A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
* These authors contributed equally
تقدم هذه الدراسة استراتيجية تصوير الخلايا العصبية داخل الحيوية غير الغازية جنبا إلى جنب مع استراتيجية برمجية جديدة لتحقيق تتبع وتحليل آلي وغير متحيز لديناميكيات الأنابيب الدقيقة في الجسم الحي (MT) في التشعبات الحسية والوصلات العصبية العضلية ذبابة الفاكهة.
تلعب الأنابيب الدقيقة (MTs) أدوارا حاسمة في تطور الخلايا العصبية ، ولكن لا تزال هناك العديد من الأسئلة حول الآليات الجزيئية لتنظيمها ووظيفتها. علاوة على ذلك ، على الرغم من التقدم المحرز في فهم MTs ما بعد المشبكي ، لا يعرف الكثير عن مساهمات MTs قبل المشبكي في تكوين الخلايا العصبية. على وجه الخصوص ، أسفرت الدراسات التي أجريت على ديناميكيات MT في الجسم الحي في ذبابة الفاكهة عن رؤى مهمة حول السلوك على مستوى البوليمر. ومع ذلك ، فإن التحديات التقنية والتحليلية المرتبطة بالتصوير الحي للوصلة العصبية العضلية للذبابة (NMJ) قد حدت من الدراسات المماثلة لديناميكيات MT قبل المشبكي. علاوة على ذلك ، في حين أن هناك العديد من استراتيجيات البرامج عالية الفعالية للتحليل الآلي لديناميكيات MT في المختبر وخارج الجسم الحي ، فإن البيانات في الجسم الحي غالبا ما تتطلب مدخلات كبيرة من المشغل أو تحليلا يدويا بالكامل بسبب نسبة الإشارة إلى الضوضاء الرديئة بطبيعتها في الصور والتشكل الخلوي المعقد. لمعالجة هذا الأمر ، قامت هذه الدراسة بتحسين منصة برمجية جديدة للكشف الآلي وغير المتحيز عن الجسيمات في الجسم الحي. تم إجراء تحليل متعدد العوامل للصور حية متحدة البؤر ذات الفاصل الزمني ل EB1-GFP المسمى MTs في كل من التشعبات و NMJ من يرقات ذبابة الفاكهة ووجد اختلافات مذهلة في سلوكيات MT. علاوة على ذلك ، تم تحليل ديناميكيات MT بعد الضربة القاضية للبروتين المرتبط ب MT (MAP) dACC ، وهو منظم رئيسي لتطور شببك ذبابة الفاكهة ، وحددت تغييرات ذات دلالة إحصائية في ديناميكيات MT مقارنة بالنوع البري. توضح هذه النتائج أن هذه الاستراتيجية الجديدة للتحليل الآلي متعدد المعلمات لكل من ديناميكيات MT قبل وبعد المشبكي على مستوى البوليمر تقلل بشكل كبير من معايير الإنسان في الحلقة. علاوة على ذلك ، تظهر الدراسة فائدة هذه الطريقة في اكتشاف سلوكيات MT المميزة عند dTACC-knockdown ، مما يشير إلى تطبيق مستقبلي محتمل للشاشات الوظيفية للعوامل التي تنظم ديناميكيات MT في الجسم الحي. قد تركز التطبيقات المستقبلية لهذه الطريقة أيضا على توضيح نوع الخلية و / أو سلوكيات MT الخاصة بالمقصورة ، والتصوير متعدد الألوان المترابط ل EB1-GFP مع العلامات الخلوية وتحت الخلوية الأخرى ذات الأهمية.
تنظم الخلايا لتشكيل هياكل وظيفية من خلال تنسيق التغيرات داخل الخلايا وبينها عن طريق التشكل. من الأمثلة الرائعة على التشكل تطور البنية العصبية عالية التخصص. تظهر الخلايا العصبية استقطابا ملحوظا ، حيث تمتد إلى نوعين متميزين من العمليات هيكليا ووظيفيا ، التشعبات والمحاور1 ، والتي يمكن أن تحقق أطوال هائلة. ينشأ تعقيد تطور الخلايا العصبية ليس فقط من الحجم الهائل للتشعبات والمحاور ولكن أيضا من صعوبة تشكيل هندستها المتفرعةبشكل معقد 2،3. يحفز تكوين الخلايا العصبية وعواقبه في التعلم والذاكرة4 على التحقيق المستمر لكل من التحكم الجيني والآليات البيولوجية الأساسية للخلية. تشمل هذه الآليات ، على سبيل المثال لا الحصر ، نقل الغشاء داخل الخلايا والعديد من عمليات إعادة ترتيب الهيكل الخلوي اللازمة للتغييرات في مورفولوجيا الخلاياالعصبية 1،2،3.
أنتجت دراسات تكوين الخلايا العصبية مجموعة متنوعة من تقنيات التصور المتقدمة. تستخدم الطرق الثابتة ، مثل المجهر الإلكتروني أو المجهر الفلوري للمجسات الثابتة ، على نطاق واسع لإجراء تحليل مورفولوجي وهيكلي عالي الدقة. ومع ذلك ، إلى جانب القطع الأثرية التي لا مفر منها لأي طريقة حفظ ، لا يمكن للتصور الثابت التقاط التغييرات الديناميكية التي تدعم التشكل. وهكذا ، نشأت العديد من الأفكار المحورية من الفحص المجهري الفلوري بفاصل زمني للأنسجة الحية. استخدم العمل المبكر الذي قام به ليشتمان وزملاؤه5،6،7 في التصوير في الجسم الحي للجهاز العصبي للثدييات للتحقيق في تجديد / تنكس المحاور العصبي ، وتنظيم المكونات المشبكية ، والنقل المحوري بعيد المدى. علاوة على ذلك ، كانت الدراسات المنوية في التحويلات العصبية الأولية حاسمة لإثبات أهمية ديناميكيات الأنابيب الدقيقة (MT) للاستطالة المحورية والحركة8،9. بشكل حاسم ، أثبتت دراسات الزرع العصبي المبكرة استخدام بروتينات عائلة الارتباط النهائي (EBs) ذات العلامات الفلورية لاكتساب رؤى لا تقدر بثمن حول ديناميكيات MT plus end في تطوير الخلايا العصبية على مستوى بوليمرات MTالفردية 10. نشأت هذه الدراسات من الملاحظات التي تفيد بأن عضو عائلة EB EB1 يحدد بشكل تفضيلي إلى MT زائد نهايات11 في S. cerevisiae12 وفي الخلايا المستنبتة13. منذ ذلك الحين ، تم استخدام EB1 وبروتينات تتبع الأطراف الأخرى (+ TIPs) 14،15 على نطاق واسع في الدراسات في الجسم الحي لعدم الاستقرار الديناميكي MT16 ، بما في ذلك في سياق تطور الخلايا العصبية17.
ذبابة الفاكهة هو نموذج قوي لدراسات التصوير في الجسم الحي لديناميكيات MT أثناء تطور الخلايا العصبية بسبب الأدوات الجينية والتصوير الواسعة المتاحة لدراسات الذباب18،19 بالإضافة إلى أوجه التشابه في الهيكل والوظيفة بين ذبابة الفاكهة والخلايا العصبية الفقارية1. أجرت دراسة مبكرة رئيسية للوصلة العصبية العضلية (NMJ) ليرقات ذبابة الفاكهة تصويرا متكررا غير جراحي لعلامة غشاء فلورية من خلال بشرة شفافة للحيوانات السليمة لتوثيق التشكل الطرفي قبل المشبكي20. باستخدام طريقة مماثلة لتصوير يرقات ذبابة الفاكهة الحية بالكامل ، تم تقديم عرض أولي لتحليل الجسيمات على مستوى الجسيمات دون الخلوية للحركة العملية لشحنات المحركات في المحاور21. في الآونة الأخيرة ، ميزت الدراسات الدقيقة التي أجراها رولز وزملاؤه في التشعبات الحسية ليرقات ذبابة الفاكهةالسليمة 22،23،24،25،26،27 ديناميكيات MT الإضافية بعد المشبكي من خلال إجراء تتبع الجسيمات وتحليل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) الموسوم ب EB1. مثل هذه الدراسات في ذبابة الفاكهة22،23،24،25،26،27 والأنظمة الأخرى28،29،30،31،32 لديها فهم متقدم بشكل كبير لسلوك البوليمر الفردي ل MT بالإضافة إلى ينتهي في تشعبات الخلايا العصبيةالنامية 33.
على الرغم من الدراسات المثيرة للإعجاب في الجسم الحي لديناميكيات MT ما بعد المشبكي22،23،24،25،26،27،28،29،30،31 ، كان هناك عدد أقل بكثير من الدراسات المماثلة لديناميكيات MT قبل المشبكي في الطرف المحوري النامي. تمت دراسة ديناميكيات MT في ذبابة الفاكهة اليرقات NMJ باستخدام الفحص المجهري للبقع الفلورية (FSM) واستعادة التألق بعد التبييض الضوئي (FRAP) 34. تقوم هذه التقنيات بتقييم حركية التوبولين الإجمالية ولكن ليس سلوك نهايات MT الفردية. حتى كتابة هذه السطور ، كان هناك تحقيق واحد في MT الفردي بالإضافة إلى نهايات ذبابة الفاكهة NMJ: جمعت هذه الدراسة بين التصوير الحي بفاصل زمني مع التحليل اليدوي للتصوير الاحترامي لتوصيف مجموعة من EB1-GFP الديناميكية المسماة "MTs الرائدة" والتي بدت متميزة عن مجموعة أوسع من MTs35 المستقرة. قد يرجع هذا النقص في البحث حول ديناميكيات MT قبل المشبكي جزئيا على الأقل إلى علم التشريح: في حين أنه من السهل نسبيا الحصول على صور للتشعبات نظرا لقربها من بشرة اليرقات ، فإن NMJs تعيقها الأنسجة الأخرى ، مما يجعل من الصعب الحصول على صور ذات نسبة إشارة إلى ضوضاء كافية لتحليل مستوى الجسيمات. ومع ذلك ، نظرا للأهمية الراسخة ل MTs قبل المشبكي للتشكل المشبكي والاستقرار36 ، بالإضافة إلى روابطها بالاضطرابات النمائية العصبية والتنكسيةالعصبية 37 ، فإن سد هذه الفجوة بين فهم MTs قبل وبعد المشبكي من المرجح أن يؤدي إلى رؤى لا تقدر بثمن.
التحدي الإضافي لتحليل ديناميكيات MT في الجسم الحي بشكل عام ، على عكس التحليل في المختبر أو خارج الجسم الحي ، هو أدوات البرامج الآلية المحدودة التي يمكنها استخراج معلمات الديناميكيات من البيانات في الجسم الحي. في الوقت الحاضر ، واحدة من أكثر التقنيات شيوعا وقوة لتحليل نهايات MT plus المسماة + TIP هي plusTipTracker38،39 ، وهو برنامج قائم على MATLAB يسمح بالتتبع الآلي وتحليل معلمات الديناميكيات المتعددة. والجدير بالذكر أن plusTipTracker لا يقيس نمو MT فحسب ، بل يقيس أيضا الانكماش والإنقاذ: في حين أن ملصقات + TIP مثل EB1-GFP ترتبط فقط بالنهايات الإيجابية المتزايدة ، يمكن ل PlusTipTracker استنتاج معدلات الانكماش وأحداث الإنقاذ خوارزميا. ومع ذلك ، في حين أن plusTripTracker قد تم تطبيقه بنجاح كبير في العديد من السياقات ، بما في ذلك التحليل متعدد العوامل السابق لديناميكيات MT ex vivo في ذبابة الفاكهة S2 الخلايا40 ، فإن plusTipTracker ليس مثاليا لتحليل البيانات في الجسم الحي نظرا لانخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء. نتيجة لذلك ، اعتمدت الدراسات في الجسم الحي لديناميكيات النهاية الزائدة في التشعبات22،23،24،25،26،27 وفي NMJ35 من ذبابة الفاكهة على التوليد اليدوي وتحليل الخطوط الحرفية باستخدام برامج مثل ImageJ41 ، أو على الاستراتيجيات شبه الآلية التي تتضمن العديد من مكونات الإنسان في الحلقة.
تقدم هذه الدراسة سير عمل تجريبي وتحليلي يقلل من النفقات العامة التجريبية والتحليلية المطلوبة لإجراء تحليل غير جراحي على مستوى البوليمر لديناميكيات MT قبل المشبكية في كل من التشعبات الحسية والطرف المحوري الحركي ليرقات ذبابة الفاكهة الطور الثالث. يستخدم البروتوكول يرقات سليمة وثابتة وبالتالي يتجنب الإصابات المعروفة بأنها تؤدي إلى استجابات الإجهاد بالإضافة إلى الظروف غير الفسيولوجية الأخرى التي قد تزعج ديناميكيات MT في الجسم الحي. لتسمية نهايات MT الديناميكية الزائدة ، يتم التعبير عن EB1-GFP عموديا باستخدام نظام Gal4 / UAS 42 ، مما يسمح بتصور MTs في كل من التشعبات و NMJ بسائق واحد. في حين أن بعض الخطوات المبكرة تخضع حتما لاتخاذ القرارات البشرية ، مثل اختيار عينات وتحديد المناطق للتصوير ، فإن الخطوات التي تلي الحصول على البيانات مؤتمتة إلى حد كبير. بشكل حاسم ، أتاح تحسين البرنامج الجديد تحليلا آليا وغير متحيز يتطلب الحد الأدنى من المدخلات البشرية. في حين أن طرق تتبع الجسيمات الأخرى متاحة43،44،45 ، تستخدم هذه الدراسة برنامجا احتكاريا لأنه كان مناسبا تماما من الناحية الخوارزمية لمواجهة التحديات الخاصة لمجموعة البيانات المعينة هذه. البرنامج متاح الآن للمستخدمين لمجموعة متنوعة من التطبيقات. على وجه التحديد ، يعد استخدام تصفية الانتشار المعززةللتماسك 46 جزءا لا يتجزأ من التجزئة الآلية وإزالة الخلفية ، ويتم تنفيذ خوارزميات مخصصة خصيصا لأتمتة اكتشاف الجسيمات وتتبعها. يمكن لهذه الاستراتيجية أن تتعامل بفعالية مع نسبة الإشارة إلى الضوضاء المنخفضة المتأصلة في البيانات الواردة في هذه الدراسة ، بالإضافة إلى تحديات أخرى ، مثل حركة مذنبات EB1-GFP عبر مستويات بؤرية مختلفة. في حين أنه ليس من الممكن اختبار أداء هذا البرنامج بشكل شامل مقابل جميع برامج تحليل الجسيمات الأخرى ، فإن أداء الإستراتيجية الحالية يساوي أو يقترب من الأداء البشري القياسي. علاوة على ذلك ، على حد علم المؤلفين ، لم يكن هناك برنامج آخر تم تدريبه بشكل خاص على البيانات في الجسم الحي من التشعبات الحسية ومحطة ما قبل المشبكي. بالنظر إلى أن أداء خوارزميات تحليل الصور غالبا ما يكون محددا للغاية للبيانات التي تم تصميمها من أجلها وأن رؤية الكمبيوتر المعممة غير ممكنة بعد ، فمن المتوقع أن يكون تدريب البرنامج الموصوف على البيانات المحددة في الجسم الحي ذات الأهمية هو النهج الأكثر صحة من الناحية الخوارزمية.
نظرا للعمل المكثف على MTs الشجيرية22،23،24،25،26،27 بالإضافة إلى الجودة المتسقة للبيانات التي يمكن الحصول عليها من هذا النظام ، تم التحقق من صحة استراتيجية الحصول على الصور وتحليل البرامج لأول مرة في ذبابة الفاكهة التشعبات الحسية. الأهم من ذلك ، وجد في التشعبات أن استخدام محركات Gal4 العصبية المختلفة ، حتى في خلفيات النوع البري المتطابقة ، يؤدي إلى اختلافات كبيرة في ديناميكيات EB1-GFP بسبب الاختلافات في الخلفية الجينية ، مما يؤكد أهمية استخدام سائق Gal4 واحد للحصول على نتائج متسقة. تم استخدام هذه الإستراتيجية بعد ذلك للتحليل متعدد العوامل لديناميكيات EB1-GFP في الطرف قبل المشبكي ل NMJ. لتوضيح القيمة الاستقصائية لهذه الطريقة بشكل أكبر ، تم استخدام استراتيجية التصوير والبرمجيات هذه لتقييم ديناميكيات EB1-GFP قبل وبعد المشبكي بعد ضربة قاضية ل dTACC ، ذبابة الفاكهة المتماثلة لعائلة TACC المحفوظة للغاية (تحويل الملف الملفوف الحمضي)47،48. أظهر العمل السابق في ذبابة الفاكهة S2 الخلايا40 ، بالإضافة إلى عمل لوري وزملاؤه في مخروط نمو Xenopus49،50،51 ، أن أفراد عائلة TACC ينظمون ديناميكيات MT plus-end. علاوة على ذلك ، أظهرت الأدلة التي تم الإبلاغ عنها مؤخرا من التصوير المناعي متحد البؤر والفائق الدقة أن dTACC هو منظم رئيسي ل MTs قبل المشبكي أثناء تكوين الخلايا العصبية52 ، مما يثير التساؤل عما إذا كان dTACC ينظم ديناميكيات MT الحية. يوضح هذا التقرير طريقة يمكنها بالفعل اكتشاف الاختلافات في سلوكيات الترجمة الآلية الحية عند ضربة قاضية dTACC. وبالتالي ، تقدم هذه الدراسة طريقة في الجسم الحي يمكنها تحديد وتوصيف المنظمين الرئيسيين لديناميكيات MT داخل الخلايا العصبية النامية بشكل فعال ، لا سيما في الحيز قبل المشبكي.
1. جيل عينات ذبابة الفاكهة
2. إعداد المعدات
3. تحضير عينات اليرقات للتصوير
4. التصوير متحد البؤر بفاصل زمني للعينات الحية
5. معالجة الصور المستندة إلى البرامج وتحليلها
تم تربية الذباب من مخزونات مستقرة تعبر بشكل أساسي عن الجينات المعدلة وراثيا UAS-EB1-GFP إما عموما للخلايا العصبية (elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP)58،59 أو في الخلايا العصبية الحسية (221-Gal4 ؛ UAS-EB1-GFP)60،61. تم اختيار EB1 لهذه الدر?...
تناقش هذه الورقة بروتوكولا لإجراء التصوير غير الجراحي داخل الحيوية لديناميكيات MT في التشعبات وفي NMJ أثناء التطور. المدخلات البشرية مطلوبة أثناء الخطوات التجريبية ، مثل اختيار للتصوير ، وقد تؤدي إلى تحيز في عملية جمع البيانات لا يمكن إزالته بشكل معقول. وبالتالي ، فإن اله...
المؤلفون Hoyin Lai و Michael Jones و Hideki Sasaki و Luciano A.G. Lucas و Sam Alworth (سابقا) و James Shih-Jong Lee هم موظفون في DRVision Technologies LLC ، التي تنتج البرامج المستخدمة في هذا البروتوكول.
نشكر زملائنا في مختبر Van Vactor وفي DRVision بالإضافة إلى الدكتورين ماكس هايمان وباسكال كايزر وديفيد بيلمان وتوماس شوارتز على المناقشة المفيدة. نشكر الدكتورة ميليسا رولز على تقديمها بسخاء elaV-Gal4. UAS-EB1-GFP; UAS-Dcr2 و 221-Gal4 ؛ أسهم UAS-EB1-GFP المستخدمة في هذه الدراسة. نشكر الدكتورتين جينيفر ووترز وآنا جوست في مركز نيكون للتصوير في جامعة هارفارد على خبرتهما في الفحص المجهري الضوئي. يتم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (F31 NS101756-03 إلى V.T.C. ، SBIR 1R43MH100780-01D إلى JSL).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 21008-959 | Sample preparation |
1000 µL TipOne pipette tips | USA Scientific | 1111-2721 | Sample preparation |
200 µL TipOne pipette tips | USA Scientific | 1120-8710 | Sample preparation |
221-Gal4 flies | Bloomington Drosophila Stock Center (US) | 26259 | Drosophila genetics/crosses |
60x Objective Lens | Nikon | Plan Apo 60x Oil | Image acquisition |
6-well plate | BD Falcon | 353224 | Sample preparation |
Agar | MoorAgar | 41084 | Drosophila food |
Aivia | DRVision LLC | Optimized as part of this study | |
Chloroform (stabilized with amylenes) | Sigma-Aldrich | C2432 | Sample preparation |
CO2 blowgun (for selection of flies for crosses) | Genesee | 54-104 | Drosophila genetics/crosses |
CO2 bubbler (for selection of flies for crosses) | Genesee | 59-180 | Drosophila genetics/crosses |
Cooled CCD camera | Hamamatsu | ORCA-R2 | Image acquisition |
Cornmeal | Genesee | 62-101 | Drosophila food |
Distilled Water | Drosophila food | ||
Double-sided tape | Scotch | Sample preparation | |
Drosophila vials | Genesee | 32-109 | Drosophila food |
Droso-plugs (foam plugs for vials) | Genesee | 59-200 | Drosophila food |
Dumont #5 Biologie Inox Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Sample preparation |
elaV-Gal4;UAS-EB1-GFP;UAS-Dcr2 flies | Gift of Melissa Rolls (Penn State University) | N/A | Drosophila genetics/crosses |
Ethanol (95%) | VWR | 75811-022 | Drosophila food |
Fiber optic illuminator/light source for stereomicroscope | Nikon | NI-150 | Sample preparation |
Flypad (for selection of flies for crosses) | Genesee | 59-172 | Drosophila genetics/crosses |
Forma Environmental Chamber/Incubator | ThermoFisher | 3940 | Drosophila genetics/crosses |
Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | Sample preparation |
Immersion Oil | Nikon | MXA22168 | Image acquisition |
Kimwipe Delicate Wipes | Fisher Scientific | 34120 | Sample preparation |
Laser Merge Module | Spectral Applied Research | LMM-5 | Image acquisition |
Light Source for Confocal | Lumencor | SOLA 54-10021 | Image acquisition |
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software | Molecular Devices | Image acquisition | |
Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2 (#1.5) | VWR | 48366-205 | Sample preparation |
Motorized inverted microscope with Perfect Focus System | Nikon | TI-ND6-PFS-S | Image acquisition |
Motorized stage and shutters | Prior | Proscan III | Image acquisition |
Multi-purpose scissors | Scotch | MMM1428 | Sample preparation |
Nail Polish | Sally Hansen | 784179032016 074170382839 | Sample preparation |
Optical Filter | Chroma | ET480/40m | Image acquisition |
P1000 Pipetman | Gilson | F123602 | Sample preparation |
P200 Pipetman | Gilson | F123601 | Sample preparation |
PBS (10X) ph 7.4 | ThermoFisher | 70011044 | Sample preparation |
Propionic Acid | Fisher | A258-500 | Drosophila food |
Spinning disk confocal scanner unit | Yokagawa | CSU-X1 | Image acquisition |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | Sample preparation |
Sugar (Sucrose) | Genesee | 62-112 | Drosophila food |
Superfrost Slide | VWR | 48311-600 | Sample preparation |
Tegosept | Genesee | 20-258 | Drosophila food |
UAS-dtacc-RNAi flies | Vienna Drosophila Resource Center (Vienna, Austria) | VDRC-101439 | Drosophila genetics/crosses |
Vaseline petroleum jelly | WB Mason | DVOCB311003 | Sample preparation |
Winsor & Newton Brush Regency Gold 520, Size 0 | Staples | 5012000 | Drosophila genetics/crosses |
Yeast | VWR | Torula Yeast IC90308580 | Drosophila food |
Yokogawa dichroic beamsplitter | Semrock | Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 | Image acquisition |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved