JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом исследовании представлена неинвазивная стратегия визуализации прижизненных нейронов в сочетании с новой программной стратегией для достижения автоматизированного, непредвзятого отслеживания и анализа динамики плюс-конца микротрубочек (МТ) in vivo в сенсорных дендритах и нервно-мышечных соединениях дрозофилы.

Аннотация

Микротрубочки (МТ) играют важнейшую роль в развитии нейронов, но остается много вопросов о молекулярных механизмах их регуляции и функции. Кроме того, несмотря на прогресс в понимании постсинаптических МТ, гораздо меньше известно о вкладе пресинаптических МТ в морфогенез нейронов. В частности, исследования динамики МТ in vivo в сенсорных дендритах дрозофилы позволили получить значительное представление о поведении на уровне полимеров. Тем не менее, технические и аналитические проблемы, связанные с визуализацией нервно-мышечного перехода мухи (NMJ) в реальном времени, ограничили сопоставимые исследования пресинаптической динамики МТ. Более того, несмотря на то, что существует множество высокоэффективных программных стратегий для автоматизированного анализа динамики МТ in vitro и ex vivo, данные in vivo часто требуют значительного вмешательства оператора или полностью ручного анализа из-за изначально низкого соотношения сигнал/шум на изображениях и сложной клеточной морфологии.  Чтобы решить эту проблему, в этом исследовании была оптимизирована новая программная платформа для автоматизированного и непредвзятого обнаружения частиц in vivo. Был проведен многопараметрический анализ конфокальных изображений меченых EB1-GFP МТ в режиме реального времени как в дендритах, так и в NMJ личинок дрозофилы, и был обнаружен поразительные различия в поведении МТ. Кроме того, была проанализирована динамика МТ после нокдауна МТ-ассоциированного белка (MAP) dTACC, ключевого регулятора развития синапсов дрозофилы, и выявлены статистически значимые изменения в динамике МТ по сравнению с диким типом. Эти результаты демонстрируют, что эта новая стратегия для автоматизированного многопараметрического анализа пре- и постсинаптической динамики МТ на уровне полимеров значительно снижает критерии «человек в контуре». Кроме того, исследование показывает полезность этого метода в выявлении различий в поведении МТ при dTACC-нокдауне, что указывает на возможное будущее применение для функциональных экранов факторов, регулирующих динамику МТ in vivo. Будущие применения этого метода могут быть также сосредоточены на выяснении типа клеток и/или специфичного для компартмента поведении МТ, а также на многоцветной коррелятивной визуализации EB1-GFP с другими клеточными и субклеточными маркерами, представляющими интерес.

Введение

Клетки организуются для формирования функциональных структур за счет координации внутри- и межклеточных изменений посредством морфогенеза. Замечательным примером морфогенеза является развитие высокоспециализированной структуры нейронов. Нейроны демонстрируют замечательную поляризацию, в которой они расширяют два структурно и функционально различных типа процессов, дендриты и аксоны, которые могут достигать огромных длин. Сложность развития нейронов возникает не только из-за огромных размеров дендритов и аксонов, но и из-за трудности формирования их замысловато разветвленной геометрии. Морфогенез нейронов и его последствия для обучения ипамяти4 мотивируют продолжающееся исследование как генетического контроля над ним, так и лежащих в его основе биологических механизмов клетки. Такие механизмы включают, помимо прочего, внутриклеточный мембранный транспорт и многочисленные перестройки цитоскелета, необходимые для изменений морфологии нейронов 1,2,3.

Исследования морфогенеза нейронов привели к появлению множества передовых методов визуализации. Статические методы, такие как электронная микроскопия или флуоресцентная микроскопия неподвижных зондов, широко используются для проведения морфологического и структурного анализа с высоким разрешением. Однако, помимо артефактов, которые неизбежны при любом методе сохранения, статическая визуализация не может охватить динамические изменения, лежащие в основе морфогенеза. Таким образом, многие ключевые идеи были получены в результате покадровой флуоресцентной микроскопии живых тканей. В ранних работах Лихтмана и его коллег 5,6,7 использовалась визуализация нервной системы млекопитающих in vivo для изучения регенерации/дегенерации аксонов, организации синаптических компонентов и транспорта аксонов на большие расстояния. Кроме того, исследования первичных нейрональных эксплантов имели решающее значение для установления важности динамики микротрубочек (МТ) для удлинения и подвижности аксонов 8,9. Важно отметить, что в ранних исследованиях эксплантов нейронов было установлено использование флуоресцентно помеченных белков семейства связывающих концов (БЭ) для получения бесценной информации о динамике МТ плюс-энд в развивающихся нейронах на уровне отдельныхполимеров МТ. Эти исследования возникли на основании наблюдений за тем, что член семейства EB1 преимущественно локализуется до МТ плюс окончание11 у S. cerevisiae12 и в культивируемых клетках13. С тех пор EB1 и другие белки отслеживания плюс-кончиков (+TIP)14,15 широко используются в in vivo исследованиях динамической нестабильности МТ16, в том числе в контексте развития нейронов17.

Дрозофила является мощной моделью для визуализационных исследований динамики МТ во время развития нейронов in vivo благодаря обширным генетическим и визуализирующим инструментам, доступным для изучения мух18,19, а также сходству в структуре и функциях между дрозофилой и нейронами позвоночных1. В ключевом раннем исследовании нервно-мышечного соединения (NMJ) личинок дрозофилы была выполнена повторная неинвазивная визуализация маркера флуоресцентной мембраны через полупрозрачную кутикулу интактных животных для документирования пресинаптического терминального морфогенеза20. С помощью метода, аналогичного изображению целых живых личинок дрозофилы,была получена первоначальная демонстрация субклеточного анализа на уровне частиц процессивного движения моторных грузов в аксонах. Совсем недавно тщательные исследования Роллса и его коллег на сенсорных дендритах интактных личинок дрозофилы 22,23,24,25,26,27 охарактеризовали постсинаптическую динамику MT-плюс-энда путем отслеживания частиц и анализа EB1, помеченных зеленым флуоресцентным белком (GFP). Такие исследования на дрозофилах 22,23,24,25,26,27 и других системах 28,29,30,31,32 значительно углубили понимание поведения монополимера МТ плюс концы в дендритах развивающихся нейронов 33.

Несмотря на впечатляющие in vivo исследования динамики постсинаптической МТ 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31, было проведено гораздо меньше сопоставимых исследований пресинаптической динамики МТ на развивающемся аксонном терминале. Динамика МТ в NMJ личинок дрозофилы была изучена с помощью флуоресцентной спекл-микроскопии (ФСМ) и восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP)34. Эти методы оценивают общую кинетику тубулина, но не поведение отдельных концов MT plus. На момент написания этой статьи было проведено единственное исследование отдельных МТ плюс концов в НМЖ дрозофилы: это исследование сочетало покадровую визуализацию в реальном времени с ручным анализом кимографов для характеристики популяции динамических EB1-GFP, помеченных как «новаторские МТ», которые отличались от более широкой популяции стабилизированных МТ35. Этот недостаток исследований пресинаптической динамики МТ может быть обусловлен, по крайней мере частично, анатомией: в то время как получить изображения дендритов относительно просто из-за их близости к личиночной кутикуле, NMJ блокируются другими тканями, что затрудняет получение изображений с достаточным соотношением сигнал/шум для анализа на уровне частиц. Тем не менее, учитывая хорошо установленную важность пресинаптических МТ для синаптического морфогенеза и стабилизации36, а также их связь с нейроразвитием и нейродегенеративными расстройствами37, преодоление этого разрыва между пониманием пре- и постсинаптических МТ, вероятно, приведет к бесценным выводам.

Дополнительной проблемой для анализа динамики МТ in vivo в целом, в отличие от анализа in vitro или ex vivo, является ограниченность автоматизированных программных инструментов, которые могут извлекать динамические параметры из данных in vivo. В настоящее время одним из самых популярных и мощных методов анализа МТ плюс, меченных +TIP, является plusTipTracker38,39, программное обеспечение на базе MATLAB, которое позволяет автоматически отслеживать и анализировать множественные динамические параметры. Примечательно, что plusTipTracker измеряет не только рост MT, но и сокращение и спасение: в то время как метки +TIP, такие как EB1-GFP, ассоциируются только с растущими плюсами, plusTipTracker может алгоритмически определять темпы усадки и спасательные события. Однако, в то время как plusTripTracker был очень успешно применен во многих контекстах, включая предыдущий многопараметрический анализ динамики МТ ex vivo в клетках Drosophila S240, plusTipTracker не является оптимальным для анализа данных in vivo, учитывая их более низкое отношение сигнал/шум. В результате, in vivo исследования плюсовой динамики на дендритах 22,23,24,25,26,27 и на NMJ35 дрозофилы основывались на ручном создании и анализе кимографов с использованием программного обеспечения, такого как ImageJ 41, или на полуавтоматических стратегиях, которые включают в себя многочисленные компоненты «человек в контуре».

В этом исследовании представлен экспериментальный и аналитический рабочий процесс, который снижает экспериментальные и аналитические затраты, необходимые для выполнения неинвазивного анализа пресинаптической динамики МТ на уровне полимеров как в сенсорных дендритах, так и в терминале моторных аксонов личинок третьего возраста дрозофилы. Протокол использует обездвиженных, неповрежденных личинок и, таким образом, позволяет избежать травм, которые, как известно, вызывают стрессовые реакции, а также другие нефизиологические состояния, которые могут нарушить динамику МТ in vivo. Для обозначения динамических плюс-эндов МТ EB1-GFP экспрессируется паннейронально с помощью системы 42 Gal4/UAS, что позволяет визуализировать МТ как на дендритах, так и на NMJ с помощью одного драйвера. В то время как некоторые ранние шаги, такие как отбор образцов животных и идентификация областей для изображения, неизбежно зависят от принятия решений человеком, следующие за ними этапы сбора данных в значительной степени автоматизированы. Важно отметить, что оптимизация нового программного обеспечения позволила провести автоматизированный, непредвзятый анализ, требующий минимального участия человека. В то время как доступны и другие методы отслеживания частиц 43,44,45, в этом исследовании используется запатентованное программное обеспечение, потому что оно алгоритмически хорошо подходит для решения конкретных задач этого конкретного набора данных. Программное обеспечение теперь доступно пользователям для различных приложений. В частности, использование диффузионной фильтрации46, повышающей когерентность, является неотъемлемой частью автоматизированной сегментации и удаления фона, а специализированные алгоритмы реализуются специально для автоматизации обнаружения и отслеживания частиц. Эта стратегия может эффективно справляться с низким соотношением сигнал/шум, присущим данным данного исследования, а также с другими проблемами, такими как движение комет EB1-GFP через различные фокальные плоскости. Несмотря на то, что невозможно всесторонне протестировать производительность этого программного обеспечения по сравнению со всеми другими программами для анализа частиц, производительность настоящей стратегии равна или приближается к стандартной производительности человека. Кроме того, насколько известно авторам, не существовало другого программного обеспечения, специально обученного на данных in vivo от сенсорных дендритов и пресинаптического терминала. Учитывая, что производительность алгоритмов анализа изображений часто очень специфична для данных, для которых они были разработаны, и что обобщенное компьютерное зрение пока невозможно, ожидается, что обучение описываемого программного обеспечения конкретным данным in vivo, представляющим интерес, является наиболее алгоритмически обоснованным подходом.

Учитывая обширную работу по дендритным МТ 22,23,24,25,26,27, а также стабильное качество данных, которые могут быть получены с помощью этой системы, стратегия получения изображений и программного анализа была впервые проверена на сенсорных дендритах дрозофилы. Важно отметить, что у дендритов было обнаружено, что использование различных нейронных драйверов Gal4, даже в остальном идентичных диких типах, приводит к значительным различиям в динамике EB1-GFP из-за различий в генетическом фоне, что подчеркивает важность использования одного драйвера Gal4 для получения стабильных результатов. В дальнейшем эта стратегия была использована для многопараметрического анализа динамики EB1-GFP на пресинаптическом терминале NMJ. Чтобы еще больше проиллюстрировать исследовательскую ценность этого метода, эта стратегия визуализации и программного обеспечения была использована для оценки как пре-, так и постсинаптической динамики EB1-GFP после нокдауна dTACC, гомолога дрозофилы высококонсервативного семейства TACC (трансформирующая кислотная спиральная катушка)47,48. Предыдущая работа с клетками40 S2 дрозофилы, а также работа Лоури и его коллег с конусом роста Xenopus 49,50,51 показали, что члены семейства TACC регулируют динамику МТ плюс-энд. Кроме того, недавно опубликованные данные конфокальной и иммунофлуоресцентной визуализации со сверхвысоким разрешением показали, что dTACC является ключевым регулятором пресинаптических МТ во время морфогенеза нейронов52, что поднимает вопрос о том, регулирует ли dTACC динамику МТ в реальном времени. В этом отчете демонстрируется метод, который действительно может выявить различия в поведении машинного перевода в реальном времени после нокдауна dTACC. Таким образом, в данном исследовании представлен метод in vivo, который может эффективно идентифицировать и охарактеризовать ключевые регуляторы динамики МТ в развивающемся нейроне, особенно в пресинаптическом компартменте.

протокол

1. Генерация экземпляров дрозофилы

  1. Выберите подходящий маркер MT plus-end. В этом исследовании использовался тегированный GFP EB1, хорошо охарактеризованный плюс-энд маркер с сильным, четким сигналом11,12. Альтернативы включают другие +TIP, такие как EB310,13, CLASP/Orbit53 и CLIP-17054.
  2. Получение или генерация мух с помощью маркера MT под контролем промотора БАС (например, UAS-EB1-GFP).
  3. Выберите подходящий тканеспецифический Gal4-драйвер. В этом исследовании использовался паннейрональный драйвер elaV-Gal458,59 для управления экспрессией как в сенсорных дендритах, так и в NMJ и 221-Gal460,61 для специфической экспрессии дендритов.
  4. Выращивание мух, используя стандартные методы разведения мух 55,56. Рекомендуется содержать мух во увлажненных инкубаторах при температуре 25 °C для оптимальной экспрессии Gal4/UAS.
  5. Используя стандартные генетические методымух 55,56, выполнять скрещивание для получения мух для экспрессии маркера MT plus-end в желаемых клетках/тканях.
    Примечание: Для любой комбинации Gal4-драйвера и -трансгена экспериментальный план должен включать в себя эксперименты по проверке концепции и валидации, чтобы охарактеризовать систему и избежать артефактов от сверхэкспрессии.

2. Настройка оборудования

  1. Установите рабочую станцию, включающую мух, обезболивающие реагенты, материалы для изготовления предметного стекла, стереомикроскоп и источник освещения, рядом с конфокальным микроскопом (т.е. в одной комнате), чтобы свести к минимуму время, затрачиваемое между пробоподготовкой и визуализацией, чтобы продлить здоровье и жизнеспособность личинок.
  2. Приготовьте обезболивающее средство, смешав 9% смесь хлороформа (0,1 мл хлороформа и 1,0 мл галоидоуглеродного масла) в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл. Чтобы избежать расслоения, хорошо перемешивайте, переворачивая трубку перед приготовлением каждого нового предметного стекла.
  3. Подготовьте предметное стекло: Отрежьте четыре полоски двустороннего скотча (шириной ~15 мм). Выровняйте две части на предметном стекле, оставив пространство ~5 мм между полосками. Наложите оставшиеся два куска поверх первых двух, чтобы удвоить толщину ленты (Рисунок 1C).
  4. Добавьте большую каплю (~100 μл) смеси хлороформа и масла на предметное стекло в пространстве 5 мм между кусочками ленты (Рисунок 1C).

3. Подготовка образцов личинок к визуализации

  1. Наполните контейнер (например, 6-луночную тарелку) 1x PBS.
  2. Соберите личинки3-го возраста из флакона от мухи с помощью щипцов или аналогичного инструмента. Идентифицируйте личинок на соответствующей стадии по их ползающему поведению и наличию 9–12 заметных зубчатых крючков для рта. Используйте стереомикроскоп для определения стадии личинок (Рисунок 1D).
  3. Поместите личинку в PBS и осторожно переместите ее, чтобы смыть остатки пищи или другой мусор. Аккуратно высушите личинку на нежной ткани.
  4. Обезболите личинку, поместив ее в каплю хлороформа/масла на предметном стекле из секции 2 (рисунок 1C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дорсальная/вентральная ориентация личинки не имеет решающего значения, поскольку как сенсорные, так и моторные нейроны могут быть обнаружены через полупрозрачную кутикулу путем установки предметного столика микроскопа в правильную фокальную плоскость, независимо от ориентации образца.
  5. Поместите сверху покровный лист #1.5. Приклейте покровное стекло к ленте, слегка надавливая, таким образом обездвиживая личинку, не повреждая ее (рисунок 1С).
  6. Запечатайте камеру вазелином или лаком для ногтей.

4. Покадровая конфокальная визуализация живых образцов

  1. Подготовьте конфокальный микроскоп и объектив с 60-кратным увеличением с масляной иммерсией. Поместите образец на предметный столик (рис. 1A, B).
  2. Используйте программное обеспечение для сбора данных для настройки экспериментов.
    Примечание: В этом исследовании каждая серия изображений была получена в одной фокальной плоскости, а не в z-стеке.
    1. Установите продолжительность интервальной съемки равной 30 с интервалом 2 с, всего 16 кадров.
    2. Установите экспозицию и интенсивность лазера, чтобы обеспечить достаточный сигнал, избегая насыщения и фотообесцвечивания.
    3. Для визуализации EB1-GFP лазер с длиной волны 488 нм был настроен на время экспозиции 100 мс и интенсивность 30%. Эти значения могут варьироваться при различных вариантах использования данного протокола и должны быть изменены эмпирически.
  3. С помощью окуляров микроскопа найдите личинку в широкопольном зеленом освещении. Найдите дендриты или NMJ, медленно регулируя сцену. Не подвергайте личинку освещению (широкопольному или конфокальному) дольше, чем это необходимо.
    1. Дендриты выглядят как тонкие ярко-зеленые паутины нервов, легко отличимые от толстых длинных пучков аксонов (рис. 1Е).
    2. NMJ проявляются в виде групп ярко-зеленых отдельных бутонов диаметром около 5 мкм на концах толстых длинных пучков аксонов, которые расходятся от нервного канатика (рис. 1F).
  4. Используя прямую трансляцию с камеры, быстро сфокусируйтесь на интересующей области с помощью подсветки 488 нм. Немедленно прекратите освещение, как только будет найден правильный фокус, чтобы избежать фототоксичности.
  5. Инициируйте получение изображения. Кометы EB1 узнаваемы как яркие, подвижные точки.
  6. Обратитесь к ранее опубликованным протоколам для получения дополнительной информации и рекомендаций по флуоресцентной визуализации в реальном времени57.

5. Обработка и анализ изображений на основе программного обеспечения

  1. Анализируйте каждый видеофайл по отдельности. В программном обеспечении (пользовательский интерфейс показан на рисунке 2) выберите File | Импорт | Последовательность изображений и перетащите файлы TIF в появившееся поле. Просмотрите видео.
  2. В меню «Параметры обнаружения » настройте параметры программного обеспечения, чтобы обеспечить обнаружение только четко видимых точек и избежать обнаружения ложных объектов. Например, снижение интенсивности частиц приводит к большей чувствительности программного обеспечения к точкам, но увеличивает потенциальные ложные срабатывания. Точные значения параметров будут варьироваться эмпирически. Описания параметров обнаружения и слежения доступны у авторов по запросу.
  3. Примените рецепт Neuron Particle Tracking для анализа изображения с помощью кнопки «С начала » (синяя стрелка, рисунок 2B). Программное обеспечение выведет результаты по параметрам отслеживания, перечисленным в таблице 1, в таблицу результатов (зеленое поле, рисунок 2B). Для упрощения последующего анализа и интерпретации результаты могут быть сохранены в программном обеспечении для работы с электронными таблицами с помощью функции «Экспорт », расположенной в разделе «Таблица результатов ».
  4. Наведите курсор к пунктам, обнаруженным на предыдущем шаге, и щелкните левой кнопкой мыши , чтобы выбрать или отменить выделение. Несколько точек можно выбрать одновременно с помощью Ctrl + щелчок левой кнопкой мыши.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от целей проекта и приложений, для фильтрации точек могут использоваться дополнительные эвристики. Например, точки со временем жизни менее 8–10 с (4–5 кадров) могут быть опущены, потому что они не предоставляют достаточной информации обо всем событии роста. Потребность в таких эвристиках будет варьироваться эмпирически. Дополнительную информацию о функциональных возможностях программного обеспечения можно получить у авторов по запросу.

Результаты

Мухи были выращены из стабильных стад, которые конститутивно экспрессируют трансген UAS-EB1-GFP либо паннейронально (elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP)58,59 или в сенсорных нейронах (221-Gal4; UAS-EB1-GFP)60,61. EB1 был выбран для этого ?...

Обсуждение

В данной работе обсуждается протокол проведения неинвазивной прижизненной визуализации динамики МТ в дендритах и на НМЖ в процессе развития. Участие человека требуется на этапах эксперимента, например, при отборе животных для получения изображений, и может привести...

Раскрытие информации

Авторы Хойин Лай, Майкл Джонс, Хидэки Сасаки, Лучано А.Г. Лукас, Сэм Алворт (ранее) и Джеймс Ши-Джонг Ли являются сотрудниками компании DRVision Technologies LLC, которая производит программное обеспечение, используемое в этом протоколе.

Благодарности

Мы благодарим наших коллег из лаборатории Ван Вактора и из DRVision, а также докторов Макса Хеймана, Паскаля Кезера, Дэвида Пеллмана и Томаса Шварца за полезную дискуссию. Мы благодарим доктора Мелиссу Роллс за щедрое предоставление elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP; UAS-Dcr2 и 221-Gal4; Акции UAS-EB1-GFP , использованные в данном исследовании. Мы благодарим докторов Дженнифер Уотерс и Анну Йост из Центра визуализации Nikon в Гарварде за экспертные знания в области световой микроскопии. Эта работа финансируется Национальными институтами здравоохранения (F31 NS101756-03 to V.T.C., SBIR 1R43MH100780-01D to J.S.L.).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubeEppendorf21008-959Sample preparation
1000 µL TipOne pipette tipsUSA Scientific1111-2721Sample preparation
200 µL TipOne pipette tipsUSA Scientific1120-8710Sample preparation
221-Gal4 fliesBloomington Drosophila Stock Center (US)26259Drosophila genetics/crosses
60x Objective LensNikonPlan Apo 60x OilImage acquisition
6-well plateBD Falcon353224Sample preparation
AgarMoorAgar41084Drosophila food
AiviaDRVision LLCOptimized as part of this study
Chloroform (stabilized with amylenes)Sigma-AldrichC2432Sample preparation
CO2 blowgun (for selection of flies for crosses)Genesee54-104Drosophila genetics/crosses
CO2 bubbler (for selection of flies for crosses)Genesee59-180Drosophila genetics/crosses
Cooled CCD cameraHamamatsuORCA-R2Image acquisition
CornmealGenesee62-101Drosophila food
Distilled WaterDrosophila food
Double-sided tapeScotchSample preparation
Drosophila vialsGenesee32-109Drosophila food
Droso-plugs (foam plugs for vials)Genesee59-200Drosophila food
Dumont #5 Biologie Inox ForcepsFine Science Tools11252-20Sample preparation
elaV-Gal4;UAS-EB1-GFP;UAS-Dcr2 fliesGift of Melissa Rolls (Penn State University)N/ADrosophila genetics/crosses
Ethanol (95%)VWR75811-022Drosophila food
Fiber optic illuminator/light source for stereomicroscopeNikonNI-150Sample preparation
Flypad (for selection of flies for crosses)Genesee59-172Drosophila genetics/crosses
Forma Environmental Chamber/IncubatorThermoFisher3940Drosophila genetics/crosses
Halocarbon oil 700Sigma-AldrichH8898Sample preparation
Immersion OilNikonMXA22168Image acquisition
Kimwipe Delicate WipesFisher Scientific34120Sample preparation
Laser Merge ModuleSpectral Applied ResearchLMM-5Image acquisition
Light Source for ConfocalLumencorSOLA 54-10021Image acquisition
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis SoftwareMolecular DevicesImage acquisition
Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2 (#1.5)VWR48366-205Sample preparation
Motorized inverted microscope with Perfect Focus SystemNikonTI-ND6-PFS-SImage acquisition
Motorized stage and shuttersPriorProscan IIIImage acquisition
Multi-purpose scissorsScotchMMM1428Sample preparation
Nail PolishSally Hansen784179032016 074170382839Sample preparation
Optical FilterChromaET480/40mImage acquisition
P1000 PipetmanGilsonF123602Sample preparation
P200 PipetmanGilsonF123601Sample preparation
PBS (10X) ph 7.4ThermoFisher70011044Sample preparation
Propionic AcidFisherA258-500Drosophila food
Spinning disk confocal scanner unitYokagawaCSU-X1Image acquisition
StereomicroscopeNikonSMZ800NSample preparation
Sugar (Sucrose)Genesee62-112Drosophila food
Superfrost SlideVWR48311-600Sample preparation
TegoseptGenesee20-258Drosophila food
UAS-dtacc-RNAi fliesVienna Drosophila Resource Center (Vienna, Austria)VDRC-101439Drosophila genetics/crosses
Vaseline petroleum jellyWB MasonDVOCB311003Sample preparation
Winsor & Newton Brush Regency Gold 520, Size 0Staples5012000Drosophila genetics/crosses
YeastVWRTorula Yeast IC90308580Drosophila food
Yokogawa dichroic beamsplitterSemrockDi01-T405/488/568/647-13x15x0.5Image acquisition

Ссылки

  1. Rolls, M. M. Neuronal polarity in Drosophila: Sorting out axons and dendrites. Developmental Neurobiology. 71 (6), 419-429 (2011).
  2. Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: Mechanisms of dendritic arborization. Nature Reviews Neuroscience. 11 (5), 316-328 (2010).
  3. Lewis, T. L., Courchet, J., Polleux, F. Cell biology in neuroscience: Cellular and molecular mechanisms underlying axon formation, growth, and branching. Journal of Cell Biology. 202 (6), 837-848 (2013).
  4. Kandel, E. R. The Molecular Biology of Memory Storage: A Dialogue Between Genes and Synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
  5. Turney, S. G., Lichtman, J. W. Chapter 11: Imaging Fluorescent Mice In Vivo Using Confocal Microscopy. Methods in Cell Biology. 89 (8), 309-327 (2008).
  6. McCann, C. M., Lichtman, J. W. In vivo imaging of presynaptic terminals and postsynaptic sites in the mouse submandibular ganglion. Developmental Neurobiology. 68 (6), 760-770 (2008).
  7. Turney, S. G., Walsh, M. K., Lichtman, J. W. In vivo imaging of the developing neuromuscular junction in neonatal mice. Cold Spring Harbor Protocols. 7 (11), 1166-1176 (2012).
  8. Tanaka, E., Ho, T., Kirschner, M. W. The role of microtubule dynamics in growth cone motility and axonal growth. Journal of Cell Biology. 128 (1-2), 139-155 (1995).
  9. Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. Journal of Cell Biology. 115 (2), 345-363 (1991).
  10. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  11. Tirnauer, J. S., Bierer, B. E. EB1 proteins regulate microtubule dynamics, cell polarity, and chromosome stability. Journal of Cell Biology. 149 (4), 761-766 (2000).
  12. Schwartz, K., Richards, K., Botstein, D. BIM1 encodes a microtubule-binding protein in yeast. Molecular Biology of the Cell. 8 (12), 2677-2691 (1997).
  13. Juwana, J. P., et al. EB/RP gene family encodes tubulin binding proteins. International Journal of Cancer. 81 (2), 275-284 (1999).
  14. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (4), 309-322 (2008).
  15. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: Two ends in the limelight. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (12), 711-726 (2015).
  16. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic Instability of microtubule growth. Nature. 312 (15), 237-242 (1984).
  17. Van De Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A. Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).
  18. Rebollo, E., Karkali, K., Mangione, F., Martín-Blanco, E. Live imaging in Drosophila: The optical and genetic toolkits. Methods. 68 (1), 48-59 (2014).
  19. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nature Reviews Genetics. 6 (1), 9-23 (2005).
  20. Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila. Neuron. 22 (4), 719-729 (1999).
  21. Miller, K. E., et al. Direct observation demonstrates that Liprin-alpha is required for trafficking of synaptic vesicles. Current Biology. 15 (7), 684-689 (2005).
  22. Rao, K., et al. Spastin, atlastin, and ER relocalization are involved in axon but not dendrite regeneration. Molecular Biology of the Cell. 27 (21), 3245-3256 (2016).
  23. Hill, S. E., et al. Development of dendrite polarity in Drosophila neurons. Neural Development. 7, 34 (2012).
  24. Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite. Molecular Biology of the Cell. 21 (5), 767-777 (2010).
  25. Mattie, F. J., et al. Directed microtubule growth, +TIPs, and kinesin-2 are required for uniform microtubule polarity in dendrites. Current Biology. 20 (24), 2169-2177 (2010).
  26. Stone, M. C., Roegiers, F., Rolls, M. M. Microtubules Have Opposite Orientation in Axons and Dendrites of Drosophila Neurons. Molecular Biology of the Cell. 19 (10), 4122-4129 (2008).
  27. Rolls, M. M., et al. Polarity and intracellular compartmentalization of Drosophila neurons. Neural Development. 2, 7 (2007).
  28. Hu, X., Viesselmann, C., Nam, S., Merriam, E., Dent, E. W. Activity-dependent dynamic microtubule invasion of dendritic spines. Journal of Neuroscience. 28 (49), 13094-13105 (2008).
  29. Merriam, E. B., et al. Dynamic microtubules promote synaptic NMDA receptor-dependent spine enlargement. PLoS One. 6 (11), 27688 (2011).
  30. Hu, X., et al. BDNF-induced increase of PSD-95 in dendritic spines requires dynamic microtubule invasions. Journal of Neuroscience. 31 (43), 15597-15603 (2011).
  31. Merriam, E. B., et al. Synaptic regulation of microtubule dynamics in dendritic spines by calcium, F-actin, and drebrin. Journal of Neuroscience. 33 (42), 16471-16482 (2013).
  32. Jaworski, J., et al. Dynamic Microtubules Regulate Dendritic Spine Morphology and Synaptic Plasticity. Neuron. 61 (1), 85-100 (2009).
  33. Dent, E. W. Of microtubules and memory: Implications for microtubule dynamics in dendrites and spines. Molecular Biology of the Cell. 28 (1), 1-8 (2017).
  34. Yan, Y., Broadie, K. In vivo assay of presynaptic microtubule cytoskeleton dynamics in Drosophila. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 198-205 (2007).
  35. Pawson, C., Eaton, B. A., Davis, G. W. Formin-dependent synaptic growth: evidence that Dlar signals via Diaphanous to modulate synaptic actin and dynamic pioneer microtubules. Journal of Neuroscience. 28 (44), 11111-11123 (2008).
  36. Ruiz-Cañada, C., Budnik, V. Synaptic cytoskeleton at the neuromuscular junction. International Review of Neurobiology. 75 (6), 217-236 (2006).
  37. Bodaleo, F. J., Gonzalez-Billault, C. The presynaptic microtubule cytoskeleton in physiological and pathological conditions: lessons from Drosophila Fragile X syndrome and hereditary spastic paraplegias. Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 60 (2016).
  38. Applegate, K. T., et al. PlusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).
  39. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nature Methods. 7 (9), 761-768 (2010).
  40. Long, J. B., et al. Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics. Molecular and Cellular Biology. 33 (8), 1528-1545 (2013).
  41. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  42. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  43. Ma, Y., Wang, X., Liu, H., Wei, L., Xiao, L. Recent advances in optical microscopic methods for single-particle tracking in biological samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (19), 4445-4463 (2019).
  44. Shen, H., et al. Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications. Chemical Reviews. 117 (11), 7331-7376 (2017).
  45. Zwetsloot, A. J., Tut, G., Straube, A. Measuring microtubule dynamics. Essays in Biochemistry. 62 (6), 725-735 (2018).
  46. Weickert, J. Coherence-Enhancing Diffusion Filtering. International Journal of Computer Vision. 31 (2-3), 111-127 (1999).
  47. Peset, I., Vernos, I. The TACC proteins: TACC-ling microtubule dynamics and centrosome function. Trends in Cell Biology. 18 (8), 379-388 (2008).
  48. Hood, F. E., Royle, S. J. Pulling it together. Bioarchitecture. 1 (3), 105-109 (2011).
  49. Lucaj, C. M., et al. Xenopus TACC1 is a microtubule plus-end tracking protein that can regulate microtubule dynamics during embryonic development. Cytoskeleton. 72 (5), 225-234 (2015).
  50. Nwagbara, B. U., et al. TACC3 is a microtubule plus end-tracking protein that promotes axon elongation and also regulates microtubule plus end dynamics in multiple embryonic cell types. Molecular Biology of the Cell. 25 (21), 3350-3362 (2014).
  51. Rutherford, E. L., et al. Xenopus TACC2 is a microtubule plus end-tracking protein that can promote microtubule polymerization during embryonic development. Molecular Biology of the Cell. 27 (20), 3013-3020 (2016).
  52. Chou, V. T., Johnson, S., Long, J., Vounatsos, M. dTACC restricts bouton addition and regulates microtubule organization at the Drosophila neuromuscular junction. Cytoskeleton. 77 (1-2), 4-15 (2019).
  53. Maiato, H., et al. Human CLASP1 Is an Outer Kinetochore Component that Regulates Spindle Microtubule Dynamics. Cell. 113 (7), 891-904 (2003).
  54. Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. Life cycle of MTs persistent growth in the cell interior , asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary. Journal of Cell Science. 115, 3527-3539 (2002).
  55. Greenspan, R. J. . Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. , (2004).
  56. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: A primer on the drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
  57. Waters, J. C. Live-cell fluorescence imaging. Methods in Cell Biology. 114, 125-150 (2007).
  58. Berger, C., Renner, S., Lüer, K., Technau, G. M. The commonly used marker ELAV is transiently expressed in neuroblasts and glial cells in the Drosophila embryonic CNS. Developmental Dynamics. 236 (12), 3562-3568 (2007).
  59. Robinow, S., White, K. Characterization and spatial distribution of the ELAV protein during Drosophila melanogaster development. Journal of Neurobiology. 22 (5), 443-461 (1991).
  60. Parrish, J. Z., Kim, M. D., Lily, Y. J., Yuh, N. J. Genome-wide analyses identify transcription factors required for proper morphogenesis of Drosophila sensory neuron dendrites. Genes and Development. 20 (7), 820-835 (2006).
  61. Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons. Cell. 112 (6), 805-818 (2003).
  62. Zhang, T., et al. Microtubule plus-end binding protein EB1 is necessary for muscle cell differentiation, elongation and fusion. Journal of Cell Science. 122 (9), 1401-1409 (2009).
  63. Yang, C., et al. EB1 and EB3 regulate microtubule minus end organization and Golgi morphology. Journal of Cell Biology. 216 (10), 3179-3198 (2017).
  64. Allison, A., Nunn, J. Effect of general anaesthetics on microtubules. Lancet. 292 (7582), 1326-1329 (1968).
  65. Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, drosophila and zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (67), e3780 (2012).
  66. Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments. (84), e50998 (2014).
  67. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible neurotechnique cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (5), 451-461 (1999).
  68. Resh, M. D. Fatty acylation of proteins: New insights into membrane targeting of myristoylated and palmitoylated proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1451 (1), 1-16 (1999).
  69. Edwards, K. A., Demsky, M., Montague, R. A., Weymouth, N., Kiehart, D. P. GFP-moesin illuminates actin cytoskeleton dynamics in living tissue and demonstrates cell shape changes during morphogenesis in Drosophila. Developmental Biology. 191 (1), 103-117 (1997).
  70. Riedl, J., et al. Lifeact a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  71. Dent, E. W., Kalil, K. Axon Branching Requires Interactions between Dynamic Microtubules and Actin Filaments. Journal of Neuroscience. 21 (24), 9757-9769 (2001).
  72. Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones. Journal of Cell Biology. 158 (1), 139-152 (2002).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

3DEB1 GFPMTDTACC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены