JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تقدم هذه الدراسة استراتيجية تصوير الخلايا العصبية داخل الحيوية غير الغازية جنبا إلى جنب مع استراتيجية برمجية جديدة لتحقيق تتبع وتحليل آلي وغير متحيز لديناميكيات الأنابيب الدقيقة في الجسم الحي (MT) في التشعبات الحسية والوصلات العصبية العضلية ذبابة الفاكهة.

Abstract

تلعب الأنابيب الدقيقة (MTs) أدوارا حاسمة في تطور الخلايا العصبية ، ولكن لا تزال هناك العديد من الأسئلة حول الآليات الجزيئية لتنظيمها ووظيفتها. علاوة على ذلك ، على الرغم من التقدم المحرز في فهم MTs ما بعد المشبكي ، لا يعرف الكثير عن مساهمات MTs قبل المشبكي في تكوين الخلايا العصبية. على وجه الخصوص ، أسفرت الدراسات التي أجريت على ديناميكيات MT في الجسم الحي في ذبابة الفاكهة عن رؤى مهمة حول السلوك على مستوى البوليمر. ومع ذلك ، فإن التحديات التقنية والتحليلية المرتبطة بالتصوير الحي للوصلة العصبية العضلية للذبابة (NMJ) قد حدت من الدراسات المماثلة لديناميكيات MT قبل المشبكي. علاوة على ذلك ، في حين أن هناك العديد من استراتيجيات البرامج عالية الفعالية للتحليل الآلي لديناميكيات MT في المختبر وخارج الجسم الحي ، فإن البيانات في الجسم الحي غالبا ما تتطلب مدخلات كبيرة من المشغل أو تحليلا يدويا بالكامل بسبب نسبة الإشارة إلى الضوضاء الرديئة بطبيعتها في الصور والتشكل الخلوي المعقد.  لمعالجة هذا الأمر ، قامت هذه الدراسة بتحسين منصة برمجية جديدة للكشف الآلي وغير المتحيز عن الجسيمات في الجسم الحي. تم إجراء تحليل متعدد العوامل للصور حية متحدة البؤر ذات الفاصل الزمني ل EB1-GFP المسمى MTs في كل من التشعبات و NMJ من يرقات ذبابة الفاكهة ووجد اختلافات مذهلة في سلوكيات MT. علاوة على ذلك ، تم تحليل ديناميكيات MT بعد الضربة القاضية للبروتين المرتبط ب MT (MAP) dACC ، وهو منظم رئيسي لتطور شببك ذبابة الفاكهة ، وحددت تغييرات ذات دلالة إحصائية في ديناميكيات MT مقارنة بالنوع البري. توضح هذه النتائج أن هذه الاستراتيجية الجديدة للتحليل الآلي متعدد المعلمات لكل من ديناميكيات MT قبل وبعد المشبكي على مستوى البوليمر تقلل بشكل كبير من معايير الإنسان في الحلقة. علاوة على ذلك ، تظهر الدراسة فائدة هذه الطريقة في اكتشاف سلوكيات MT المميزة عند dTACC-knockdown ، مما يشير إلى تطبيق مستقبلي محتمل للشاشات الوظيفية للعوامل التي تنظم ديناميكيات MT في الجسم الحي. قد تركز التطبيقات المستقبلية لهذه الطريقة أيضا على توضيح نوع الخلية و / أو سلوكيات MT الخاصة بالمقصورة ، والتصوير متعدد الألوان المترابط ل EB1-GFP مع العلامات الخلوية وتحت الخلوية الأخرى ذات الأهمية.

Introduction

تنظم الخلايا لتشكيل هياكل وظيفية من خلال تنسيق التغيرات داخل الخلايا وبينها عن طريق التشكل. من الأمثلة الرائعة على التشكل تطور البنية العصبية عالية التخصص. تظهر الخلايا العصبية استقطابا ملحوظا ، حيث تمتد إلى نوعين متميزين من العمليات هيكليا ووظيفيا ، التشعبات والمحاور1 ، والتي يمكن أن تحقق أطوال هائلة. ينشأ تعقيد تطور الخلايا العصبية ليس فقط من الحجم الهائل للتشعبات والمحاور ولكن أيضا من صعوبة تشكيل هندستها المتفرعةبشكل معقد 2،3. يحفز تكوين الخلايا العصبية وعواقبه في التعلم والذاكرة4 على التحقيق المستمر لكل من التحكم الجيني والآليات البيولوجية الأساسية للخلية. تشمل هذه الآليات ، على سبيل المثال لا الحصر ، نقل الغشاء داخل الخلايا والعديد من عمليات إعادة ترتيب الهيكل الخلوي اللازمة للتغييرات في مورفولوجيا الخلاياالعصبية 1،2،3.

أنتجت دراسات تكوين الخلايا العصبية مجموعة متنوعة من تقنيات التصور المتقدمة. تستخدم الطرق الثابتة ، مثل المجهر الإلكتروني أو المجهر الفلوري للمجسات الثابتة ، على نطاق واسع لإجراء تحليل مورفولوجي وهيكلي عالي الدقة. ومع ذلك ، إلى جانب القطع الأثرية التي لا مفر منها لأي طريقة حفظ ، لا يمكن للتصور الثابت التقاط التغييرات الديناميكية التي تدعم التشكل. وهكذا ، نشأت العديد من الأفكار المحورية من الفحص المجهري الفلوري بفاصل زمني للأنسجة الحية. استخدم العمل المبكر الذي قام به ليشتمان وزملاؤه5،6،7 في التصوير في الجسم الحي للجهاز العصبي للثدييات للتحقيق في تجديد / تنكس المحاور العصبي ، وتنظيم المكونات المشبكية ، والنقل المحوري بعيد المدى. علاوة على ذلك ، كانت الدراسات المنوية في التحويلات العصبية الأولية حاسمة لإثبات أهمية ديناميكيات الأنابيب الدقيقة (MT) للاستطالة المحورية والحركة8،9. بشكل حاسم ، أثبتت دراسات الزرع العصبي المبكرة استخدام بروتينات عائلة الارتباط النهائي (EBs) ذات العلامات الفلورية لاكتساب رؤى لا تقدر بثمن حول ديناميكيات MT plus end في تطوير الخلايا العصبية على مستوى بوليمرات MTالفردية 10. نشأت هذه الدراسات من الملاحظات التي تفيد بأن عضو عائلة EB EB1 يحدد بشكل تفضيلي إلى MT زائد نهايات11 في S. cerevisiae12 وفي الخلايا المستنبتة13. منذ ذلك الحين ، تم استخدام EB1 وبروتينات تتبع الأطراف الأخرى (+ TIPs) 14،15 على نطاق واسع في الدراسات في الجسم الحي لعدم الاستقرار الديناميكي MT16 ، بما في ذلك في سياق تطور الخلايا العصبية17.

ذبابة الفاكهة هو نموذج قوي لدراسات التصوير في الجسم الحي لديناميكيات MT أثناء تطور الخلايا العصبية بسبب الأدوات الجينية والتصوير الواسعة المتاحة لدراسات الذباب18،19 بالإضافة إلى أوجه التشابه في الهيكل والوظيفة بين ذبابة الفاكهة والخلايا العصبية الفقارية1. أجرت دراسة مبكرة رئيسية للوصلة العصبية العضلية (NMJ) ليرقات ذبابة الفاكهة تصويرا متكررا غير جراحي لعلامة غشاء فلورية من خلال بشرة شفافة للحيوانات السليمة لتوثيق التشكل الطرفي قبل المشبكي20. باستخدام طريقة مماثلة لتصوير يرقات ذبابة الفاكهة الحية بالكامل ، تم تقديم عرض أولي لتحليل الجسيمات على مستوى الجسيمات دون الخلوية للحركة العملية لشحنات المحركات في المحاور21. في الآونة الأخيرة ، ميزت الدراسات الدقيقة التي أجراها رولز وزملاؤه في التشعبات الحسية ليرقات ذبابة الفاكهةالسليمة 22،23،24،25،26،27 ديناميكيات MT الإضافية بعد المشبكي من خلال إجراء تتبع الجسيمات وتحليل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) الموسوم ب EB1. مثل هذه الدراسات في ذبابة الفاكهة22،23،24،25،26،27 والأنظمة الأخرى28،29،30،31،32 لديها فهم متقدم بشكل كبير لسلوك البوليمر الفردي ل MT بالإضافة إلى ينتهي في تشعبات الخلايا العصبيةالنامية 33.

على الرغم من الدراسات المثيرة للإعجاب في الجسم الحي لديناميكيات MT ما بعد المشبكي22،23،24،25،26،27،28،29،30،31 ، كان هناك عدد أقل بكثير من الدراسات المماثلة لديناميكيات MT قبل المشبكي في الطرف المحوري النامي. تمت دراسة ديناميكيات MT في ذبابة الفاكهة اليرقات NMJ باستخدام الفحص المجهري للبقع الفلورية (FSM) واستعادة التألق بعد التبييض الضوئي (FRAP) 34. تقوم هذه التقنيات بتقييم حركية التوبولين الإجمالية ولكن ليس سلوك نهايات MT الفردية. حتى كتابة هذه السطور ، كان هناك تحقيق واحد في MT الفردي بالإضافة إلى نهايات ذبابة الفاكهة NMJ: جمعت هذه الدراسة بين التصوير الحي بفاصل زمني مع التحليل اليدوي للتصوير الاحترامي لتوصيف مجموعة من EB1-GFP الديناميكية المسماة "MTs الرائدة" والتي بدت متميزة عن مجموعة أوسع من MTs35 المستقرة. قد يرجع هذا النقص في البحث حول ديناميكيات MT قبل المشبكي جزئيا على الأقل إلى علم التشريح: في حين أنه من السهل نسبيا الحصول على صور للتشعبات نظرا لقربها من بشرة اليرقات ، فإن NMJs تعيقها الأنسجة الأخرى ، مما يجعل من الصعب الحصول على صور ذات نسبة إشارة إلى ضوضاء كافية لتحليل مستوى الجسيمات. ومع ذلك ، نظرا للأهمية الراسخة ل MTs قبل المشبكي للتشكل المشبكي والاستقرار36 ، بالإضافة إلى روابطها بالاضطرابات النمائية العصبية والتنكسيةالعصبية 37 ، فإن سد هذه الفجوة بين فهم MTs قبل وبعد المشبكي من المرجح أن يؤدي إلى رؤى لا تقدر بثمن.

التحدي الإضافي لتحليل ديناميكيات MT في الجسم الحي بشكل عام ، على عكس التحليل في المختبر أو خارج الجسم الحي ، هو أدوات البرامج الآلية المحدودة التي يمكنها استخراج معلمات الديناميكيات من البيانات في الجسم الحي. في الوقت الحاضر ، واحدة من أكثر التقنيات شيوعا وقوة لتحليل نهايات MT plus المسماة + TIP هي plusTipTracker38،39 ، وهو برنامج قائم على MATLAB يسمح بالتتبع الآلي وتحليل معلمات الديناميكيات المتعددة. والجدير بالذكر أن plusTipTracker لا يقيس نمو MT فحسب ، بل يقيس أيضا الانكماش والإنقاذ: في حين أن ملصقات + TIP مثل EB1-GFP ترتبط فقط بالنهايات الإيجابية المتزايدة ، يمكن ل PlusTipTracker استنتاج معدلات الانكماش وأحداث الإنقاذ خوارزميا. ومع ذلك ، في حين أن plusTripTracker قد تم تطبيقه بنجاح كبير في العديد من السياقات ، بما في ذلك التحليل متعدد العوامل السابق لديناميكيات MT ex vivo في ذبابة الفاكهة S2 الخلايا40 ، فإن plusTipTracker ليس مثاليا لتحليل البيانات في الجسم الحي نظرا لانخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء. نتيجة لذلك ، اعتمدت الدراسات في الجسم الحي لديناميكيات النهاية الزائدة في التشعبات22،23،24،25،26،27 وفي NMJ35 من ذبابة الفاكهة على التوليد اليدوي وتحليل الخطوط الحرفية باستخدام برامج مثل ImageJ41 ، أو على الاستراتيجيات شبه الآلية التي تتضمن العديد من مكونات الإنسان في الحلقة.

تقدم هذه الدراسة سير عمل تجريبي وتحليلي يقلل من النفقات العامة التجريبية والتحليلية المطلوبة لإجراء تحليل غير جراحي على مستوى البوليمر لديناميكيات MT قبل المشبكية في كل من التشعبات الحسية والطرف المحوري الحركي ليرقات ذبابة الفاكهة الطور الثالث. يستخدم البروتوكول يرقات سليمة وثابتة وبالتالي يتجنب الإصابات المعروفة بأنها تؤدي إلى استجابات الإجهاد بالإضافة إلى الظروف غير الفسيولوجية الأخرى التي قد تزعج ديناميكيات MT في الجسم الحي. لتسمية نهايات MT الديناميكية الزائدة ، يتم التعبير عن EB1-GFP عموديا باستخدام نظام Gal4 / UAS 42 ، مما يسمح بتصور MTs في كل من التشعبات و NMJ بسائق واحد. في حين أن بعض الخطوات المبكرة تخضع حتما لاتخاذ القرارات البشرية ، مثل اختيار عينات وتحديد المناطق للتصوير ، فإن الخطوات التي تلي الحصول على البيانات مؤتمتة إلى حد كبير. بشكل حاسم ، أتاح تحسين البرنامج الجديد تحليلا آليا وغير متحيز يتطلب الحد الأدنى من المدخلات البشرية. في حين أن طرق تتبع الجسيمات الأخرى متاحة43،44،45 ، تستخدم هذه الدراسة برنامجا احتكاريا لأنه كان مناسبا تماما من الناحية الخوارزمية لمواجهة التحديات الخاصة لمجموعة البيانات المعينة هذه. البرنامج متاح الآن للمستخدمين لمجموعة متنوعة من التطبيقات. على وجه التحديد ، يعد استخدام تصفية الانتشار المعززةللتماسك 46 جزءا لا يتجزأ من التجزئة الآلية وإزالة الخلفية ، ويتم تنفيذ خوارزميات مخصصة خصيصا لأتمتة اكتشاف الجسيمات وتتبعها. يمكن لهذه الاستراتيجية أن تتعامل بفعالية مع نسبة الإشارة إلى الضوضاء المنخفضة المتأصلة في البيانات الواردة في هذه الدراسة ، بالإضافة إلى تحديات أخرى ، مثل حركة مذنبات EB1-GFP عبر مستويات بؤرية مختلفة. في حين أنه ليس من الممكن اختبار أداء هذا البرنامج بشكل شامل مقابل جميع برامج تحليل الجسيمات الأخرى ، فإن أداء الإستراتيجية الحالية يساوي أو يقترب من الأداء البشري القياسي. علاوة على ذلك ، على حد علم المؤلفين ، لم يكن هناك برنامج آخر تم تدريبه بشكل خاص على البيانات في الجسم الحي من التشعبات الحسية ومحطة ما قبل المشبكي. بالنظر إلى أن أداء خوارزميات تحليل الصور غالبا ما يكون محددا للغاية للبيانات التي تم تصميمها من أجلها وأن رؤية الكمبيوتر المعممة غير ممكنة بعد ، فمن المتوقع أن يكون تدريب البرنامج الموصوف على البيانات المحددة في الجسم الحي ذات الأهمية هو النهج الأكثر صحة من الناحية الخوارزمية.

نظرا للعمل المكثف على MTs الشجيرية22،23،24،25،26،27 بالإضافة إلى الجودة المتسقة للبيانات التي يمكن الحصول عليها من هذا النظام ، تم التحقق من صحة استراتيجية الحصول على الصور وتحليل البرامج لأول مرة في ذبابة الفاكهة التشعبات الحسية. الأهم من ذلك ، وجد في التشعبات أن استخدام محركات Gal4 العصبية المختلفة ، حتى في خلفيات النوع البري المتطابقة ، يؤدي إلى اختلافات كبيرة في ديناميكيات EB1-GFP بسبب الاختلافات في الخلفية الجينية ، مما يؤكد أهمية استخدام سائق Gal4 واحد للحصول على نتائج متسقة. تم استخدام هذه الإستراتيجية بعد ذلك للتحليل متعدد العوامل لديناميكيات EB1-GFP في الطرف قبل المشبكي ل NMJ. لتوضيح القيمة الاستقصائية لهذه الطريقة بشكل أكبر ، تم استخدام استراتيجية التصوير والبرمجيات هذه لتقييم ديناميكيات EB1-GFP قبل وبعد المشبكي بعد ضربة قاضية ل dTACC ، ذبابة الفاكهة المتماثلة لعائلة TACC المحفوظة للغاية (تحويل الملف الملفوف الحمضي)47،48. أظهر العمل السابق في ذبابة الفاكهة S2 الخلايا40 ، بالإضافة إلى عمل لوري وزملاؤه في مخروط نمو Xenopus49،50،51 ، أن أفراد عائلة TACC ينظمون ديناميكيات MT plus-end. علاوة على ذلك ، أظهرت الأدلة التي تم الإبلاغ عنها مؤخرا من التصوير المناعي متحد البؤر والفائق الدقة أن dTACC هو منظم رئيسي ل MTs قبل المشبكي أثناء تكوين الخلايا العصبية52 ، مما يثير التساؤل عما إذا كان dTACC ينظم ديناميكيات MT الحية. يوضح هذا التقرير طريقة يمكنها بالفعل اكتشاف الاختلافات في سلوكيات الترجمة الآلية الحية عند ضربة قاضية dTACC. وبالتالي ، تقدم هذه الدراسة طريقة في الجسم الحي يمكنها تحديد وتوصيف المنظمين الرئيسيين لديناميكيات MT داخل الخلايا العصبية النامية بشكل فعال ، لا سيما في الحيز قبل المشبكي.

Protocol

1. جيل عينات ذبابة الفاكهة

  1. حدد علامة MT بالإضافة إلى النهاية. استخدمت هذه الدراسة EB1 الموسومة ب GFP ، وهي علامة طرفية عالية المميزة مع إشارة قوية وواضحة11،12. تشمل البدائل +TIPs أخرى مثل EB310،13 و CLASP / Orbit53 و CLIP-17054.
  2. الحصول على الذباب أو إنجازه باستخدام علامة MT تحت سيطرة مروج UAS (على سبيل المثال ، UAS-EB1-GFP).
  3. اختر برنامج تشغيل Gal4 المناسب الخاص بالأنسجة. استخدمت هذه الدراسة المحرك العمومي للخلايا العصبية elaV-Gal458،59 لدفع التعبير في كل من التشعبات الحسية وفي NMJ و 221-Gal460،61 للتعبير الخاص بالتغصنات.
  4. رفع الذباب باستخدام تقنيات تربية الذبابالقياسية 55،56. يوصى بحفظ الذباب في حاضنات رطبة عند 25 درجة مئوية للحصول على التعبير الأمثل Gal4 / UAS .
  5. باستخدام التقنيات الوراثية القياسية للذباب55،56 ، قم بإجراء التهجين لتوليد الذباب للتعبير عن علامة MT plus end في الخلايا / الأنسجة المرغوبة.
    ملاحظة: بالنسبة لأي مجموعة من برامج تشغيل Gal4 و -transgene ، يجب أن يتضمن التصميم التجريبي تجارب إثبات المفهوم والتحقق من الصحة لتوصيف النظام وتجنب القطع الأثرية من الإفراط في التعبير.

2. إعداد المعدات

  1. قم بإعداد محطة عمل ، بما في ذلك الذباب ، وكواشف التخدير ، ومواد بناء الشرائح ، والمجهر المجسم ، ومصدر الإضاءة ، بالقرب من المجهر متحد البؤر (أي في نفس الغرفة) لتقليل الوقت المستغرق بين تحضير العينة والتصوير لإطالة صحة اليرقات وقدرتها على البقاء.
  2. تحضير المخدر عن طريق خلط خليط الكلوروفورم بنسبة 9٪ (0.1 مل من الكلوروفورم و 1.0 مل من زيت الهالوكربون) في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. لتجنب الانفصال ، اخلطي جيدا عن طريق قلب الأنبوب قبل تحضير كل شريحة جديدة.
  3. تحضير الشريحة الزجاجية: قم بقص أربعة شرائط من الشريط على الوجهين (بعرض ~ 15 مم). اصطف قطعتين من القطع على الشريحة الزجاجية ، مع ترك مسافة ~ 5 مم بين الشرائط. ضع طبقة من القطعتين المتبقيتين فوق الأوليين لمضاعفة سمك الشريط (الشكل 1 ج).
  4. أضف قطرة كبيرة (~ 100 ميكرولتر) من خليط الكلوروفورم / الزيت على الشريحة الزجاجية في المسافة 5 مم بين قطع الشريط (الشكل 1 ج).

3. تحضير عينات اليرقات للتصوير

  1. املأ وعاءا (على سبيل المثال ، لوح 6 آبار) ب 1x PBS.
  2. اجمع يرقات الطور 3 من قارورة الذباب باستخدام ملقط أو أداة مماثلة. حدد اليرقات في المرحلة المناسبة من خلال سلوكها الزاحف ووجود 9-12 خطافا بارزا ومسننا للفم. استخدم مجهريا مجسمة للمساعدة في تحديد مراحل اليرقات (الشكل 1 د).
  3. ضع يرقة في PBS وحركها برفق لغسل أي بقايا طعام أو حطام آخر. جفف اليرقة برفق على نسيج رقيق.
  4. قم بتخدير اليرقة عن طريق وضعها في قطرة الكلوروفورم / الزيت على الشريحة من القسم 2 (الشكل 1 ج).
    ملاحظة: الاتجاه الظهري / البطني لليرقة ليس أمرا بالغ الأهمية لأنه يمكن اكتشاف كل من الخلايا العصبية الحسية والحركية من خلال البشرة الشفافة عن طريق ضبط مرحلة المجهر على المستوى البؤري المناسب ، بغض النظر عن اتجاه العينة.
  5. ضع غطاء # 1.5 في الأعلى. قم بلصق الغطاء على الشريط عن طريق الضغط اللطيف ، وبالتالي شل حركة اليرقة دون إتلافها (الشكل 1 ج).
  6. أغلق الغرفة بالفازلين أو طلاء الأظافر.

4. التصوير متحد البؤر بفاصل زمني للعينات الحية

  1. قم بإعداد المجهر متحد البؤر والعدسة الموضوعية 60x مع الغمر بالزيت. ضع العينة على المسرح (الشكل 1 أ ، ب).
  2. استخدم برنامج الاستحواذ لتكوين التجارب.
    ملاحظة: بالنسبة لهذه الدراسة ، تم الحصول على كل سلسلة تصوير في مستوى بؤري واحد بدلا من مكدس z.
    1. اضبط مدة اللقطات المتتابعة على 30 ثانية بفاصل زمني قدره 2 ثانية، ليصبح المجموع 16 إطارا.
    2. اضبط التعرض لليزر وشدته لضمان إشارة كافية مع تجنب التشبع والتبييض الضوئي.
    3. بالنسبة للتصوير EB1-GFP ، تم ضبط ليزر 488 نانومتر على وقت تعرض يبلغ 100 مللي ثانية وشدة 30٪. قد تختلف هذه القيم باختلاف استخدامات هذا البروتوكول ويجب تعديلها تجريبيا.
  3. استخدم عدسات المجهر للعثور على اليرقة في إضاءة خضراء عريضة المدى. ابحث عن التشعبات أو NMJs عن طريق ضبط المرحلة ببطء. لا تعرض اليرقة للإضاءة (واسعة النطاق أو كونفوكال) لفترة أطول من اللازم.
    1. تظهر التشعبات على شكل شبكات رقيقة من الأعصاب ذات اللون الأخضر الفاتح يمكن تمييزها بسهولة عن حزم المحاور العصبية الطويلة السميكة (الشكل 1 ه).
    2. تظهر NMJs كمجموعات من العروات الفردية ذات اللون الأخضر الفاتح ، يبلغ قطرها حوالي 5 ميكرومتر ، في نهايات حزم محورية طويلة سميكة تتباعد عن الحبل العصبي (الشكل 1F).
  4. باستخدام موجز الكاميرا المباشر، ركز بسرعة على المنطقة التي تهمك باستخدام إضاءة 488 نانومتر. توقف عن الإضاءة على الفور بمجرد العثور على التركيز المناسب لتجنب السمية الضوئية.
  5. بدء الحصول على الصور. يمكن التعرف على مذنبات EB1 على أنها نقاط مشرقة ومتحركة.
  6. راجع البروتوكولات المنشورة مسبقا للحصول على تفاصيل وإرشادات إضافية حول التصوير المباشر الفلوري57.

5. معالجة الصور المستندة إلى البرامج وتحليلها

  1. قم بتحليل كل ملف فيديو على حدة. داخل البرنامج (واجهة المستخدم الموضحة في الشكل 2)، حدد ملف | استيراد | تسلسل الصورة واسحب ملفات TIF في المربع الذي يظهر. معاينة الفيديو.
  2. ضمن قائمة معلمات الكشف ، اضبط معلمات البرنامج لضمان اكتشاف النقاط المرئية بوضوح فقط وتجنب اكتشاف الكائنات الزائفة. على سبيل المثال ، يؤدي تقليل شدة الجسيمات إلى زيادة حساسية البرامج للنقاط ولكنه يزيد من الإيجابيات الخاطئة المحتملة. ستختلف القيم الدقيقة للمعلمات تجريبيا. تتوفر أوصاف معلمات الكشف والتتبع من المؤلفين عند الطلب.
  3. قم بتطبيق وصفة تتبع جسيمات الخلايا العصبية لتحليل الصورة باستخدام الزر من البداية (السهم الأزرق ، الشكل 2 ب). سيقوم البرنامج بإخراج نتائج معلمات التتبع المدرجة في الجدول 1 إلى جدول بيانات النتائج (المربع الأخضر ، الشكل 2 ب). لسهولة التحليل والتفسير اللاحق ، يمكن تخزين النتائج في برنامج جداول البيانات باستخدام وظيفة التصدير الموجودة في قسم جدول بيانات النتائج .
  4. انتقل إلى المؤشر إلى النقطة التي تم اكتشافها في الخطوة السابقة وانقر بزر الماوس الأيسر للتحديد أو إلغاء التحديد. يمكن تحديد نقاط متعددة في وقت واحد باستخدام Ctrl + النقر بزر الماوس الأيسر.
    ملاحظة: اعتمادا على أهداف المشروع وتطبيقاته ، يمكن استخدام استدلالات إضافية لتصفية النقطة. على سبيل المثال ، قد يتم حذف نقاط النقاط التي يقل عمرها عن 8-10 ثوان (4-5 إطارات) لأنها لا تقدم معلومات كافية حول حدث النمو بأكمله. ستختلف الحاجة إلى مثل هذه الاستدلالات تجريبيا. تتوفر تفاصيل إضافية حول وظائف البرنامج من المؤلفين عند الطلب.

النتائج

تم تربية الذباب من مخزونات مستقرة تعبر بشكل أساسي عن الجينات المعدلة وراثيا UAS-EB1-GFP إما عموما للخلايا العصبية (elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP)58،59 أو في الخلايا العصبية الحسية (221-Gal4 ؛ UAS-EB1-GFP)60،61. تم اختيار EB1 لهذه الدر?...

Discussion

تناقش هذه الورقة بروتوكولا لإجراء التصوير غير الجراحي داخل الحيوية لديناميكيات MT في التشعبات وفي NMJ أثناء التطور. المدخلات البشرية مطلوبة أثناء الخطوات التجريبية ، مثل اختيار للتصوير ، وقد تؤدي إلى تحيز في عملية جمع البيانات لا يمكن إزالته بشكل معقول. وبالتالي ، فإن اله...

Disclosures

المؤلفون Hoyin Lai و Michael Jones و Hideki Sasaki و Luciano A.G. Lucas و Sam Alworth (سابقا) و James Shih-Jong Lee هم موظفون في DRVision Technologies LLC ، التي تنتج البرامج المستخدمة في هذا البروتوكول.

Acknowledgements

نشكر زملائنا في مختبر Van Vactor وفي DRVision بالإضافة إلى الدكتورين ماكس هايمان وباسكال كايزر وديفيد بيلمان وتوماس شوارتز على المناقشة المفيدة. نشكر الدكتورة ميليسا رولز على تقديمها بسخاء elaV-Gal4. UAS-EB1-GFP; UAS-Dcr2 و 221-Gal4 ؛ أسهم UAS-EB1-GFP المستخدمة في هذه الدراسة. نشكر الدكتورتين جينيفر ووترز وآنا جوست في مركز نيكون للتصوير في جامعة هارفارد على خبرتهما في الفحص المجهري الضوئي. يتم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (F31 NS101756-03 إلى V.T.C. ، SBIR 1R43MH100780-01D إلى JSL).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubeEppendorf21008-959Sample preparation
1000 µL TipOne pipette tipsUSA Scientific1111-2721Sample preparation
200 µL TipOne pipette tipsUSA Scientific1120-8710Sample preparation
221-Gal4 fliesBloomington Drosophila Stock Center (US)26259Drosophila genetics/crosses
60x Objective LensNikonPlan Apo 60x OilImage acquisition
6-well plateBD Falcon353224Sample preparation
AgarMoorAgar41084Drosophila food
AiviaDRVision LLCOptimized as part of this study
Chloroform (stabilized with amylenes)Sigma-AldrichC2432Sample preparation
CO2 blowgun (for selection of flies for crosses)Genesee54-104Drosophila genetics/crosses
CO2 bubbler (for selection of flies for crosses)Genesee59-180Drosophila genetics/crosses
Cooled CCD cameraHamamatsuORCA-R2Image acquisition
CornmealGenesee62-101Drosophila food
Distilled WaterDrosophila food
Double-sided tapeScotchSample preparation
Drosophila vialsGenesee32-109Drosophila food
Droso-plugs (foam plugs for vials)Genesee59-200Drosophila food
Dumont #5 Biologie Inox ForcepsFine Science Tools11252-20Sample preparation
elaV-Gal4;UAS-EB1-GFP;UAS-Dcr2 fliesGift of Melissa Rolls (Penn State University)N/ADrosophila genetics/crosses
Ethanol (95%)VWR75811-022Drosophila food
Fiber optic illuminator/light source for stereomicroscopeNikonNI-150Sample preparation
Flypad (for selection of flies for crosses)Genesee59-172Drosophila genetics/crosses
Forma Environmental Chamber/IncubatorThermoFisher3940Drosophila genetics/crosses
Halocarbon oil 700Sigma-AldrichH8898Sample preparation
Immersion OilNikonMXA22168Image acquisition
Kimwipe Delicate WipesFisher Scientific34120Sample preparation
Laser Merge ModuleSpectral Applied ResearchLMM-5Image acquisition
Light Source for ConfocalLumencorSOLA 54-10021Image acquisition
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis SoftwareMolecular DevicesImage acquisition
Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2 (#1.5)VWR48366-205Sample preparation
Motorized inverted microscope with Perfect Focus SystemNikonTI-ND6-PFS-SImage acquisition
Motorized stage and shuttersPriorProscan IIIImage acquisition
Multi-purpose scissorsScotchMMM1428Sample preparation
Nail PolishSally Hansen784179032016 074170382839Sample preparation
Optical FilterChromaET480/40mImage acquisition
P1000 PipetmanGilsonF123602Sample preparation
P200 PipetmanGilsonF123601Sample preparation
PBS (10X) ph 7.4ThermoFisher70011044Sample preparation
Propionic AcidFisherA258-500Drosophila food
Spinning disk confocal scanner unitYokagawaCSU-X1Image acquisition
StereomicroscopeNikonSMZ800NSample preparation
Sugar (Sucrose)Genesee62-112Drosophila food
Superfrost SlideVWR48311-600Sample preparation
TegoseptGenesee20-258Drosophila food
UAS-dtacc-RNAi fliesVienna Drosophila Resource Center (Vienna, Austria)VDRC-101439Drosophila genetics/crosses
Vaseline petroleum jellyWB MasonDVOCB311003Sample preparation
Winsor & Newton Brush Regency Gold 520, Size 0Staples5012000Drosophila genetics/crosses
YeastVWRTorula Yeast IC90308580Drosophila food
Yokogawa dichroic beamsplitterSemrockDi01-T405/488/568/647-13x15x0.5Image acquisition

References

  1. Rolls, M. M. Neuronal polarity in Drosophila: Sorting out axons and dendrites. Developmental Neurobiology. 71 (6), 419-429 (2011).
  2. Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: Mechanisms of dendritic arborization. Nature Reviews Neuroscience. 11 (5), 316-328 (2010).
  3. Lewis, T. L., Courchet, J., Polleux, F. Cell biology in neuroscience: Cellular and molecular mechanisms underlying axon formation, growth, and branching. Journal of Cell Biology. 202 (6), 837-848 (2013).
  4. Kandel, E. R. The Molecular Biology of Memory Storage: A Dialogue Between Genes and Synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
  5. Turney, S. G., Lichtman, J. W. Chapter 11: Imaging Fluorescent Mice In Vivo Using Confocal Microscopy. Methods in Cell Biology. 89 (8), 309-327 (2008).
  6. McCann, C. M., Lichtman, J. W. In vivo imaging of presynaptic terminals and postsynaptic sites in the mouse submandibular ganglion. Developmental Neurobiology. 68 (6), 760-770 (2008).
  7. Turney, S. G., Walsh, M. K., Lichtman, J. W. In vivo imaging of the developing neuromuscular junction in neonatal mice. Cold Spring Harbor Protocols. 7 (11), 1166-1176 (2012).
  8. Tanaka, E., Ho, T., Kirschner, M. W. The role of microtubule dynamics in growth cone motility and axonal growth. Journal of Cell Biology. 128 (1-2), 139-155 (1995).
  9. Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. Journal of Cell Biology. 115 (2), 345-363 (1991).
  10. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  11. Tirnauer, J. S., Bierer, B. E. EB1 proteins regulate microtubule dynamics, cell polarity, and chromosome stability. Journal of Cell Biology. 149 (4), 761-766 (2000).
  12. Schwartz, K., Richards, K., Botstein, D. BIM1 encodes a microtubule-binding protein in yeast. Molecular Biology of the Cell. 8 (12), 2677-2691 (1997).
  13. Juwana, J. P., et al. EB/RP gene family encodes tubulin binding proteins. International Journal of Cancer. 81 (2), 275-284 (1999).
  14. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (4), 309-322 (2008).
  15. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: Two ends in the limelight. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (12), 711-726 (2015).
  16. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic Instability of microtubule growth. Nature. 312 (15), 237-242 (1984).
  17. Van De Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A. Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).
  18. Rebollo, E., Karkali, K., Mangione, F., Martín-Blanco, E. Live imaging in Drosophila: The optical and genetic toolkits. Methods. 68 (1), 48-59 (2014).
  19. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nature Reviews Genetics. 6 (1), 9-23 (2005).
  20. Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila. Neuron. 22 (4), 719-729 (1999).
  21. Miller, K. E., et al. Direct observation demonstrates that Liprin-alpha is required for trafficking of synaptic vesicles. Current Biology. 15 (7), 684-689 (2005).
  22. Rao, K., et al. Spastin, atlastin, and ER relocalization are involved in axon but not dendrite regeneration. Molecular Biology of the Cell. 27 (21), 3245-3256 (2016).
  23. Hill, S. E., et al. Development of dendrite polarity in Drosophila neurons. Neural Development. 7, 34 (2012).
  24. Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite. Molecular Biology of the Cell. 21 (5), 767-777 (2010).
  25. Mattie, F. J., et al. Directed microtubule growth, +TIPs, and kinesin-2 are required for uniform microtubule polarity in dendrites. Current Biology. 20 (24), 2169-2177 (2010).
  26. Stone, M. C., Roegiers, F., Rolls, M. M. Microtubules Have Opposite Orientation in Axons and Dendrites of Drosophila Neurons. Molecular Biology of the Cell. 19 (10), 4122-4129 (2008).
  27. Rolls, M. M., et al. Polarity and intracellular compartmentalization of Drosophila neurons. Neural Development. 2, 7 (2007).
  28. Hu, X., Viesselmann, C., Nam, S., Merriam, E., Dent, E. W. Activity-dependent dynamic microtubule invasion of dendritic spines. Journal of Neuroscience. 28 (49), 13094-13105 (2008).
  29. Merriam, E. B., et al. Dynamic microtubules promote synaptic NMDA receptor-dependent spine enlargement. PLoS One. 6 (11), 27688 (2011).
  30. Hu, X., et al. BDNF-induced increase of PSD-95 in dendritic spines requires dynamic microtubule invasions. Journal of Neuroscience. 31 (43), 15597-15603 (2011).
  31. Merriam, E. B., et al. Synaptic regulation of microtubule dynamics in dendritic spines by calcium, F-actin, and drebrin. Journal of Neuroscience. 33 (42), 16471-16482 (2013).
  32. Jaworski, J., et al. Dynamic Microtubules Regulate Dendritic Spine Morphology and Synaptic Plasticity. Neuron. 61 (1), 85-100 (2009).
  33. Dent, E. W. Of microtubules and memory: Implications for microtubule dynamics in dendrites and spines. Molecular Biology of the Cell. 28 (1), 1-8 (2017).
  34. Yan, Y., Broadie, K. In vivo assay of presynaptic microtubule cytoskeleton dynamics in Drosophila. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 198-205 (2007).
  35. Pawson, C., Eaton, B. A., Davis, G. W. Formin-dependent synaptic growth: evidence that Dlar signals via Diaphanous to modulate synaptic actin and dynamic pioneer microtubules. Journal of Neuroscience. 28 (44), 11111-11123 (2008).
  36. Ruiz-Cañada, C., Budnik, V. Synaptic cytoskeleton at the neuromuscular junction. International Review of Neurobiology. 75 (6), 217-236 (2006).
  37. Bodaleo, F. J., Gonzalez-Billault, C. The presynaptic microtubule cytoskeleton in physiological and pathological conditions: lessons from Drosophila Fragile X syndrome and hereditary spastic paraplegias. Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 60 (2016).
  38. Applegate, K. T., et al. PlusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).
  39. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nature Methods. 7 (9), 761-768 (2010).
  40. Long, J. B., et al. Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics. Molecular and Cellular Biology. 33 (8), 1528-1545 (2013).
  41. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  42. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  43. Ma, Y., Wang, X., Liu, H., Wei, L., Xiao, L. Recent advances in optical microscopic methods for single-particle tracking in biological samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (19), 4445-4463 (2019).
  44. Shen, H., et al. Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications. Chemical Reviews. 117 (11), 7331-7376 (2017).
  45. Zwetsloot, A. J., Tut, G., Straube, A. Measuring microtubule dynamics. Essays in Biochemistry. 62 (6), 725-735 (2018).
  46. Weickert, J. Coherence-Enhancing Diffusion Filtering. International Journal of Computer Vision. 31 (2-3), 111-127 (1999).
  47. Peset, I., Vernos, I. The TACC proteins: TACC-ling microtubule dynamics and centrosome function. Trends in Cell Biology. 18 (8), 379-388 (2008).
  48. Hood, F. E., Royle, S. J. Pulling it together. Bioarchitecture. 1 (3), 105-109 (2011).
  49. Lucaj, C. M., et al. Xenopus TACC1 is a microtubule plus-end tracking protein that can regulate microtubule dynamics during embryonic development. Cytoskeleton. 72 (5), 225-234 (2015).
  50. Nwagbara, B. U., et al. TACC3 is a microtubule plus end-tracking protein that promotes axon elongation and also regulates microtubule plus end dynamics in multiple embryonic cell types. Molecular Biology of the Cell. 25 (21), 3350-3362 (2014).
  51. Rutherford, E. L., et al. Xenopus TACC2 is a microtubule plus end-tracking protein that can promote microtubule polymerization during embryonic development. Molecular Biology of the Cell. 27 (20), 3013-3020 (2016).
  52. Chou, V. T., Johnson, S., Long, J., Vounatsos, M. dTACC restricts bouton addition and regulates microtubule organization at the Drosophila neuromuscular junction. Cytoskeleton. 77 (1-2), 4-15 (2019).
  53. Maiato, H., et al. Human CLASP1 Is an Outer Kinetochore Component that Regulates Spindle Microtubule Dynamics. Cell. 113 (7), 891-904 (2003).
  54. Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. Life cycle of MTs persistent growth in the cell interior , asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary. Journal of Cell Science. 115, 3527-3539 (2002).
  55. Greenspan, R. J. . Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. , (2004).
  56. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: A primer on the drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
  57. Waters, J. C. Live-cell fluorescence imaging. Methods in Cell Biology. 114, 125-150 (2007).
  58. Berger, C., Renner, S., Lüer, K., Technau, G. M. The commonly used marker ELAV is transiently expressed in neuroblasts and glial cells in the Drosophila embryonic CNS. Developmental Dynamics. 236 (12), 3562-3568 (2007).
  59. Robinow, S., White, K. Characterization and spatial distribution of the ELAV protein during Drosophila melanogaster development. Journal of Neurobiology. 22 (5), 443-461 (1991).
  60. Parrish, J. Z., Kim, M. D., Lily, Y. J., Yuh, N. J. Genome-wide analyses identify transcription factors required for proper morphogenesis of Drosophila sensory neuron dendrites. Genes and Development. 20 (7), 820-835 (2006).
  61. Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons. Cell. 112 (6), 805-818 (2003).
  62. Zhang, T., et al. Microtubule plus-end binding protein EB1 is necessary for muscle cell differentiation, elongation and fusion. Journal of Cell Science. 122 (9), 1401-1409 (2009).
  63. Yang, C., et al. EB1 and EB3 regulate microtubule minus end organization and Golgi morphology. Journal of Cell Biology. 216 (10), 3179-3198 (2017).
  64. Allison, A., Nunn, J. Effect of general anaesthetics on microtubules. Lancet. 292 (7582), 1326-1329 (1968).
  65. Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, drosophila and zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (67), e3780 (2012).
  66. Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments. (84), e50998 (2014).
  67. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible neurotechnique cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (5), 451-461 (1999).
  68. Resh, M. D. Fatty acylation of proteins: New insights into membrane targeting of myristoylated and palmitoylated proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1451 (1), 1-16 (1999).
  69. Edwards, K. A., Demsky, M., Montague, R. A., Weymouth, N., Kiehart, D. P. GFP-moesin illuminates actin cytoskeleton dynamics in living tissue and demonstrates cell shape changes during morphogenesis in Drosophila. Developmental Biology. 191 (1), 103-117 (1997).
  70. Riedl, J., et al. Lifeact a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  71. Dent, E. W., Kalil, K. Axon Branching Requires Interactions between Dynamic Microtubules and Actin Filaments. Journal of Neuroscience. 21 (24), 9757-9769 (2001).
  72. Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones. Journal of Cell Biology. 158 (1), 139-152 (2002).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

EB1 GFP MT DTACC Knockdown

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved