JoVE Logo
Autoren
Kontakt

Anmelden

Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.

In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

In dieser Studie wird eine nicht-invasive intravitale neuronale Bildgebungsstrategie in Kombination mit einer neuen Softwarestrategie vorgestellt, um eine automatisierte, unvoreingenommene Verfolgung und Analyse der in vivo Mikrotubuli (MT) plus Enddynamik in den sensorischen Dendriten und den neuromuskulären Verbindungen von Drosophila zu erreichen.

Zusammenfassung

Mikrotubuli (MTs) spielen eine entscheidende Rolle bei der neuronalen Entwicklung, aber es bleiben viele Fragen zu den molekularen Mechanismen ihrer Regulation und Funktion offen. Darüber hinaus ist trotz Fortschritten im Verständnis postsynaptischer MTs viel weniger über den Beitrag präsynaptischer MTs zur neuronalen Morphogenese bekannt. Insbesondere Studien zur in vivo MT-Dynamik in sensorischen Dendriten von Drosophila lieferten signifikante Einblicke in das Verhalten auf Polymerebene. Die technischen und analytischen Herausforderungen, die mit der Live-Bildgebung der neuromuskulären Verbindung (NMJ) der Fliege verbunden sind, haben jedoch vergleichbare Studien zur präsynaptischen MT-Dynamik eingeschränkt. Darüber hinaus gibt es zwar viele hocheffektive Softwarestrategien für die automatisierte Analyse der MT-Dynamik in vitro und ex vivo, aber In-vivo-Daten erfordern aufgrund des von Natur aus schlechteren Signal-Rausch-Verhältnisses in Bildern und der komplexen zellulären Morphologie oft erhebliche Bedienereingaben oder eine vollständig manuelle Analyse.  Um dies zu adressieren, wurde in dieser Studie eine neue Softwareplattform für die automatisierte und unvoreingenommene in vivo Partikeldetektion optimiert. Die multiparametrische Analyse von konfokalen Live-Zeitrafferbildern von EB1-GFP-markierten MTs wurde sowohl in Dendriten als auch im NMJ von Drosophila-Larven durchgeführt und fand auffällige Unterschiede im Verhalten der MT. Darüber hinaus wurde die MT-Dynamik nach dem Knockdown des MT-assoziierten Proteins (MAP) dTACC, einem Schlüsselregulator der Synapsenentwicklung von Drosophila, analysiert und statistisch signifikante Veränderungen in der MT-Dynamik im Vergleich zum Wildtyp identifiziert. Diese Ergebnisse zeigen, dass diese neuartige Strategie zur automatisierten multiparametrischen Analyse der prä- und postsynaptischen MT-Dynamik auf Polymerebene die Human-in-the-Loop-Kriterien signifikant reduziert. Die Studie zeigt darüber hinaus den Nutzen dieser Methode bei der Detektion unterschiedlicher MT-Verhaltensweisen nach dTACC-Knockdown, was auf eine mögliche zukünftige Anwendung für funktionale Screens von Faktoren hinweist, die die MT-Dynamik in vivo regulieren. Zukünftige Anwendungen dieser Methode könnten sich auch auf die Aufklärung von zelltyp- und/oder kompartimentspezifischen MT-Verhaltensweisen und die mehrfarbige korrelative Bildgebung von EB1-GFP mit anderen zellulären und subzellulären Markern von Interesse konzentrieren.

Einleitung

Zellen organisieren sich durch die Koordination intra- und interzellulärer Veränderungen über die Morphogenese zu funktionellen Strukturen. Ein bemerkenswertes Beispiel für die Morphogenese ist die Entwicklung der hochspezialisierten neuronalen Struktur. Neuronen weisen eine bemerkenswerte Polarisation auf, bei der sie zwei strukturell und funktionell unterschiedliche Arten von Fortsätzen, Dendriten und Axone1, verlängern, die immense Längen erreichen können. Die Komplexität der neuronalen Entwicklung ergibt sich nicht nur aus der schieren Größe von Dendriten und Axonen, sondern auch aus der Schwierigkeit, ihre kompliziert verzweigten Geometrien zu bilden 2,3. Die neuronale Morphogenese und ihre Auswirkungen auf Lernen und Gedächtnis4 motivieren zu einer kontinuierlichen Erforschung sowohl ihrer genetischen Kontrolle als auch der zugrundeliegenden zellbiologischen Mechanismen. Zu diesen Mechanismen gehören unter anderem der intrazelluläre Membrantransport und die vielen Umlagerungen des Zytoskeletts, die für Veränderungen in der neuronalen Morphologie erforderlich sind 1,2,3.

Studien zur neuronalen Morphogenese haben eine Vielzahl fortschrittlicher Visualisierungstechniken hervorgebracht. Statische Methoden, wie die Elektronenmikroskopie oder die Fluoreszenzmikroskopie von festen Sonden, werden häufig eingesetzt, um hochauflösende morphologische und strukturelle Analysen durchzuführen. Abgesehen von den Artefakten, die bei jeder Konservierungsmethode unvermeidlich sind, kann die statische Visualisierung jedoch die dynamischen Veränderungen, die der Morphogenese zugrunde liegen, nicht erfassen. So stammen viele entscheidende Erkenntnisse aus der Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie von lebendem Gewebe. Frühe Arbeiten von Lichtman und Kollegen 5,6,7 nutzten In-vivo-Bildgebung des Nervensystems von Säugetieren, um die Axonregeneration/-degeneration, die Organisation synaptischer Komponenten und den axonalen Transport über große Entfernungen zu untersuchen. Darüber hinaus waren bahnbrechende Studien an primären neuronalen Explantaten entscheidend für die Etablierung der Bedeutung der Mikrotubuli (MT)-Dynamik für die axonale Elongation und Motilität 8,9. Entscheidend ist, dass frühe neuronale Explantatsstudien die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Endbindungsproteinen (EBs) etablierten, um unschätzbare Einblicke in die Dynamik von MT plus Ende bei der Entwicklung von Neuronen auf der Ebene einzelner MT-Polymere zu gewinnen10. Diese Studien ergaben sich aus Beobachtungen, dass das EB-Familienmitglied EB1 bevorzugt an MT plus Enden11 in S. cerevisiae12 und in kultivierten Zellen13 lokalisiert. Seitdem werden EB1 und andere Plus-Tip-Tracking-Proteine (+TIPs)14,15 in zahlreichen In-vivo-Studien zur dynamischen Instabilität der MT16 eingesetzt, auch im Zusammenhang mit der neuronalen Entwicklung17.

Drosophila ist ein leistungsfähiges Modell für in vivo bildgebende Untersuchungen der MT-Dynamik während der neuronalen Entwicklung, da umfangreiche genetische und bildgebende Werkzeuge für Fliegenstudien zur Verfügung stehen18,19 sowie die Ähnlichkeiten in Struktur und Funktion zwischen Drosophila und Wirbeltierneuronen1. In einer wichtigen frühen Studie der neuromuskulären Verbindung (NMJ) von Drosophila-Larven wurde wiederholte nicht-invasive Bildgebung eines fluoreszierenden Membranmarkers durch die durchscheinende Kutikula intakter Tiere durchgeführt, um die präsynaptische terminale Morphogenese zu dokumentieren20. Unter Verwendung einer ähnlichen Methode zur Abbildung ganzer, lebender Drosophila-Larven wurde eine erste Demonstration der subzellulären Analyse der prozessiven Bewegung von Motorfrachten in den Axonen auf Partikelebene durchgeführt21. In jüngerer Zeit charakterisierten akribische Studien von Rolls und Kollegen an den sensorischen Dendriten intakter Drosophila-Larven 22,23,24,25,26,27 die postsynaptische MT plus-End-Dynamik durch Partikelverfolgung und Analyse von grün fluoreszierendem Protein (GFP)-markiertem EB1. Solche Studien an Drosophila 22,23,24,25,26,27 und anderen Systemen 28,29,30,31,32 haben das Verständnis des Einzelpolymerverhaltens von MT plus Enden in den Dendriten der sich entwickelnden Neuronensignifikant verbessert 33.

Trotz der beeindruckenden in vivo-Studien der postsynaptischen MT-Dynamik 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 gab es weitaus weniger vergleichbare Studien zur präsynaptischen MT-Dynamik am sich entwickelnden Axonterminal. Die MT-Dynamik an der Drosophila-Larve NMJ wurde mittels Fluoreszenz-Speckle-Mikroskopie (FSM) und Fluoreszenz-Recovery nach Photobleaching (FRAP) untersucht34. Diese Techniken bewerten die gesamte Tubulinkinetik, nicht jedoch das Verhalten einzelner MT plus-Enden. Zum Zeitpunkt der Erstellung dieses Artikels gab es eine einzige Untersuchung einzelner MT plus Enden am Drosophila NMJ: Diese Studie kombinierte Live-Zeitraffer-Bildgebung mit manueller Analyse von Kymographen, um eine Population dynamischer, EB1-GFP bezeichneter "Pionier-MTs" zu charakterisieren, die sich von einer breiteren Population stabilisierter MTszu unterscheiden schienen 35. Dieser Mangel an Forschung zur präsynaptischen MT-Dynamik könnte zumindest teilweise auf die Anatomie zurückzuführen sein: Während es aufgrund ihrer Nähe zur Kutikula der Larve relativ einfach ist, Bilder von Dendriten zu erhalten, werden NMJs durch andere Gewebe behindert, was es schwierig macht, Bilder mit ausreichendem Signal-Rausch-Verhältnis für die Analyse auf Partikelebene aufzunehmen. Nichtsdestotrotz dürfte die Überbrückung dieser Lücke zwischen dem Verständnis prä- und postsynaptischer MTs für die synaptische Morphogenese und Stabilisierung36 sowie ihrer Verbindungen zu neurologischen Entwicklungsstörungen und neurodegenerativen Störungen37 zu unschätzbaren Erkenntnissen führen.

Eine zusätzliche Herausforderung für die Analyse der Dynamik von in vivo MT im Allgemeinen im Gegensatz zur in vitro oder ex vivo Analyse sind die begrenzten automatisierten Softwaretools, die Dynamikparameter aus in vivo-Daten extrahieren können. Derzeit ist plusTipTracker38,39 eine der beliebtesten und leistungsfähigsten Techniken zur Analyse von +TIP-gekennzeichneten MT plus-Enden, eine MATLAB-basierte Software, die die automatisierte Verfolgung und Analyse mehrerer Dynamikparameter ermöglicht. Bemerkenswert ist, dass plusTipTracker nicht nur das Wachstum von MT, sondern auch Schwund und Rettungen misst: Während +TIP-Labels wie EB1-GFP nur mit wachsenden Pluspunkten in Verbindung gebracht werden, kann plusTipTracker algorithmisch auf Schrumpfungsraten und Rettungsereignisse schließen. Obwohl plusTripTracker jedoch sehr erfolgreich in vielen Kontexten eingesetzt wurde, einschließlich früherer multiparametrischer Analysen der ex vivo MT-Dynamik in Drosophila S2-Zellen40, ist plusTipTracker aufgrund ihres geringeren Signal-Rausch-Verhältnisses nicht optimal für die Analyse von in vivo-Daten. Infolgedessen stützten sich In-vivo-Studien der Plus-End-Dynamik an den Dendriten 22,23,24,25,26,27 und am NMJ35 von Drosophila auf die manuelle Generierung und Analyse von Kymographen unter Verwendung von Software wie ImageJ 41 oder auf halbautomatische Strategien, die zahlreiche Human-in-the-Loop-Komponenten einbeziehen.

Diese Studie stellt einen experimentellen und analytischen Arbeitsablauf vor, der den experimentellen und analytischen Aufwand reduziert, der für die Durchführung einer nicht-invasiven Analyse der präsynaptischen MT-Dynamik auf Polymerebene sowohl in sensorischen Dendriten als auch im motorischen Axonterminal von Drosophila-Larven im dritten Stadium erforderlich ist. Das Protokoll verwendet immobilisierte, intakte Larven und vermeidet daher Verletzungen, von denen bekannt ist, dass sie Stressreaktionen auslösen, sowie andere nicht-physiologische Bedingungen, die die Dynamik der In-vivo-MT stören könnten. Um dynamische MT-Plus-Enden zu markieren, wird EB1-GFP panneuronal exprimiert, wobei das Gal4/UAS-System 42 verwendet wird, was die Visualisierung von MTs sowohl an Dendriten als auch an NMJ mit einem einzigen Treiber ermöglicht. Während einige frühe Schritte unweigerlich der menschlichen Entscheidungsfindung unterliegen, wie z. B. die Auswahl von Tierproben und die Identifizierung der abzubildenden Regionen, sind die Schritte nach der Datenerfassung weitgehend automatisiert. Entscheidend war, dass die Optimierung einer neuen Software eine automatisierte, unvoreingenommene Analyse mit minimalem menschlichem Aufwand ermöglichte. Während andere Partikelverfolgungsmethoden verfügbar sind 43,44,45, verwendet diese Studie eine proprietäre Software, da sie algorithmisch gut geeignet war, um die besonderen Herausforderungen dieses speziellen Datensatzes zu bewältigen. Die Software steht den Anwendern nun für eine Vielzahl von Anwendungen zur Verfügung. Insbesondere ist die Verwendung der kohärenzsteigernden Diffusionsfilterung46 integraler Bestandteil der automatisierten Segmentierung und Hintergrundentfernung, und benutzerdefinierte Algorithmen werden speziell zur Automatisierung der Partikelerkennung und -verfolgung implementiert. Diese Strategie könnte das niedrige Signal-Rausch-Verhältnis, das den Daten in dieser Studie innewohnt, sowie andere Herausforderungen, wie z. B. die Bewegung von EB1-GFP-Kometen durch verschiedene Fokusebenen, effektiv bewältigen. Obwohl es nicht möglich ist, die Leistung dieser Software im Vergleich zu allen anderen Partikelanalysesoftware erschöpfend zu testen, entsprach die Leistung der vorliegenden Strategie der Standardleistung des Menschen oder näherte sich ihr an. Darüber hinaus gibt es nach Kenntnis der Autoren keine andere Software, die speziell mit In-vivo-Daten von sensorischen Dendriten und dem präsynaptischen Terminal trainiert wurde. Angesichts der Tatsache, dass die Leistung von Bildanalysealgorithmen oft sehr spezifisch für die Daten ist, für die sie entwickelt wurden, und dass verallgemeinerte Computer Vision noch nicht möglich ist, wird erwartet, dass das Training der beschriebenen Software auf die spezifischen in vivo-Daten von Interesse der algorithmisch einwandfreiste Ansatz ist.

Angesichts der umfangreichen Arbeiten an den dendritischen MTs 22,23,24,25,26,27 sowie der gleichbleibenden Qualität der Daten, die mit diesem System erfasst werden können, wurde die Bildaufnahme- und Softwareanalysestrategie zunächst an sensorischen Dendriten von Drosophila validiert. Wichtig ist, dass in Dendriten festgestellt wurde, dass die Verwendung unterschiedlicher neuronaler Gal4-Treiber, selbst bei ansonsten identischen Wildtyp-Hintergründen, zu signifikanten Unterschieden in der EB1-GFP-Dynamik aufgrund von Unterschieden im genetischen Hintergrund führt, was die Bedeutung der Verwendung eines einzigen Gal4-Treibers für konsistente Ergebnisse unterstreicht. Diese Strategie wurde als nächstes für die multiparametrische Analyse der EB1-GFP-Dynamik am präsynaptischen Ende des NMJ verwendet. Um den Untersuchungswert dieser Methode weiter zu veranschaulichen, wurde diese Bildgebungs- und Softwarestrategie verwendet, um sowohl die prä- als auch die postsynaptische EB1-GFP-Dynamik nach dem Knockdown von dTACC, dem Drosophila-Homolog der hochkonservierten TAC-Familie (Transforming Acidic Coiled Coil)47,48, zu bewerten. Frühere Arbeiten an Drosophila S2-Zellen40 sowie Arbeiten von Lowery und Kollegen am Xenopus-Wachstumskegel 49,50,51 haben gezeigt, dass Mitglieder der TAC-Familie die MT plus-End-Dynamik regulieren. Darüber hinaus zeigten kürzlich berichtete Erkenntnisse aus konfokalen und superauflösenden Immunfluoreszenz-Bildgebungen, dass dTACC ein Schlüsselregulator präsynaptischer MTs während der neuronalen Morphogeneseist 52, was die Frage aufwirft, ob dTACC die Dynamik von Live-MTs reguliert. Dieser Bericht demonstriert eine Methode, mit der tatsächlich Unterschiede im Verhalten von Live-MT beim dTAC-Knockdown erkannt werden können. Daher stellt diese Studie eine in vivo Methode vor, die Schlüsselregulatoren der MT-Dynamik innerhalb des sich entwickelnden Neurons, insbesondere im präsynaptischen Kompartiment, effektiv identifizieren und charakterisieren kann.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

1. Erzeugung von Drosophila-Exemplaren

  1. Wählen Sie einen geeigneten MT plus-End-Markierer aus. In dieser Studie wurde GFP-markiertes EB1 verwendet, ein gut charakterisierter Plus-End-Marker mit einem starken, klaren Signal11,12. Zu den Alternativen gehören andere +TIPs wie EB310,13, CLASP/Orbit53 und CLIP-17054.
  2. Gewinnung oder Generierung von Fliegen mit dem MT-Marker unter Kontrolle eines UAS-Promotors (z. B. UAS-EB1-GFP).
  3. Wählen Sie den passenden gewebespezifischen Gal4-Treiber. In dieser Studie wurde der panneuronale Treiber elaV-Gal458,59 verwendet, um die Expression sowohl in sensorischen Dendriten als auch am NMJ und 221-Gal460,61 für die Dendriten-spezifische Expression zu steuern.
  4. Fliegen mit Standard-Fliegenhaltungstechnikenaufziehen 55,56. Es wird empfohlen, Fliegen in befeuchteten Inkubatoren bei 25 °C zu halten, um eine optimale Gal4/UAS-Expression zu gewährleisten.
  5. Unter Verwendung genetischer Standardtechnikenfür Fliegen 55,56 werden Kreuzungen durchgeführt, um Fliegen zu erzeugen, die den MT plus-End-Marker in den gewünschten Zellen/Geweben exprimieren.
    HINWEIS: Für jede Kombination aus Gal4-Treiber und -Transgen sollte das Versuchsdesign Proof-of-Concept- und Validierungsexperimente umfassen, um das System zu charakterisieren und Artefakte durch Überexpression zu vermeiden.

2. Einrichtung der Ausrüstung

  1. Richten Sie einen Arbeitsplatz ein, einschließlich der Fliegen, der Anästhesiereagenzien, der Objektträgerbaumaterialien, des Stereomikroskops und der Beleuchtungsquelle, in der Nähe des konfokalen Mikroskops (d. h. im selben Raum), um die Zeit zwischen Probenvorbereitung und Bildgebung zu minimieren und die Gesundheit und Lebensfähigkeit der Larven zu verlängern.
  2. Bereiten Sie das Anästhetikum vor, indem Sie eine 9%ige Chloroformmischung (0,1 mL Chloroform und 1,0 mL Halogenkohlenwasserstofföl) in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen mischen. Um eine Trennung zu vermeiden, mischen Sie gut, indem Sie das Röhrchen umdrehen, bevor Sie jeden neuen Objektträger vorbereiten.
  3. Objektträger vorbereiten: Schneiden Sie vier Streifen doppelseitiges Klebeband (~15 mm breit) ab. Richten Sie zwei der Teile auf der Glasschiene aus und lassen Sie zwischen den Streifen einen Abstand von ~5 mm. Schichten Sie die restlichen zwei Stücke auf die ersten beiden, um die Dicke des Klebebandes zu verdoppeln (Abbildung 1C).
  4. Geben Sie einen großen Tropfen (~100 μL) Chloroform/Öl-Gemisch in den 5-mm-Abstand zwischen den Klebebandstücken auf den Objektträger (Abbildung 1C).

3. Vorbereitung der Larvenproben für die Bildgebung

  1. Füllen Sie einen Behälter (z.B. eine 6-Well-Platte) mit 1x PBS.
  2. Sammeln Sie 3. Larven aus dem Fliegenfläschchen mit einer Pinzette oder einem ähnlichen Instrument. Identifizieren Sie die Larven im richtigen Stadium anhand ihres Krabbelverhaltens und des Vorhandenseins von 9–12 markanten, gezackten Maulhaken. Verwenden Sie ein Stereomikroskop, um die Larven zu stadien (Abbildung 1D).
  3. Legen Sie eine Larve in das PBS und bewegen Sie sie vorsichtig, um Speisereste oder andere Ablagerungen abzuwaschen. Trocknen Sie die Larve vorsichtig auf einem zarten Tuch.
  4. Betäuben Sie die Larve, indem Sie sie in einen Chloroform-/Öltropfen auf dem Objektträger aus Abschnitt 2 legen (Abbildung 1C).
    HINWEIS: Die dorsale/ventrale Ausrichtung der Larve ist nicht kritisch, da sowohl sensorische als auch motorische Neuronen durch die durchscheinende Kutikula hindurch nachgewiesen werden können, indem der Mikroskoptisch auf die richtige Fokusebene eingestellt wird, unabhängig von der Ausrichtung der Probe.
  5. Legen Sie ein Deckglas #1,5 darauf. Kleben Sie das Deckglas mit leichtem Druck auf das Klebeband und fixieren Sie so die Larve, ohne sie zu beschädigen (Abbildung 1C).
  6. Versiegeln Sie die Kammer mit Vaseline oder Nagellack.

4. Konfokale Zeitraffer-Bildgebung von lebenden Proben

  1. Bereiten Sie das konfokale Mikroskop und die 60-fach-Objektivlinse mit Ölimmersion vor. Legen Sie die Probe auf den Tisch (Abbildung 1A,B).
  2. Verwenden Sie die Erfassungssoftware, um Experimente zu konfigurieren.
    HINWEIS: Für diese Studie wurde jede Bildserie in einer einzigen Fokusebene und nicht in einem Z-Stapel aufgenommen.
    1. Legen Sie die Zeitrafferdauer auf 30 s in einem Intervall von 2 s fest, also insgesamt 16 Frames.
    2. Stellen Sie die Laserbelichtung und -intensität ein, um ein ausreichendes Signal zu gewährleisten und gleichzeitig Sättigung und Photobleichung zu vermeiden.
    3. Für die EB1-GFP-Bildgebung wurde der 488-nm-Laser auf eine Belichtungszeit von 100 ms und eine Intensität von 30 % eingestellt. Diese Werte können je nach Verwendung dieses Protokolls variieren und sollten empirisch modifiziert werden.
  3. Verwenden Sie die Okulare des Mikroskops, um die Larve in weitfeldgrüner Beleuchtung zu finden. Finden Sie die Dendriten oder NMJs, indem Sie das Stadium langsam anpassen. Setzen Sie die Larve nicht länger als nötig einer Beleuchtung (Weitfeld oder Konfokal) aus.
    1. Dendriten erscheinen als dünne, hellgrüne Nervennetze, die leicht von dicken langen Axonbündeln zu unterscheiden sind (Abbildung 1E).
    2. NMJs erscheinen als Gruppen von hellgrünen einzelnen Boutons mit einem Durchmesser von etwa 5 μm an den Enden dicker langer Axonbündel, die vom Nervenstrang abweichen (Abbildung 1F).
  4. Mit dem Live-Kamera-Feed können Sie mit einer 488-nm-Beleuchtung schnell auf den gewünschten Bereich fokussieren. Stoppen Sie die Beleuchtung sofort, sobald der richtige Fokus gefunden wurde, um Phototoxizität zu vermeiden.
  5. Starten Sie die Bildaufnahme. EB1-Kometen sind als helle, bewegliche Punktuierte zu erkennen.
  6. Weitere Informationen und Richtlinien zur Fluoreszenz-Live-Bildgebung finden Sie in den zuvor veröffentlichten Protokollen57.

5. Softwarebasierte Bildverarbeitung und -analyse

  1. Analysieren Sie jede Videodatei einzeln. Wählen Sie in der Software (Benutzeroberfläche in Abbildung 2 dargestellt) Datei | Importieren | Bildsequenz und ziehen Sie TIF-Dateien in das angezeigte Feld. Zeigen Sie eine Vorschau des Videos an.
  2. Passen Sie im Menü " Erkennungsparameter " die Softwareparameter an, um sicherzustellen, dass nur deutlich sichtbare Punkte erkannt werden und die Erkennung von unerwünschten Objekten vermieden wird. So führt beispielsweise die Reduzierung der Partikelintensität zu einer höheren Empfindlichkeit der Software gegenüber Punkten, erhöht jedoch das Potenzial für Fehlalarme. Die genauen Werte der Parameter variieren empirisch. Beschreibungen der Erkennungs- und Tracking-Parameter sind auf Anfrage bei den Autoren erhältlich.
  3. Wenden Sie das Rezept für die Neuron-Partikelverfolgung an, um das Bild mit der Schaltfläche Von Anfang an zu analysieren (blauer Pfeil, Abbildung 2B). Die Software gibt die Ergebnisse für die in Tabelle 1 aufgeführten Tracking-Parameter in der Ergebnistabelle aus (grüner Kasten, Abbildung 2B). Um die spätere Analyse und Interpretation zu erleichtern, können die Ergebnisse in einer Tabellenkalkulationssoftware gespeichert werden, indem die Exportfunktion im Abschnitt "Ergebnistabelle " verwendet wird.
  4. Navigieren Sie mit dem Cursor zu puncta, das im vorherigen Schritt erkannt wurde , und klicken Sie mit der linken Maustaste , um die Auswahl zu aktivieren oder aufzuheben. Mehrere Punkte können gleichzeitig mit Strg + Linksklick ausgewählt werden.
    HINWEIS: Abhängig von den Projektzielen und Anwendungen können zusätzliche Heuristiken verwendet werden, um die Interpunktionen zu filtern. So können z.B. Punctae mit einer Lebensdauer von weniger als 8–10 s (4–5 Frames) weggelassen werden, weil sie keine ausreichenden Informationen über das gesamte Wachstumsereignis liefern. Der Bedarf an solchen Heuristiken wird empirisch unterschiedlich sein. Weitere Details zur Funktionalität der Software erhalten Sie auf Anfrage von den Autoren.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

Fliegen wurden aus stabilen Stämmen gezüchtet, die das UAS-EB1-GFP-Transgen konstitutiv entweder panneuronal (elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP)58,59 oder in sensorischen Neuronen (221-Gal4; UAS-EB1-GFP)60,61. EB1 wurde für diese Studie ausgewählt, weil es spezifisch an den Wachstumsenden lokalisiert und sofort nach Pause und Schrumpfung dissoziiert

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

In diesem Artikel wird ein Protokoll zur Durchführung einer nicht-invasiven intravitalen Bildgebung der MT-Dynamik in den Dendriten und am NMJ während der Entwicklung diskutiert. Während der Versuchsschritte ist menschlicher Input erforderlich, z. B. bei der Auswahl der Tiere für die Abbildung, und kann zu Verzerrungen im Datenerfassungsprozess führen, die nicht vernünftig beseitigt werden können. Daher besteht ein Hauptziel des Protokolls darin, Verzerrungen so weit wie möglich ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Offenlegungen

Die Autoren Hoyin Lai, Michael Jones, Hideki Sasaki, Luciano A.G. Lucas, Sam Alworth (früher) und James Shih-Jong Lee sind Mitarbeiter von DRVision Technologies LLC, die die in diesem Protokoll verwendete Software herstellt.

Danksagungen

Wir danken unseren Kollegen im Van Vactor Labor und bei DRVision sowie Dr. Max Heiman, Dr. Pascal Kaeser, David Pellman und Dr. Thomas Schwarz für die hilfreichen Gespräche. Wir danken Dr. Melissa Rolls für die großzügige Bereitstellung des elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP; UAS-DCR2 und 221-Gal4; UAS-EB1-GFP-Aktien , die in dieser Studie verwendet wurden. Wir danken Dr. Jennifer Waters und Dr. Anna Jost vom Nikon Imaging Center in Harvard für ihre Expertise in der Lichtmikroskopie. Diese Arbeit wird von den National Institutes of Health (F31 NS101756-03 bis V.T.C., SBIR 1R43MH100780-01D bis J.S.L.) finanziert.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubeEppendorf21008-959Sample preparation
1000 µL TipOne pipette tipsUSA Scientific1111-2721Sample preparation
200 µL TipOne pipette tipsUSA Scientific1120-8710Sample preparation
221-Gal4 fliesBloomington Drosophila Stock Center (US)26259Drosophila genetics/crosses
60x Objective LensNikonPlan Apo 60x OilImage acquisition
6-well plateBD Falcon353224Sample preparation
AgarMoorAgar41084Drosophila food
AiviaDRVision LLCOptimized as part of this study
Chloroform (stabilized with amylenes)Sigma-AldrichC2432Sample preparation
CO2 blowgun (for selection of flies for crosses)Genesee54-104Drosophila genetics/crosses
CO2 bubbler (for selection of flies for crosses)Genesee59-180Drosophila genetics/crosses
Cooled CCD cameraHamamatsuORCA-R2Image acquisition
CornmealGenesee62-101Drosophila food
Distilled WaterDrosophila food
Double-sided tapeScotchSample preparation
Drosophila vialsGenesee32-109Drosophila food
Droso-plugs (foam plugs for vials)Genesee59-200Drosophila food
Dumont #5 Biologie Inox ForcepsFine Science Tools11252-20Sample preparation
elaV-Gal4;UAS-EB1-GFP;UAS-Dcr2 fliesGift of Melissa Rolls (Penn State University)N/ADrosophila genetics/crosses
Ethanol (95%)VWR75811-022Drosophila food
Fiber optic illuminator/light source for stereomicroscopeNikonNI-150Sample preparation
Flypad (for selection of flies for crosses)Genesee59-172Drosophila genetics/crosses
Forma Environmental Chamber/IncubatorThermoFisher3940Drosophila genetics/crosses
Halocarbon oil 700Sigma-AldrichH8898Sample preparation
Immersion OilNikonMXA22168Image acquisition
Kimwipe Delicate WipesFisher Scientific34120Sample preparation
Laser Merge ModuleSpectral Applied ResearchLMM-5Image acquisition
Light Source for ConfocalLumencorSOLA 54-10021Image acquisition
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis SoftwareMolecular DevicesImage acquisition
Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2 (#1.5)VWR48366-205Sample preparation
Motorized inverted microscope with Perfect Focus SystemNikonTI-ND6-PFS-SImage acquisition
Motorized stage and shuttersPriorProscan IIIImage acquisition
Multi-purpose scissorsScotchMMM1428Sample preparation
Nail PolishSally Hansen784179032016 074170382839Sample preparation
Optical FilterChromaET480/40mImage acquisition
P1000 PipetmanGilsonF123602Sample preparation
P200 PipetmanGilsonF123601Sample preparation
PBS (10X) ph 7.4ThermoFisher70011044Sample preparation
Propionic AcidFisherA258-500Drosophila food
Spinning disk confocal scanner unitYokagawaCSU-X1Image acquisition
StereomicroscopeNikonSMZ800NSample preparation
Sugar (Sucrose)Genesee62-112Drosophila food
Superfrost SlideVWR48311-600Sample preparation
TegoseptGenesee20-258Drosophila food
UAS-dtacc-RNAi fliesVienna Drosophila Resource Center (Vienna, Austria)VDRC-101439Drosophila genetics/crosses
Vaseline petroleum jellyWB MasonDVOCB311003Sample preparation
Winsor & Newton Brush Regency Gold 520, Size 0Staples5012000Drosophila genetics/crosses
YeastVWRTorula Yeast IC90308580Drosophila food
Yokogawa dichroic beamsplitterSemrockDi01-T405/488/568/647-13x15x0.5Image acquisition

Referenzen

  1. Rolls, M. M. Neuronal polarity in Drosophila: Sorting out axons and dendrites. Developmental Neurobiology. 71 (6), 419-429 (2011).
  2. Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: Mechanisms of dendritic arborization. Nature Reviews Neuroscience. 11 (5), 316-328 (2010).
  3. Lewis, T. L., Courchet, J., Polleux, F. Cell biology in neuroscience: Cellular and molecular mechanisms underlying axon formation, growth, and branching. Journal of Cell Biology. 202 (6), 837-848 (2013).
  4. Kandel, E. R. The Molecular Biology of Memory Storage: A Dialogue Between Genes and Synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
  5. Turney, S. G., Lichtman, J. W. Chapter 11: Imaging Fluorescent Mice In Vivo Using Confocal Microscopy. Methods in Cell Biology. 89 (8), 309-327 (2008).
  6. McCann, C. M., Lichtman, J. W. In vivo imaging of presynaptic terminals and postsynaptic sites in the mouse submandibular ganglion. Developmental Neurobiology. 68 (6), 760-770 (2008).
  7. Turney, S. G., Walsh, M. K., Lichtman, J. W. In vivo imaging of the developing neuromuscular junction in neonatal mice. Cold Spring Harbor Protocols. 7 (11), 1166-1176 (2012).
  8. Tanaka, E., Ho, T., Kirschner, M. W. The role of microtubule dynamics in growth cone motility and axonal growth. Journal of Cell Biology. 128 (1-2), 139-155 (1995).
  9. Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. Journal of Cell Biology. 115 (2), 345-363 (1991).
  10. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  11. Tirnauer, J. S., Bierer, B. E. EB1 proteins regulate microtubule dynamics, cell polarity, and chromosome stability. Journal of Cell Biology. 149 (4), 761-766 (2000).
  12. Schwartz, K., Richards, K., Botstein, D. BIM1 encodes a microtubule-binding protein in yeast. Molecular Biology of the Cell. 8 (12), 2677-2691 (1997).
  13. Juwana, J. P., et al. EB/RP gene family encodes tubulin binding proteins. International Journal of Cancer. 81 (2), 275-284 (1999).
  14. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (4), 309-322 (2008).
  15. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: Two ends in the limelight. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (12), 711-726 (2015).
  16. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic Instability of microtubule growth. Nature. 312 (15), 237-242 (1984).
  17. Van De Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A. Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).
  18. Rebollo, E., Karkali, K., Mangione, F., Martín-Blanco, E. Live imaging in Drosophila: The optical and genetic toolkits. Methods. 68 (1), 48-59 (2014).
  19. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nature Reviews Genetics. 6 (1), 9-23 (2005).
  20. Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila. Neuron. 22 (4), 719-729 (1999).
  21. Miller, K. E., et al. Direct observation demonstrates that Liprin-alpha is required for trafficking of synaptic vesicles. Current Biology. 15 (7), 684-689 (2005).
  22. Rao, K., et al. Spastin, atlastin, and ER relocalization are involved in axon but not dendrite regeneration. Molecular Biology of the Cell. 27 (21), 3245-3256 (2016).
  23. Hill, S. E., et al. Development of dendrite polarity in Drosophila neurons. Neural Development. 7, 34(2012).
  24. Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite. Molecular Biology of the Cell. 21 (5), 767-777 (2010).
  25. Mattie, F. J., et al. Directed microtubule growth, +TIPs, and kinesin-2 are required for uniform microtubule polarity in dendrites. Current Biology. 20 (24), 2169-2177 (2010).
  26. Stone, M. C., Roegiers, F., Rolls, M. M. Microtubules Have Opposite Orientation in Axons and Dendrites of Drosophila Neurons. Molecular Biology of the Cell. 19 (10), 4122-4129 (2008).
  27. Rolls, M. M., et al. Polarity and intracellular compartmentalization of Drosophila neurons. Neural Development. 2, 7(2007).
  28. Hu, X., Viesselmann, C., Nam, S., Merriam, E., Dent, E. W. Activity-dependent dynamic microtubule invasion of dendritic spines. Journal of Neuroscience. 28 (49), 13094-13105 (2008).
  29. Merriam, E. B., et al. Dynamic microtubules promote synaptic NMDA receptor-dependent spine enlargement. PLoS One. 6 (11), 27688(2011).
  30. Hu, X., et al. BDNF-induced increase of PSD-95 in dendritic spines requires dynamic microtubule invasions. Journal of Neuroscience. 31 (43), 15597-15603 (2011).
  31. Merriam, E. B., et al. Synaptic regulation of microtubule dynamics in dendritic spines by calcium, F-actin, and drebrin. Journal of Neuroscience. 33 (42), 16471-16482 (2013).
  32. Jaworski, J., et al. Dynamic Microtubules Regulate Dendritic Spine Morphology and Synaptic Plasticity. Neuron. 61 (1), 85-100 (2009).
  33. Dent, E. W. Of microtubules and memory: Implications for microtubule dynamics in dendrites and spines. Molecular Biology of the Cell. 28 (1), 1-8 (2017).
  34. Yan, Y., Broadie, K. In vivo assay of presynaptic microtubule cytoskeleton dynamics in Drosophila. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 198-205 (2007).
  35. Pawson, C., Eaton, B. A., Davis, G. W. Formin-dependent synaptic growth: evidence that Dlar signals via Diaphanous to modulate synaptic actin and dynamic pioneer microtubules. Journal of Neuroscience. 28 (44), 11111-11123 (2008).
  36. Ruiz-Cañada, C., Budnik, V. Synaptic cytoskeleton at the neuromuscular junction. International Review of Neurobiology. 75 (6), 217-236 (2006).
  37. Bodaleo, F. J., Gonzalez-Billault, C. The presynaptic microtubule cytoskeleton in physiological and pathological conditions: lessons from Drosophila Fragile X syndrome and hereditary spastic paraplegias. Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 60(2016).
  38. Applegate, K. T., et al. PlusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).
  39. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nature Methods. 7 (9), 761-768 (2010).
  40. Long, J. B., et al. Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics. Molecular and Cellular Biology. 33 (8), 1528-1545 (2013).
  41. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  42. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  43. Ma, Y., Wang, X., Liu, H., Wei, L., Xiao, L. Recent advances in optical microscopic methods for single-particle tracking in biological samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (19), 4445-4463 (2019).
  44. Shen, H., et al. Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications. Chemical Reviews. 117 (11), 7331-7376 (2017).
  45. Zwetsloot, A. J., Tut, G., Straube, A. Measuring microtubule dynamics. Essays in Biochemistry. 62 (6), 725-735 (2018).
  46. Weickert, J. Coherence-Enhancing Diffusion Filtering. International Journal of Computer Vision. 31 (2-3), 111-127 (1999).
  47. Peset, I., Vernos, I. The TACC proteins: TACC-ling microtubule dynamics and centrosome function. Trends in Cell Biology. 18 (8), 379-388 (2008).
  48. Hood, F. E., Royle, S. J. Pulling it together. Bioarchitecture. 1 (3), 105-109 (2011).
  49. Lucaj, C. M., et al. Xenopus TACC1 is a microtubule plus-end tracking protein that can regulate microtubule dynamics during embryonic development. Cytoskeleton. 72 (5), 225-234 (2015).
  50. Nwagbara, B. U., et al. TACC3 is a microtubule plus end-tracking protein that promotes axon elongation and also regulates microtubule plus end dynamics in multiple embryonic cell types. Molecular Biology of the Cell. 25 (21), 3350-3362 (2014).
  51. Rutherford, E. L., et al. Xenopus TACC2 is a microtubule plus end-tracking protein that can promote microtubule polymerization during embryonic development. Molecular Biology of the Cell. 27 (20), 3013-3020 (2016).
  52. Chou, V. T., Johnson, S., Long, J., Vounatsos, M. dTACC restricts bouton addition and regulates microtubule organization at the Drosophila neuromuscular junction. Cytoskeleton. 77 (1-2), 4-15 (2019).
  53. Maiato, H., et al. Human CLASP1 Is an Outer Kinetochore Component that Regulates Spindle Microtubule Dynamics. Cell. 113 (7), 891-904 (2003).
  54. Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. Life cycle of MTs persistent growth in the cell interior , asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary. Journal of Cell Science. 115, Pt 17 3527-3539 (2002).
  55. Greenspan, R. J. Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).
  56. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: A primer on the drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
  57. Waters, J. C. Live-cell fluorescence imaging. Methods in Cell Biology. 114, 125-150 (2007).
  58. Berger, C., Renner, S., Lüer, K., Technau, G. M. The commonly used marker ELAV is transiently expressed in neuroblasts and glial cells in the Drosophila embryonic CNS. Developmental Dynamics. 236 (12), 3562-3568 (2007).
  59. Robinow, S., White, K. Characterization and spatial distribution of the ELAV protein during Drosophila melanogaster development. Journal of Neurobiology. 22 (5), 443-461 (1991).
  60. Parrish, J. Z., Kim, M. D., Lily, Y. J., Yuh, N. J. Genome-wide analyses identify transcription factors required for proper morphogenesis of Drosophila sensory neuron dendrites. Genes and Development. 20 (7), 820-835 (2006).
  61. Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons. Cell. 112 (6), 805-818 (2003).
  62. Zhang, T., et al. Microtubule plus-end binding protein EB1 is necessary for muscle cell differentiation, elongation and fusion. Journal of Cell Science. 122 (9), 1401-1409 (2009).
  63. Yang, C., et al. EB1 and EB3 regulate microtubule minus end organization and Golgi morphology. Journal of Cell Biology. 216 (10), 3179-3198 (2017).
  64. Allison, A., Nunn, J. Effect of general anaesthetics on microtubules. Lancet. 292 (7582), 1326-1329 (1968).
  65. Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, drosophila and zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (67), e3780(2012).
  66. Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments. (84), e50998(2014).
  67. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible neurotechnique cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (5), 451-461 (1999).
  68. Resh, M. D. Fatty acylation of proteins: New insights into membrane targeting of myristoylated and palmitoylated proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1451 (1), 1-16 (1999).
  69. Edwards, K. A., Demsky, M., Montague, R. A., Weymouth, N., Kiehart, D. P. GFP-moesin illuminates actin cytoskeleton dynamics in living tissue and demonstrates cell shape changes during morphogenesis in Drosophila. Developmental Biology. 191 (1), 103-117 (1997).
  70. Riedl, J., et al. Lifeact a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  71. Dent, E. W., Kalil, K. Axon Branching Requires Interactions between Dynamic Microtubules and Actin Filaments. Journal of Neuroscience. 21 (24), 9757-9769 (2001).
  72. Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones. Journal of Cell Biology. 158 (1), 139-152 (2002).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Weitere Artikel entdecken

3D PartikelverfolgungNichtinvasive AnalyseDynamik synaptischer MikrotubuliDendritenNeuromuskul re VerbindungenDrosophilaMikrotubuliLive BildgebungAutomatisierte AnalyseEB1 GFPMT assoziiertes ProteinDTACC KnockdownMultiparametrische AnalyseVerhalten auf PolymerebeneZellul re Morphologie

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Kontakt

BIBLIOTHEKS-EMPFEHLUNG

JoVE-Newsletter

Forschung

Lehre

Autoren

Bibliothekare

ÜBER JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten