardan kaçının.
4. Perfüzyon tampon(Tablo 1)ile dolu ilk çanak, kalp koyun.
   NOT: Fare için A çözeltisi kullanın (Tablo 2).
5. Yavaşça sıkarak kalpten kan temizleyin.
6. Kalbi ikinci yemeğe aktar.
7. Kalpten kan temizleyin ve kardiyak olmayan dokuları çıkarın. Daha sonra, üçüncü çanak kalp aktarın.
8. Akciğerleri ve diğer çevre dokuları kesin ve yükselen aort yoluyla kanüle. Bu işlem CM kalitesini ve miktarını artırmak için mümkün olduğunca hızlı (<5 dk) yapılmalıdır.

3. Kalbin sindirimi

1. Fare kalbinin sindirimi
   NOT: Fare nin kalbinde dolaşan tüm çözeltiler/tamponlar işlem boyunca oksijenlendirilmelidir.
   1. Kantin iğnesini şırıngadan dikkatlice çıkarın ve Langendorff perfüzyon cihazına bağlayın.
   2. Enzim çözeltisi ve sindirim akışı etkileyebilir kalbe giden herhangi bir hava kabarcıkları kaçının.
   3. Kalbe homojen bir ortam sağlamak için su ceketini yukarı taşıyın. Enzim çözeltisinin kalpten 2-3 mL/dk hızla akmasına izin verin.
      NOT: Geçen çözeltinin hızı kritiktir ve CM miktarı ve kalitesinin sonucu üzerinde önemli bir etkiye sahiptir.
   4. Enzim çözeltisi 2 dakika boyunca kalp ten akmasına izin verin.
   5. 2 dk, enzim çözeltisine 40 μL 100 μM CaCl₂ çözeltisi ekleyin ve karıştırın. Enzim çözeltisi başka bir 10-15 dakika için kalp geçmesine izin verin.
      NOT: Bir kez akış pürüzsüz olur, kalp kahverengimsi ve yumuşak olur, kollajenaz enzimi ve kalbin düzgün sindirim eşit dağılımı gösteren.
2. Fare kalbinin sindirimi
   NOT: Fare nin kalbinde dolaşan tüm çözeltiler/tamponlar işlem boyunca oksijenlendirilmelidir.
   1. Kantin iğnesini şırıngadan dikkatlice çıkarın ve Langendorff perfüzyon cihazına bağlayın.
   2. Enzim çözeltisi ve sindirim akışı etkileyebilir kalbe giden herhangi bir hava kabarcıkları kaçının.
   3. Kalbe homojen bir ortam sağlamak için su ceketini yukarı taşıyın.
   4. Çözelti a akışını 3-5 dk kalpten herhangi bir kan çıkarmak için 2-3 mL/dk hızda başlatın.
      NOT: Geçen çözeltinin hızı kritiktir ve CM kalitesinin sonucu üzerinde önemli bir etkiye sahiptir.
   5. Kan kalpten temizlendikten sonra A çözeltisinden çözeltiE(Tablo 2)geçin. Çözeltide 0,1 mM'lik son konsantrasyon için aşağıda belirtildiği gibi CaCl₂ ile Titrat çözeltisi E:
      1. Perfüzyon 10 dakika sonra, 0,1 M CaCl₂12,5 μL ekleyin.
      2. Perfüzyon 15 dk sonra, 0,1 M_CaCl2 25 μL ekleyin.
   6. Akış hızlı hale gelene ve kalp esnek olana kadar enzim çözeltisi 30-40 dakika daha kalpten geçsin.

4. CM tek hücreli süspansiyon hazırlanması

1. CM tek hücreli süspansiyonun hazırlanması (fare)
   1. Kalbi Langendorff perfüzyon sisteminden çıkarın. 5 mL enzim çözeltisi ile dolu 60 mm Petri kabına taşıyın ve kabı biyogüvenlik başlığına aktarın.
      NOT: Langendorff perfüzyon sisteminden kalbi çıkarmadan önce yeterli kalp sindirimini sağlayın. Sindirim süresi enzim aktivitesine, çözelti akışına ve kalbin büyüklüğüne bağlıdır.
   2. Steriliteyi sağlamak ve kontaminasyonu önlemek için biyogüvenlik kaputunda daha fazla mekanik ayrışma gerçekleştirin.
   3. Dikkatle atria kaldırmak (1/4^bazal kalp kısmı) ve ekstra yağ dokuları.
   4. İnce parçalar halinde forceps ile kalp kıyma.
   5. Steril bir Pasteur pipetalın ve ucunu 45º açıyla kesin.
   6. Bu Pasteur pipetini kullanarak kalp dokusunu tek hücreli süspansiyonda hafif pipetleme ile dağıtın. Optimal sindirim tek hücreli kardiyomiyositlerin süspansiyon sağlar.
      NOT: Mekanik yakıcılık nedeniyle CM hasarını azaltmak için transfer borusunun dar, alt kısmını çıkarın.
   7. Daha sonra, aşırı hazımsızlık olasılığını önler enzim aktivitesini durdurmak için durdurmak çözeltisi 5 mL ekleyin.
   8. Taze bir 50 mL konik alın ve steril 100 μm hücresüz üzerine yerleştirin.
   9. Doku yığınıkaldırmak için hücre süzgeci aracılığıyla kardiyomiyosit süspansiyon geçirin. Petri kabını ve süzgeci, süzgeçe bağlı kalan kardiyomiyositleri toplamak için 5 mL'lik başka bir stop çözeltisi(Tablo 1)ile yıkayın.
2. CM tek hücreli süspansiyon (sıçan) hazırlanması
   1. Kalbi Langendorff perfüzyon sisteminden çıkarın. Kalbi 5 mL çözelti A ile dolu 100 mm Petri kabına taşıyın ve kabı biyogüvenlik başlığına taşıyın.
      NOT: Langendorff perfüzyon sisteminden kalbi çıkarmadan önce yeterli kalp sindirimini sağlayın. Sindirim süresi enzim aktivitesine, çözelti akışına ve kalbin büyüklüğüne bağlıdır.
   2. Steriliteyi sağlamak ve kontaminasyonu önlemek için biyogüvenlik kaputunda daha fazla mekanik ayrışma gerçekleştirin.
   3. Dikkatle atria kaldırmak (bazal kalp kısmının 1/4th) ve ekstra yağ dokuları.
   4. İnce parçalar halinde forceps ile kalp kıyma.
   5. Steril bir Pasteur pipetalın ve ucunu 45º açıyla kesin.
   6. Bu Pasteur pipetini kullanarak kalp dokusunu tek hücreli süspansiyonda hafif pipetleme ile dağıtın. Optimal sindirim tek hücreli kardiyomiyositlerin süspansiyon sağlar.
      NOT: Mekanik yakıcılık nedeniyle CM hasarını azaltmak için transfer borusunun dar, alt kısmını çıkarın.
   7. CM süspansiyonuna 5 mL çözelti B(Tablo 2)ekleyin ve kalan yağ veya sindirilmemiş doku parçalarını çıkarmak için çözeltiyi 100 μm hücresüzden geçirin.
   8. Taze bir 50 mL konik şişede filtrat toplayın.
   9. Petri kabını ve kalan CM'yi hücre süzgecinden geçirmek için 5 mL daha b çözeltisi kullanın.

5. CM'siz lerin kaldırılması

1. Yetişkin tek hücreli süspansiyondan (fare) CM'lerden çıkarılma
   1. 3 dk için 20 x g hücre süspansiyon santrifüj.
   2. Supernatant atın ve stop çözeltisi 10 mL hücreleri resuspend(Tablo 1).
      NOT: Stop çözeltisindeki BSA konsantrasyonunun artırılması viskozitesini artıracak ve CM olmayanların sedimantasyon hızını azaltacaktır.
   3. Tüpün 3-5 kez hafif çetren inversiyon ile CM'leri yeniden askıya alın.
   4. 3 dk aralıklarla 100 μM CaCl₂ çözeltisi ekleyin ve karıştırın. Üç kez tekrarlayın.
   5. Dördüncü eklemeden sonra, 3 dk için 20 x g kardiyomiyosit süspansiyon santrifüj.
   6. Supernatant atın.
   7. Önceden ısıtılmış (37 ºC), yetişkin fare CM kaplama medyasında(Tablo 3)CM'leri yeniden askıya alın.
2. Yetişkin tek hücreli süspansiyonlardan (sıçan) CM'siz lerin çıkarılması
   1. Pelet hücreleri 20 x g'de 3 dk 25 ºC'de.
   2. Supernatant atın ve çözelti B 25 mL içine hücreleri resuspend(Tablo 2).
   3. Hücreleri nazik bir şekilde karıştırın ve CM'nin yer çekimi altında yerleşmesini sağlamak için bir tüp standına yerleştirin.
   4. Supernatant'ı dikkatlice atın.
   5. B çözeltisinin 25 mL'lik taze siseviyesindeki hücreleri yeniden askıya alın ve 50 μL, 75 μL ve 100 μL 0,1 M CaCl_2'yi 3-5 dk aralıklarla adım adım ekleyerek 1,0 mM CaCl_2'ye titre edin.
      NOT: Bu adımda B çözeltisinde daha yüksek bir BSA konsantrasyonu kullanılabilir. B çözeltisindeki BSA konsantrasyonunun artırılması viskoziteyi artırır ve böylece CM'siz lerin sedimantasyon hızını azaltır.
   6. Pelet hücreleri 20 x g için 3 dk 25 ºC'de, supernatant aspire ve yetişkin sıçan hücre kültür ortamı nın istenilen hacmi ekleyin(Tablo 4).
   7. Lamina kaplı bir tabakta Tohum CM'leri.
      NOT: CM olmayan hücrelerin kontaminasyonunu en aza indirmek için kaplamasız bir kültür plakası üzerindeki CM'lerin ön kaplaması kullanılabilir.

6. Yetişkin CM kaplama

1. Ön kaplama
   1. Kardiyomiyositleri kültür medyasına yeniden uzaklaştırmak.
   2. Hücreleri fare veya fare CM için 60 mm veya 100 mm'lik bir çanak içine önceden plakalayın.
   3. 37 ºC'de %5 CO₂ ile desteklenen bir kuluçka makinesinde 2 saat kuluçka ya da tüp lüzmler.
   4. Ön plaka kuluçka sırasında, hücre kültür plakalarını uzun süreli CM kültürü için laminin (PBS'de 10 μg/mL) ile kaplayın.
2. Ön kaplama 2 saat sonra, 50 mL konik şişe cms toplamak.
3. Çanak hücreleri toplamak ve transfection deneyleri için bir laminin kaplı 24 iyi kültür plakası içine yeniden plaka.
4. 37 ºC'de bir kuvözdeki kültür hücreleri %5 co₂ile desteklenir. 4-6 saat yüzeyile kardiyomiyositler uymak için yeterli, ve böylece, transfeksiyon 6 saat sonrası kaplama yapılabilir.
   NOT: FBS içeren kaplama ortamı yaygın olarak kullanılır ve proliferasyon çalışmaları ile daha iyi uyumluluk gösterir. Ancak, salgı faktörlerinin analiz edildiği deneylerde serumsuz bir ortam kullanılabilir.

7. Transfeksiyon

1. CM'leri lamina ile kaplanmış hücre kültürü plakalarına 4-6 saat kuluçkaya yatırın.
2. Laminin kaplı plaka üzerinde CM tohumlama dört saat sonra, üreticinin protokolüne göre bir transfeksiyon reagent (örneğin, Lipofektamine RNAiMAX) kullanarak ilgi siRNA (50 nM) ile transfect hücreleri.
3. Transfeksiyondan sonra 24 saat ve ondan sonraki 24 saatte bir 20 güne kadar ortam değiştirin.
4. 20 gün sonra, canlı kardiyomiyositlerin uzun vadede başarılı bir şekilde kültüre kazandırıldığından emin olmak için Troponin gibi kardiyak spesifik belirteçler için immünositokimya da dahil olmak üzere, downstream uygulamaları için PBS'de %4 PFA içeren hücreleri düzeltin.

Sonuçlar

Mevcut değiştirilmiş protokol verimli izolasyon ve tüp bebek fare ve fare CMs kültürü sağlar. Sıçan CM izolasyonu için, toplam 3 yetişkin (12 haftalık) erkek Fischer 344 sıçan kullanıldı. Şekil 1, işlemde gerekli olan cerrahi cihazları ve izolasyon kurulumlarını gösterir; her parça işaretlenmiştir ve şekil efsanesinde açıklanmıştır. Kollajenaz tip 2 sindirim için kullanılmıştır, bu da başarılı izolasyondan yüksek miktarda yüksek kaliteli CM'ler verir...

Tartışmalar

Hücreye özgü mekanistik çalışmalar yapabilmek için yetişkin kardiyomiyosit izolasyonu ve uzun vadeli kültür için bir protokol kurulması çok önemlidir. Yetişkin CM izolasyon protokolleri tartışırken sadece birkaç rapor vardır, ve hatta bunların daha az yetişkin farelerCM^15,,16,,17uzun vadeli kültür için kullanılır. Bu yetişkin sıçan CM yetişkin fareler CM^10,

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3-Butane Dione monoxime	Sigma-Aldrich	B-0753
Blebbistatin	APExBIO	B1387
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A3059
CaCl2	Sigma-Aldrich	449709
Cell culture plate	Corning Costar	3526
Cell strainer	BD Biosciences	352360
Cel-miR-67	Dharmacon	CN-001000-01-50
Collagenase type2	Worthington	LS004177
Disposable Graduated Transfer Pipettes	Fisherbrand	13-711-20
Disposable polystyrene weighing dishes	Sigma-Aldrich	Z154881-500EA
Dulbecco's Modified Eagle's medium	Thermo Scientific	SH30022.01
EdU	Life Technologies	C10337
Fetal bovine serum	Corning	35-015-CV
Fine Point High Precision Forceps	Fisherbrand	22-327379
Glucose	Sigma-Aldrich	G-5400
Hemocytometer	Hausser Scientific	1483
Heparin	Sagent Pharmaceuticals	PSLAB-018285-02
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps	Fisherbrand	12-000-128
Hyaluronidase	Sigma	H3506
Insulin	Sigma-Aldrich	I0516-5ML
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P-8281
KCl	Sigma-Aldrich	746436
Light Microscope	Nikon
Lipofectamine RNAiMAX	Life Technologies	13778-150
MgSO4	Sigma-Aldrich	M-2643
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaOH	Fisher Scientific	S318-500
Natural Mouse Laminin	Invitrogen	23017-015
Penicillin/Streptomycin	Corning	30-002-CI
Pentobarbital	Henry Schein	24352
Phosphate buffered saline	Life Technologies	20012-027
Protease XIV	Sigma-Aldrich	P5147-1G
Selenium	Sigma-Aldrich	229865+5G
siMeis2	Dharmacon	s161030
siRb1	Dharmacon	s128325
Straight Blunt/SharpDissecting Scissors	Fisher Scientific	28252
Straight Very Fine Precision Tip Forceps	Fisherbrand	16-100-120
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Transferrin	Sigma-Aldrich	T8158-100MG
Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor	Fisherbrand	22-079-747
Water Bath	Fisher Scientific	3006S