用于果蝇树突和神经肌肉接头突触微管动力学的无创体内分析的 3D 粒子跟踪

摘要

本研究提出了一种无创活体神经元成像策略与一种新的软件策略相结合，以实现对果蝇感觉树突和神经肌肉接头中体内微管 （MT） 正末端动力学的自动化、无偏倚跟踪和分析。

摘要

微管 （MT） 在神经元发育中起着关键作用，但关于其调节和功能的分子机制仍然存在许多问题。此外，尽管在理解突触后 MT 方面取得了进展，但对突触前 MT 对神经元形态发生的贡献知之甚少。特别是，对果蝇感觉树突中体内 MT 动力学的研究对聚合物水平行为产生了重要的见解。然而，与苍蝇神经肌肉接头 （NMJ） 实时成像相关的技术和分析挑战限制了突触前 MT 动力学的可比研究。此外，虽然有许多高效的软件策略可用于体外和离体 MT 动力学的自动分析，但由于图像中的信噪比和复杂的细胞形态本身就较差，体内数据通常需要大量的作员输入或完全手动分析。 为了解决这个问题，本研究优化了一个新的软件平台，用于自动和无偏倚的体内颗粒检测。在果蝇幼虫的树突和 NMJ 中对 EB1-GFP 标记的 MTs 的实时延时共聚焦图像进行了多参数分析，发现 MT 行为存在显着差异。在敲低 MT 相关蛋白 （MAP） dTACC（果蝇突触发育的关键调节因子）后，进一步分析了 MT 动力学，并确定了与野生型相比 MT 动力学的统计学显着变化。这些结果表明，这种在聚合物水平上对突触前和突触后 MT 动力学进行自动多参数分析的新策略显着降低了人在环标准。该研究进一步显示了该方法在 dTACC 敲除后检测不同 MT 行为方面的效用，表明未来可能应用于体内调节 MT 动力学的因子的功能筛选。该方法的未来应用可能还侧重于阐明细胞类型和/或区室特异性 MT 行为，以及 EB1-GFP 与其他感兴趣的细胞和亚细胞标志物的多色相关成像。

引言

细胞通过形态发生协调细胞内和细胞间的变化而组织起来形成功能结构。形态发生的一个显着例子是高度专业化的神经元结构的发育。神经元表现出显着的极化，其中它们延伸了两种结构和功能上不同的过程，即树突和轴突¹，可以达到巨大的长度。神经元发育的复杂性不仅源于树突和轴突的庞大尺寸，还源于难以形成它们错综复杂的分支几何形状 ^2,3。神经元形态发生及其对学习和记忆的影响⁴ 促使对其遗传控制和潜在细胞生物学机制的持续研究。这些机制包括但不限于细胞内膜转运和神经元形态变化所需的许多细胞骨架重排 ^1,2,3。

对神经元形态发生的研究产生了各种先进的可视化技术。静态方法，如固定探针的电子显微镜或荧光显微镜，被广泛用于进行高分辨率的形态和结构分析。然而，除了任何保存方法都不可避免的伪影之外，静态可视化无法捕捉支撑形态发生的动态变化。因此，许多关键见解源于活组织的延时荧光显微镜检查。Lichtman 及其同事 ^5,6,7 的早期工作利用哺乳动物神经系统的体内成像来研究轴突再生/变性、突触成分的组织和远程轴突运输。此外，对原代神经元外植体的开创性研究对于确定微管 （MT） 动力学对轴突伸长和运动的重要性至关重要 ^8,9。至关重要的是，早期神经元外植体研究确定了荧光标记的末端结合家族蛋白 （EB） 的使用，以获得对单个 MT 聚合物水平上发育神经元的 MT 加末端动力学的宝贵见解¹⁰。这些研究源于对 EB 家族成员 EB1 优先定位于酿酒酵母¹² 和培养细胞¹¹ 中的 MT 加末端¹³ 的观察结果。从那时起，EB1 和其他加尖端追踪蛋白 （+TIP）^14,15 已广泛用于 MT 动态不稳定性的体内研究¹⁶，包括神经元发育的背景¹⁷。

果蝇是神经元发育过程中 MT 动力学体内成像研究的强大模型，因为果蝇研究有大量的遗传和成像工具 ^18,19 以及果蝇和脊椎动物神经元在结构和功能上的相似性¹。果蝇幼虫神经肌肉接头 （NMJ） 的一项关键早期研究通过完整动物的半透明角质层对荧光膜标志物进行重复无创成像，以记录突触前末端形态发生²⁰。使用类似的方法对整个活的果蝇幼虫进行成像，提供了轴突中汽车货物进行过程中运动的亚细胞、颗粒级分析的初步演示²¹。最近，Rolls 及其同事对完整果蝇幼虫 22,23,24,25,26,27 的感觉树突进行了细致的研究，通过对绿色荧光蛋白 （GFP） 标记的 EB1 进行颗粒跟踪和分析，表征了突触后 MT 加末端动力学。在果蝇 22,23,24,25,26,27 和其他系统 28,29,30,31,32 中的此类研究显着推进了对 MT 加发育神经元树突末端的单聚合物行为的理解 ³³。

尽管突触后 MT 动力学的体内研究令人印象深刻^{22、23、24、25、26、27、28、29、30、31}，但关于发育中轴突末端突触前 MT 动力学的可比研究要少得多。已使用荧光斑点显微镜 （FSM） 和光漂白后荧光恢复 （FRAP） 研究了果蝇幼虫 NMJ 的 MT 动力学³⁴。这些技术评估整体微管蛋白动力学，但不评估单个 MT plus 末端的行为。在撰写本文时，对果蝇 NMJ 的单个 MT 加端进行了一项唯一的调查：这项研究将实时延时成像与运动记录仪的手动分析相结合，以表征动态的、EB1-GFP 标记的“先锋 MT”群体，这些群体似乎与更广泛的稳定 MT 群体不同³⁵。缺乏对突触前 MT 动力学的研究可能至少部分是由于解剖学：虽然由于树突靠近幼虫角质层，因此获得树突的图像相对简单，但 NMJ 被其他组织阻挡，这使得获得具有足够信噪比的图像以进行颗粒水平分析具有挑战性。尽管如此，鉴于突触前 MT 对突触形态发生和稳定³⁶ 的重要性，以及它们与神经发育和神经退行性疾病³⁷ 的联系，弥合对突触前和突触后 MT 的理解之间的这一差距可能会产生宝贵的见解。

与体外或离体分析相比，通常体内 MT 动力学分析的另一个挑战是可以从体内数据中提取动力学参数的自动化软件工具有限。目前，用于分析 +TIP 标记的 MT 加端的最流行和最强大的技术之一是 plusTipTracker^38,39，这是一款基于 MATLAB 的软件，可以自动跟踪和分析多个动力学参数。值得注意的是，plusTipTracker 不仅可以测量 MT 的增长，还可以测量收缩和拯救：EB1-GFP 等 +TIP 标签仅与生长的正端相关联，而 plusTipTracker 可以通过算法推断收缩率和拯救事件。然而，虽然 plusTripTracker 已经非常成功地应用于许多环境，包括之前对果蝇 S2 细胞中离体 MT 动力学的多参数分析⁴⁰，但鉴于其信噪比较低，plusTipTracker 并不是体内数据分析的最佳选择。因此，果蝇树突^{22、23、24、25、26、27} 和 NMJ³⁵ 的正端动力学的体内研究依赖于使用 ImageJ⁴¹ 等软件手动生成和分析运动图，或涉及许多人在环组件的半自动策略。

本研究提出了一种实验和分析工作流程，可减少对果蝇三龄幼虫的感觉树突和运动轴突末端的突触前 MT 动力学进行无创聚合物水平分析所需的实验和分析开销。该方案利用固定的、完整的幼虫，因此避免了已知会触发应激反应的伤害以及其他可能扰乱体内 MT 动力学的非生理条件。为了标记动态 MT 加端，EB1-GFP 使用 Gal4/UAS 系统⁴² 进行泛神经元表达，允许使用单个驱动程序在树突和 NMJ 处可视化 MT。虽然一些早期步骤不可避免地需要人类决策，例如选择动物标本和确定要成像的区域，但数据采集之后的步骤在很大程度上是自动化的。至关重要的是，新软件的优化实现了自动化、无偏差的分析，只需最少的人工输入。虽然还有其他粒子跟踪方法可用 43,44,45，^但这项研究使用了专有软件，因为它在算法上非常适合解决该特定数据集的特定挑战。该软件现在可供用户用于各种应用程序。具体来说，使用相干性增强扩散过滤⁴⁶ 是自动分割和背景去除不可或缺的一部分，并且专门实施自定义算法来自动化粒子检测和跟踪。这种策略可以有效地处理本研究中数据固有的低信噪比，以及其他挑战，例如 EB1-GFP 彗星通过不同焦平面的运动。虽然无法详尽地测试该软件与所有其他颗粒分析软件的性能，但当前策略的性能等于或接近标准的人类性能。此外，据作者所知，还没有其他软件专门针对来自感觉树突和突触前末梢的体内数据进行训练。鉴于图像分析算法的性能通常高度特定于它们所设计的数据，并且还不可能实现广义计算机视觉，因此预计训练所描述的软件以获得感兴趣的特定体内数据是算法上最合理的方法。

鉴于对树突状 MT^{22、23、24、25、26、27} 的广泛工作以及可以从该系统获取的一致数据质量，图像采集和软件分析策略首先在果蝇感觉树突中得到验证。重要的是，在树突中发现，使用不同的神经元 Gal4 驱动程序，即使在其他方面相同的野生型背景中，由于遗传背景的差异，也会导致 EB1-GFP 动力学的显着差异，强调了使用单个 Gal4 驱动程序获得一致结果的重要性。该策略接下来用于 NMJ 突触前末端 EB1-GFP 动力学的多参数分析。为了进一步说明该方法的研究价值，这种成像和软件策略用于评估敲低 dTACC 后突触前和突触后 EB1-GFP 动力学，dTACC 是高度保守的 TACC（转化酸性卷曲线圈）家族的果蝇同源物^47,48。先前在果蝇 S2 细胞⁴⁰ 中的工作，以及 Lowery 及其同事在非洲爪蟾生长锥 49,50,51 中的工作表明，TACC 家族成员调节 MT 加端动力学。此外，最近报道的共聚焦和超分辨率免疫荧光成像证据表明，dTACC 是神经元形态发生过程中突触前 MT 的关键调节因子⁵²，提出了 dTACC 是否调节活 MT 动力学的问题。本报告展示了一种确实可以检测 dTACC 敲低后实时 MT 行为差异的方法。因此，本研究提出了一种体内方法，可以有效地识别和表征发育神经元内 MT 动力学的关键调节因子，尤其是在突触前区室中。

研究方案

1. 果蝇标本的生成

1. 选择合适的 MT 正端标记。本研究利用了 GFP 标记的 EB1，这是一种特征明确的加末端标志物，具有强烈、清晰的信号^11,12。替代方案包括其他 +TIP，例如 EB3^10,13、CLASP/Orbit⁵³ 和 CLIP-170⁵⁴。
2. 在 UAS 启动子（例如 UAS-EB1-GFP）的控制下使用 MT 标记获得或生成果蝇。
3. 选择合适的组织特异性 Gal4 驱动程序。本研究使用泛神经元驱动 elaV-Gal4^58,59 驱动感觉树突和 NMJ 的表达，使用 221-Gal4^60,61 驱动树突特异性表达。
4. 使用标准的苍蝇饲养技术饲养苍蝇^55,56。建议将果蝇保存在 25 °C 的加湿培养箱中，以实现最佳 Gal4/UAS 表达。
5. 使用标准的果蝇遗传技术^55,56，进行杂交以生成果蝇，以在所需的细胞/组织中表达 MT 加末端标记。
   注意：对于任何 Gal4 驱动因子和转基因组合，实验设计应包括概念验证和验证实验，以表征系统并避免过表达的伪影。

2. 设备设置

1. 在共聚焦显微镜附近（即在同一个房间里）设置一个工作站，包括果蝇、麻醉试剂、载玻片结构材料、立体显微镜和照明源，以尽量减少样品制备和成像之间花费的时间，以延长幼虫的健康和活力。
2. 通过在 1.5 mL 微量离心管中混合 9% 氯仿混合物（0.1 mL 氯仿和 1.0 mL 卤烃油）来制备麻醉剂。为避免分离，在准备每个新玻片之前，通过倒置试管充分混合。
3. 准备载玻片：剪下四条双面胶带（~15 mm 宽）。将其中两块在载玻片上对齐，在试纸条之间留出 ~5 mm 的空间。将剩余的两块放在前两块的顶部，以使胶带的厚度增加一倍（图 1C）。
4. 在载玻片之间 5 mm 的空间内，将一大滴 （~100 μL） 氯仿/油混合物添加到载玻片上（图 1C）。

3. 制备用于成像的幼虫样品

1. 用 1x PBS 填充容器（例如，6 孔板）。
2. 使用镊子或类似工具从果蝇瓶中收集 3^龄 幼虫。通过幼虫的爬行行为和 9-12 个突出的锯齿状口钩的存在来识别处于适当阶段的幼虫。使用立体显微镜协助分期幼虫（图 1D）。
3. 将幼虫放入 PBS 中并轻轻移动以洗去任何食物残留物或其他碎屑。在脆弱的纸巾上轻轻擦干幼虫。
4. 通过将幼虫放入第 2 部分载玻片上的氯仿/油滴中麻醉幼虫（图 1C）。
   注意：幼虫的背侧/腹侧方向并不重要，因为无论标本的方向如何，都可以通过将显微镜载物台设置为适当的焦平面，通过半透明的角质层检测到感觉和运动神经元。
5. 将 #1.5 盖玻片放在顶部。通过施加轻微的压力将盖玻片粘附在胶带上，从而固定幼虫而不会损坏它（图 1C）。
6. 用凡士林或指甲油密封腔室。

4. 活体样品的延时共聚焦成像

1. 准备共聚焦显微镜和油浸的 60 倍物镜。将样品放在载物台上（图 1A、B）。
2. 使用采集软件配置实验。
   注意：在本研究中，每个成像系列都是在单个焦平面而不是 z 堆栈上采集的。
   1. 将延时持续时间设置为 30 秒，间隔 2 秒，总共 16 帧。
   2. 设置激光曝光和强度，以确保足够的信号，同时避免饱和和光漂白。
   3. 对于 EB1-GFP 成像，488 nm 激光的曝光时间为 100 毫秒，强度为 30%。这些值可能因此协议的不同用途而异，应根据经验进行修改。
3. 使用显微镜的目镜在宽视场绿色照明下找到幼虫。通过缓慢调整载物台找到树突或 NMJ。不要将幼虫暴露在光照（宽场或共聚焦）下超过必要的时间。
   1. 树突表现为薄的亮绿色神经网，很容易与厚长的轴突束区分开来（图 1E）。
   2. NMJ 表现为一组亮绿色的单个钮扣，直径约为 5 μm，位于与神经索发散的厚长轴突束的末端（图 1F）。
4. 使用实时摄像头馈送，使用 488 nm 照明快速聚焦感兴趣区域。一旦找到正确的焦点，请立即停止照明以避免光毒性。
5. 启动图像采集。EB1 彗星可识别为明亮、有运动的点状彗星。
6. 有关荧光实时成像⁵⁷ 的更多详细信息和指南，请参阅以前发布的方案。

5. 基于软件的图像处理和分析

1. 单独分析每个视频文件。在软件中（用户界面如图 2 所示），选择 File |导入 |Image Sequence 并在出现的框中拖动 TIF 文件。预览视频。
2. 在 Detection Parameters 菜单下，调整软件参数以确保仅检测到清晰可见的点，并避免检测到虚假对象。例如，降低颗粒强度会导致软件对标点的灵敏度更高，但会增加潜在的假阳性。参数的精确值将根据经验而变化。可根据要求从作者处获得检测和跟踪参数的描述。
3. 应用 Neuron 粒子跟踪配方，使用 From beginning 按钮（蓝色箭头，图 2B）分析图像。该软件会将表 1 中列出的跟踪参数的结果输出到结果电子表格（绿框，图 2B）。为了便于以后的分析和解释，可以使用 Results Spreadsheet 部分中的 Export 功能将结果存储在电子表格软件中。
4. 将光标导航至上一步中检测到的 puncta ，然后单击鼠标左 键以选择或取消选择。可以使用 Ctrl + 左键单击同时选择多个 puncta。
   注意：根据项目目标和应用程序，可以使用其他启发式方法来过滤标点。例如，生命周期小于 8-10 秒（4-5 帧）的点可能会被省略，因为它们没有提供有关整个生长事件的足够信息。对这种启发式方法的需求会因经验而异。作者可应要求提供有关软件功能的更多详细信息。

结果

果蝇从组成性表达 UAS-EB1-GFP 转基因的稳定储液中饲养出来 （elaV-Gal4;UAS-EB1-GFP）^58,59 或感觉神经元 （221-Gal4;UAS-EB1-GFP）^60,61。本研究选择 EB1 是因为它特异性定位于生长末端，并在暂停和收缩时立即解离 ^14,15，并且已通过多项研...

讨论

本文讨论了一种在发育过程中对树突和 NMJ 中的 MT 动力学进行无创活体成像的方案。在实验步骤中需要人工输入，例如选择要成像的动物，并且可能会在数据收集过程中引入无法合理消除的偏差。因此，该协议的一个关键目标是通过使用新软件（第 5 节）进行自动分析来尽可能减少偏差，该软件经过优化以处理体内数据固有的低信噪比。重要的是，本研究中使用的算法允...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Eppendorf	21008-959	Sample preparation
1000 µL TipOne pipette tips	USA Scientific	1111-2721	Sample preparation
200 µL TipOne pipette tips	USA Scientific	1120-8710	Sample preparation
221-Gal4 flies	Bloomington Drosophila Stock Center (US)	26259	Drosophila genetics/crosses
60x Objective Lens	Nikon	Plan Apo 60x Oil	Image acquisition
6-well plate	BD Falcon	353224	Sample preparation
Agar	MoorAgar	41084	Drosophila food
Aivia	DRVision LLC		Optimized as part of this study
Chloroform (stabilized with amylenes)	Sigma-Aldrich	C2432	Sample preparation
CO2 blowgun (for selection of flies for crosses)	Genesee	54-104	Drosophila genetics/crosses
CO2 bubbler (for selection of flies for crosses)	Genesee	59-180	Drosophila genetics/crosses
Cooled CCD camera	Hamamatsu	ORCA-R2	Image acquisition
Cornmeal	Genesee	62-101	Drosophila food
Distilled Water			Drosophila food
Double-sided tape	Scotch		Sample preparation
Drosophila vials	Genesee	32-109	Drosophila food
Droso-plugs (foam plugs for vials)	Genesee	59-200	Drosophila food
Dumont #5 Biologie Inox Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Sample preparation
elaV-Gal4;UAS-EB1-GFP;UAS-Dcr2 flies	Gift of Melissa Rolls (Penn State University)	N/A	Drosophila genetics/crosses
Ethanol (95%)	VWR	75811-022	Drosophila food
Fiber optic illuminator/light source for stereomicroscope	Nikon	NI-150	Sample preparation
Flypad (for selection of flies for crosses)	Genesee	59-172	Drosophila genetics/crosses
Forma Environmental Chamber/Incubator	ThermoFisher	3940	Drosophila genetics/crosses
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898	Sample preparation
Immersion Oil	Nikon	MXA22168	Image acquisition
Kimwipe Delicate Wipes	Fisher Scientific	34120	Sample preparation
Laser Merge Module	Spectral Applied Research	LMM-5	Image acquisition
Light Source for Confocal	Lumencor	SOLA 54-10021	Image acquisition
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software	Molecular Devices		Image acquisition
Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2 (#1.5)	VWR	48366-205	Sample preparation
Motorized inverted microscope with Perfect Focus System	Nikon	TI-ND6-PFS-S	Image acquisition
Motorized stage and shutters	Prior	Proscan III	Image acquisition
Multi-purpose scissors	Scotch	MMM1428	Sample preparation
Nail Polish	Sally Hansen	784179032016 074170382839	Sample preparation
Optical Filter	Chroma	ET480/40m	Image acquisition
P1000 Pipetman	Gilson	F123602	Sample preparation
P200 Pipetman	Gilson	F123601	Sample preparation
PBS (10X) ph 7.4	ThermoFisher	70011044	Sample preparation
Propionic Acid	Fisher	A258-500	Drosophila food
Spinning disk confocal scanner unit	Yokagawa	CSU-X1	Image acquisition
Stereomicroscope	Nikon	SMZ800N	Sample preparation
Sugar (Sucrose)	Genesee	62-112	Drosophila food
Superfrost Slide	VWR	48311-600	Sample preparation
Tegosept	Genesee	20-258	Drosophila food
UAS-dtacc-RNAi flies	Vienna Drosophila Resource Center (Vienna, Austria)	VDRC-101439	Drosophila genetics/crosses
Vaseline petroleum jelly	WB Mason	DVOCB311003	Sample preparation
Winsor & Newton Brush Regency Gold 520, Size 0	Staples	5012000	Drosophila genetics/crosses
Yeast	VWR	Torula Yeast IC90308580	Drosophila food
Yokogawa dichroic beamsplitter	Semrock	Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5	Image acquisition