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要約

この研究は、ショウジョウバエの感覚樹状突起および神経筋接合部におけるin vivo微小管(MT)プラス末端ダイナミクスの自動化、偏りのない追跡および分析を達成するための新しいソフトウェア戦略と組み合わせた非侵襲的な生体内ニューロンイメージング戦略を示しています。

要約

微小管(MT)は神経細胞の発達に重要な役割を果たしていますが、その調節と機能の分子メカニズムについては多くの疑問が残っています。さらに、シナプス後MTの理解が進んでいるにもかかわらず、シナプス前MTがニューロンの形態形成に寄与していることについては、ほとんど知られていません。特に、ショウジョウバエの感覚樹状突起におけるin vivo MTダイナミクスの研究により、ポリマーレベルの挙動に関する重要な洞察が得られました。しかし、ハエの神経筋接合部(NMJ)のライブイメージングに関連する技術的および分析的な課題は、シナプス前MTダイナミクスの同等の研究が限られています。さらに、in vitroおよびex vivoでのMTダイナミクスの自動解析には、非常に効果的なソフトウェア戦略が多数ありますが、in vivoデータでは、画像のS/N比が本質的に劣り、細胞形態が複雑なため、オペレーターによる大幅な入力や完全に手動による解析が必要になることがよくあります。 これに対処するために、この研究では、自動化された偏りのないin vivo粒子検出のための新しいソフトウェアプラットフォームを最適化しました。EB1-GFP標識MTのライブタイムラプス共焦点画像のマルチパラメトリック解析を、ショウジョウバエ幼虫の樹状突起とNMJの両方で実施し、MTの挙動に顕著な違いを発見しました。さらに、ショウジョウバエのシナプス発生の主要な調節因子であるMT関連タンパク質(MAP)dTACCのノックダウン後にMTダイナミクスを解析し、野生型と比較してMTダイナミクスに統計的に有意な変化を同定しました。これらの結果は、ポリマーレベルでのシナプス前およびシナプス後の両方のMTダイナミクスの自動マルチパラメトリック解析のためのこの新しい戦略が、ヒトインザループ基準を大幅に減少させることを示しています。さらに、この研究は、dTACCノックダウン時に異なるMT挙動を検出する上でのこの方法の有用性を示しており、in vivoでMTダイナミクスを制御する因子の機能スクリーニングへの将来の応用の可能性を示しています。この方法の将来の応用は、細胞タイプおよび/またはコンパートメント特異的なMT挙動の解明、およびEB1-GFPと他の関心のある細胞および細胞内マーカーとのマルチカラー相関イメージングにも焦点を当てる可能性があります。

概要

細胞は、形態形成による細胞内および細胞間の変化の調整を通じて、機能構造を形成するために組織化されます。形態形成の顕著な例は、高度に特殊化されたニューロン構造の発達です。ニューロンは顕著な分極を示し、構造的および機能的に異なる2つのタイプのプロセス、樹状突起と軸索1を拡張し、膨大な長さを達成することができます。ニューロンの発達の複雑さは、樹状突起と軸索の大きさだけでなく、それらの複雑に分岐した形状を形成することの難しさからも生じます2,3。ニューロンの形態形成と、それが学習と記憶に及ぼす影響4は、その遺伝的制御と根底にある細胞生物学的メカニズムの両方について、現在進行中の研究を動機付けています。このようなメカニズムには、細胞内膜輸送およびニューロン形態の変化に必要な多くの細胞骨格再構成が含まれるが、これらに限定されない1,2,3。

神経細胞の形態形成の研究は、さまざまな高度な可視化技術を生み出してきました。電子顕微鏡法や固定プローブの蛍光顕微鏡法などの静的法は、高分解能の形態学的および構造学的分析を行うために広く使用されています。しかし、どのような保存方法にも避けられない人工物を除けば、静的な可視化では、形態形成を支える動的な変化を捉えることはできません。このように、多くの重要な洞察は、生体組織のタイムラプス蛍光顕微鏡から生まれました。Lichtmanらによる初期の研究5,6,7は、哺乳類の神経系のin vivoイメージングを利用して、軸索の再生/変性、シナプス成分の組織化、および長距離の軸索輸送を調査しました。さらに、初代ニューロン外植片における独創的な研究は、軸索伸長および運動性に対する微小管(MT)ダイナミクスの重要性を確立するために重要であった8,9。重要なことに、初期のニューロン外植片研究は、蛍光タグ付き末端結合ファミリータンパク質(EB)の使用を確立し、個々のMTポリマー10のレベルでニューロンを発達させる際のMTプラス末端ダイナミクスに関する貴重な洞察を得ました。これらの研究は、EBファミリーのメンバーであるEB1が、出芽酵母12および培養細胞13においてMTプラス末端11に優先的に局在するという観察結果から生じた。それ以来、EB1およびその他のプラス先端追跡タンパク質(+TIP)14,15は、ニューロン発生17の文脈を含む、MT動的不安定性16のin vivo研究で広く使用されてきた。

ショウジョウバエは、ハエ研究18,19に利用できる膨大な遺伝学的およびイメージングツール、およびショウジョウバエと脊椎動物ニューロン1との間の構造と機能の類似性により、ニューロン発生中のMTダイナミクスのin vivoイメージング研究のための強力なモデルです。ショウジョウバエの幼虫の神経筋接合部(NMJ)に関する重要な初期の研究では、無傷の動物の半透明のキューティクルを介して蛍光膜マーカーの非侵襲的イメージングを繰り返し行い、シナプス前末端形態形成を記録しました20。生きたショウジョウバエの幼虫全体を画像化するのと同様の方法を使用して、軸索内の運動貨物の過程的動きの細胞内粒子レベルの分析の最初のデモンストレーションが提供されました21。最近では、Rolls氏らによる無傷のショウジョウバエ幼虫22、23、24、25、26、27の感覚樹状突起に関する詳細な研究により、緑色蛍光タンパク質(GFP)タグ付きEB1の粒子追跡と分析を行うことにより、シナプス後MTプラス末端ダイナミクスが特徴付けられました。ショウジョウバエ22,23,24,25,26,27および他のシステム28,29,30,31,32におけるこのような研究は、発達ニューロン33の樹状突起におけるMTプラス末端の単一ポリマー挙動の理解を著しく前進させた。

シナプス後MTダイナミクス22,23,24,25,26,27,28,29,30,31の印象的なin vivo研究にもかかわらず、発達中の軸索終末におけるシナプス前MTダイナミクスに関する比較可能な研究ははるかに少ない。ショウジョウバエ幼虫のNMJにおけるMTダイナミクスは、蛍光スペックル顕微鏡(FSM)および光退色後の蛍光回復(FRAP)を用いて研究されている34。これらの手法は、チューブリンの全体的な動態を評価しますが、個々の MT プラス末端の挙動は評価しません。この記事を書いている時点では、ショウジョウバエのNMJにおける個々のMTプラスエンドに関する唯一の調査が行われています:この研究では、ライブタイムラプスイメージングとキモグラフの手動分析を組み合わせて、安定化されたMTの広範な集団とは異なるように見える「先駆的なMT」とラベル付けされた動的なEB1-GFPの集団を特徴付けました35。シナプス前幹細胞のダイナミクスに関する研究が不足しているのは、少なくとも部分的には解剖学によるものかもしれません:樹状突起の画像は幼虫のキューティクルに近いため比較的簡単ですが、NMJは他の組織によって遮られており、粒子レベルの分析に十分なS/N比で画像を取得することは困難です。それにもかかわらず、シナプス前MTがシナプスの形態形成および安定化36、ならびに神経発達および神経変性疾患37との関連において十分に確立された重要性を考慮すると、シナプス前MTとシナプス後MTの理解との間のこのギャップを埋めることは、非常に貴重な洞察をもたらす可能性が高い。

in vitro や ex vivo 解析とは対照的に、一般的な in vivo MT ダイナミクスの解析におけるさらなる課題は、in vivo データからダイナミクスパラメータを抽出できる自動化ソフトウェアツールが限られていることです。現在、+TIPでラベル付けされたMTプラスエンドの分析に最も一般的で強力な手法の1つは、複数のダイナミクスパラメータの自動追跡と分析を可能にするMATLABベースのソフトウェアであるplusTipTracker38,39です。特に、plusTipTrackerはMTの成長だけでなく、縮小とレスキューも測定します:EB1-GFPなどの+TIPラベルは成長するプラスエンドにのみ関連付けられますが、plusTipTrackerはアルゴリズムで収縮率とレスキューイベントを推測できます。しかし、plusTripTrackerは、ショウジョウバエS2細胞40におけるex vivo MTダイナミクスの以前のマルチパラメトリック解析を含む多くの状況に非常に成功裏に適用されていますが、plusTipTrackerは、信号対雑音比が低いため、in vivoデータの解析には最適ではありません。その結果、ショウジョウバエの樹状突起22、23、24、25、26、27およびNMJ35におけるプラスエンドダイナミクスのin vivo研究は、ImageJ41などのソフトウェアを使用したキモグラフの手動生成と解析、または多数のヒューマンインザループコンポーネントを含む半自動戦略に依存してきました。

この研究は、ショウジョウバエの3番目の幼虫の感覚樹状突起と運動軸索終末の両方でシナプス前MTダイナミクスの非侵襲的なポリマーレベルの分析を実行するために必要な実験および分析のオーバーヘッドを削減する実験および分析ワークフローを示しています。このプロトコルは、固定化された無傷の幼虫を利用しているため、ストレス反応を引き起こすことが知られている損傷や、in vivo MTダイナミクスを乱す可能性のある他の非生理学的状態を回避します。動的MTプラスエンドを標識するために、EB1-GFPはGal4/UASシステム42を使用して汎ニューロン的に発現され、単一のドライバーで樹状突起とNMJの両方でMTを可視化できます。動物標本の選別や画像化する領域の特定など、一部の初期段階では必然的に人間の意思決定が左右されますが、データ取得後のステップは大部分が自動化されています。重要なことは、新しいソフトウェアの最適化により、最小限の人的入力で自動化された偏りのない分析が可能になったことです。他の粒子追跡方法も利用可能であるが 43,44,45 、この研究では、この特定のデータセットの特定の課題に対処するのにアルゴリズム的に適していたため、独自のソフトウェアを利用している。このソフトウェアは、さまざまなアプリケーションでユーザーが利用できるようになりました。具体的には、コヒーレンス増強拡散フィルタリング46の使用は、自動セグメンテーションおよびバックグラウンド除去に不可欠であり、カスタムアルゴリズムは、粒子の検出および追跡を自動化するために特に実装される。この戦略は、この研究のデータに固有の低い信号対雑音比だけでなく、EB1-GFP彗星が異なる焦点面を通過するなどの他の課題にも効果的に対処できます。このソフトウェアのパフォーマンスを他のすべての粒子分析ソフトウェアに対して徹底的にテストすることは現実的ではありませんが、現在の戦略のパフォーマンスは、標準的な人間のパフォーマンスと同等またはそれに近づいていました。さらに、著者らの知る限り、感覚樹状突起とシナプス前終末からのin vivoデータで特別に訓練されたソフトウェアは他にありませんでした。画像解析アルゴリズムの性能は、設計対象のデータに非常に特異的であることが多く、一般化されたコンピュータビジョンはまだ可能ではないことを考えると、記載されたソフトウェアを関心のある特定のin vivoデータに学習させることが、アルゴリズム的に最も健全なアプローチであることが期待されます。

樹状突起MT22、23、24、25、26、27に関する広範な研究と、このシステムから取得できるデータの一貫した品質を考慮して、画像取得およびソフトウェア分析戦略は、ショウジョウバエの感覚樹状突起で最初に検証されました。重要なことに、樹状突起では、異なるニューロンGal4ドライバーを使用すると、他の点では同一の野生型バックグラウンドであっても、遺伝的背景の違いによりEB1-GFPダイナミクスに大きな違いが生じることが発見され、一貫した結果を得るために単一のGal4ドライバーを使用することの重要性が強調されています。次に、この戦略は、NMJのシナプス前末端におけるEB1-GFPダイナミクスのマルチパラメトリック解析に使用されました。この方法の調査価値をさらに示すために、このイメージングおよびソフトウェア戦略を使用して、高度に保存されたTACC(トランスフォーミング酸性コイル)ファミリー47,48のショウジョウバエホモログであるdTACCのノックダウン後のシナプス前およびシナプス後EB1-GFPダイナミクスを評価しました。ショウジョウバエS2細胞40における先行研究、ならびにXenopus成長円錐49,50,51におけるLoweryらの研究は、TACCファミリーメンバーがMTプラスエンドダイナミクスを調節していることを示した。さらに、最近報告された共焦点および超解像免疫蛍光イメージングからの証拠は、dTACCがニューロンの形態形成中のシナプス前MTの主要な調節因子であることを示しました52、dTACCが生きたMTダイナミクスを調節するかどうかという疑問を提起しています。このレポートは、dTACCノックダウン時にライブMTの動作の違いを実際に検出できる方法を示しています。したがって、この研究は、発達中のニューロン、特にシナプス前コンパートメント内のMTダイナミクスの主要な調節因子を効果的に特定し、特徴付けることができるin vivoの方法を提示します。

プロトコル

1. ショウジョウバエ標本の作出

  1. 適切なMTプラスエンドマーカーを選択します。この研究では、強力で明確なシグナル11,12を持つ、十分に特徴付けられたプラスエンドマーカーであるGFPタグ付きEB1を利用しました。代替案には、EB310,13、CLASP/Orbit53、CLIP-17054などの他の+TIPが含まれます。
  2. UASプロモーター( UAS-EB1-GFPなど)の制御下でMTマーカーを使用してハエを取得または生成します。
  3. 適切な組織特異的なGal4ドライバーを選択します。この研究では、汎ニューロンドライバーであるelaV-Gal458,59を使用して、感覚樹状突起とNMJの両方で発現を促進し、221-Gal460,61で樹状突起特異的発現を行いました。
  4. 標準的なハエの飼育技術を使用してハエを育てます55,56。ハエは、Gal4/UASの最適な発現のために、25°Cの加湿インキュベーターに保管することをお勧めします。
  5. 標準的なハエ遺伝学的手法55,56を用いて、所望の細胞/組織においてMTプラス末端マーカーを発現するハエを生成するために交配を行う。
    注: Gal4ドライバーと導入遺伝子の組み合わせについては、実験デザインに概念実証および検証実験を含めることで、システムの特性評価を行い、過剰発現によるアーティファクトを回避する必要があります。

2. 機器のセットアップ

  1. ハエ、麻酔試薬、スライド構造材料、実体顕微鏡、照明源などのワークステーションを共焦点顕微鏡の近く(つまり、同じ部屋)に設置して、サンプル調製とイメージングの間の時間を最小限に抑え、幼虫の健康と生存能力を延ばします。
  2. 9%クロロホルム混合物(0.1 mLのクロロホルムと1.0 mLのハロカーボンオイル)を1.5 mLの微量遠心チューブに混合して麻酔薬を調製します。.分離を避けるために、新しいスライドを準備する前に、チューブを反転させてよく混合します。
  3. スライドガラスを準備する:両面テープ(幅~15mm)を4枚カットします。スライドガラスに2つのピースを並べ、ストリップの間に~5mmのスペースを残します。残りの 2 枚を最初の 2 枚の上に重ねて、テープの厚さを 2 倍にします (図 1C)。
  4. スライドガラスのテープ片間5mmのスペースに、クロロホルム/オイル混合物を大粒(~100 μL)加えます(図1C)。

3. イメージングのための幼虫サンプルの調製

  1. 容器(例:6ウェルプレート)に1x PBSを充填します。
  2. 鉗子または同様の器具を使用して、ハエの小瓶から3匹 目の幼虫を採取します。適切な段階で幼虫を這う行動と、9〜12個の目立つ鋸歯状の口フックの存在によって識別します。実体顕微鏡を使用して、幼虫のステージングを支援します(図1D)。
  3. 幼虫をPBSに入れ、そっと動かして、食べ物やその他の破片の残りを洗い流します。幼虫を繊細な組織でやさしく乾かします。
  4. 幼虫をセクション2のスライド上のクロロホルム/オイルドロップに入れて麻酔をかけます(図1C)。
    注:標本の向きに関係なく、顕微鏡のステージを適切な焦点面に設定することにより、感覚ニューロンと運動ニューロンの両方が半透明のキューティクルを通じて検出できるため、幼虫の背側/腹側の向きは重要ではありません。
  5. #1.5カバースリップを上に置きます。穏やかな圧力を加えてカバースリップをテープに接着し、幼虫を傷つけずに固定します(図1C)。
  6. チャンバーをワセリンまたはマニキュアで密封します。

4. ライブサンプルのタイムラプス共焦点イメージング

  1. 共焦点顕微鏡と油浸式の60倍対物レンズを準備します。サンプルをステージに置きます(図1A、B)。
  2. データ収集ソフトウェアを使用して実験を設定します。
    注:この研究では、各イメージングシリーズは、zスタックではなく、単一の焦点面で取得されました。
    1. タイムラプスの持続時間を 30 秒に 2 秒間隔で設定し、合計 16 フレームにします。
    2. レーザーの露出と強度を設定して、飽和や光退色を避けながら十分な信号を確保します。
    3. EB1-GFPイメージングでは、488 nmレーザーを露光時間100 ms、強度30%に設定しました。これらの値は、このプロトコルの異なる用途で異なる場合があり、経験的に変更する必要があります。
  3. 顕微鏡の接眼レンズを使用して、広視野緑色の照明で幼虫を見つけます。樹状突起またはNMJを見つけるには、ステージをゆっくりと調整します。幼虫を必要以上に長時間照明(広視野または共焦点)にさらさないでください。
    1. 樹状突起は、太い長い軸索束と簡単に区別できる、薄く明るい緑色の神経の網として現れます(図1E)。
    2. NMJは、神経索から分岐する太い長い軸索束の末端に、直径約5μmの明るい緑色の個々のボタンのグループとして現れます(図1F)。
  4. ライブカメラフィードを使用して、488nmの照明を使用して関心領域にすばやく焦点を合わせます。光毒性を避けるために、適切な焦点が見つかったらすぐに照明を停止してください。
  5. 画像取得を開始します。EB1彗星は、明るく運動性の涙点として認識できます。
  6. 蛍光ライブイメージング57に関する追加の詳細とガイドラインについては、以前に公開されたプロトコルを参照してください。

5. ソフトウェアベースの画像処理と解析

  1. 各ビデオファイルを個別に分析します。ソフトウェア (図 2 に示すユーザー インターフェイス) で、[ ファイル] |インポート |Image Sequenceをクリックし 、表示されるボックスでTIFファイルをドラッグします。ビデオをプレビューします。
  2. [検出パラメータ]メニューで、ソフトウェアパラメータを調整して、はっきりと見える点のみを検出し、偽の物体の検出を回避します。たとえば、パーティクル強度を下げると、ソフトウェアの句読点に対する感度は高くなりますが、誤検出の可能性が増加します。パラメータの正確な値は経験的に異なります。検出パラメータと追跡パラメータの説明は、リクエストに応じて著者から入手できます。
  3. Neuron Particle Tracking レシピを適用し、[開始から]ボタン(青い矢印、図 2B)を使用して画像を解析します。ソフトウェアは、表1にリストされているトラッキングパラメータの結果を結果スプレッドシート(緑色のボックス、図2B)に出力します。後で分析や解釈を容易にするために、結果は「結果スプレッドシート」セクションにあるエクスポート機能を使用してスプレッドシートソフトウェアに保存できます。
  4. 前の手順で検出された punctaにカーソルを移動し、 左クリックして 選択または選択解除します。複数のプンクタを同時に選択するには、 Ctrl + 左クリックを使用します。
    注:プロジェクトの目的とアプリケーションによっては、追加のヒューリスティックを使用して点をフィルタリングする場合があります。たとえば、寿命が 8 〜 10 秒 (4 〜 5 フレーム) 未満の punctae は、成長イベント全体に関する十分な情報を提示していないため、省略される場合があります。このようなヒューリスティックの必要性は、経験的に異なります。ソフトウェア機能に関する追加の詳細は、リクエストに応じて作成者から入手できます。

結果

ハエは、UAS-EB1-GFP導入遺伝子を汎ニューロン(elaV-Gal4;UAS-EB1-GFP)58,59または感覚ニューロン(221-Gal4;UAS-EB1-GFP)60,61.EB1は、成長する末端に特異的に局在し、一時停止と収縮時にすぐに解離するため、この研究に選択されました14,15...

ディスカッション

この論文では、樹状突起および発生中のNMJにおけるMTダイナミクスの非侵襲的な生体内イメージングを実行するためのプロトコルについて説明します。画像化する動物の選択など、実験ステップでは人間の入力が必要であり、データ収集プロセスに合理的に除去できないバイアスが生じる可能性があります。したがって、このプロトコルの主な目標は、in vivoデータに...

開示事項

著者のHoyin Lai氏、Michael Jones氏、佐々木秀樹氏、Luciano A.G. Lucas氏、Sam Alworth氏(元)、James Shih-Jong Lee氏は、このプロトコルで使用されるソフトウェアを製造しているDRVision Technologies LLCの従業員です。

謝辞

Van Vactor研究室とDRVisionの同僚、さらにMax Heiman博士、Pascal Kaeser博士、David Pellman博士、Thomas Schwarz博士に感謝します。elaV-Gal4を寛大に提供してくださったメリッサ・ロールズ博士に感謝します 。UAS-EB1-GFPです。UAS-DCR2 および 221-GAL4;この研究で使用したUAS-EB1-GFP 株。ハーバード大学ニコンイメージングセンターのJennifer Waters博士とAnna Jost博士には、光学顕微鏡の専門知識を提供していただき、ありがとうございます。この研究は、国立衛生研究所(National Institutes of Health)の資金提供を受けています(F31 NS101756-03 to V.T.C., SBIR 1R43MH100780-01D to J.S.L.)。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubeEppendorf21008-959Sample preparation
1000 µL TipOne pipette tipsUSA Scientific1111-2721Sample preparation
200 µL TipOne pipette tipsUSA Scientific1120-8710Sample preparation
221-Gal4 fliesBloomington Drosophila Stock Center (US)26259Drosophila genetics/crosses
60x Objective LensNikonPlan Apo 60x OilImage acquisition
6-well plateBD Falcon353224Sample preparation
AgarMoorAgar41084Drosophila food
AiviaDRVision LLCOptimized as part of this study
Chloroform (stabilized with amylenes)Sigma-AldrichC2432Sample preparation
CO2 blowgun (for selection of flies for crosses)Genesee54-104Drosophila genetics/crosses
CO2 bubbler (for selection of flies for crosses)Genesee59-180Drosophila genetics/crosses
Cooled CCD cameraHamamatsuORCA-R2Image acquisition
CornmealGenesee62-101Drosophila food
Distilled WaterDrosophila food
Double-sided tapeScotchSample preparation
Drosophila vialsGenesee32-109Drosophila food
Droso-plugs (foam plugs for vials)Genesee59-200Drosophila food
Dumont #5 Biologie Inox ForcepsFine Science Tools11252-20Sample preparation
elaV-Gal4;UAS-EB1-GFP;UAS-Dcr2 fliesGift of Melissa Rolls (Penn State University)N/ADrosophila genetics/crosses
Ethanol (95%)VWR75811-022Drosophila food
Fiber optic illuminator/light source for stereomicroscopeNikonNI-150Sample preparation
Flypad (for selection of flies for crosses)Genesee59-172Drosophila genetics/crosses
Forma Environmental Chamber/IncubatorThermoFisher3940Drosophila genetics/crosses
Halocarbon oil 700Sigma-AldrichH8898Sample preparation
Immersion OilNikonMXA22168Image acquisition
Kimwipe Delicate WipesFisher Scientific34120Sample preparation
Laser Merge ModuleSpectral Applied ResearchLMM-5Image acquisition
Light Source for ConfocalLumencorSOLA 54-10021Image acquisition
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis SoftwareMolecular DevicesImage acquisition
Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2 (#1.5)VWR48366-205Sample preparation
Motorized inverted microscope with Perfect Focus SystemNikonTI-ND6-PFS-SImage acquisition
Motorized stage and shuttersPriorProscan IIIImage acquisition
Multi-purpose scissorsScotchMMM1428Sample preparation
Nail PolishSally Hansen784179032016 074170382839Sample preparation
Optical FilterChromaET480/40mImage acquisition
P1000 PipetmanGilsonF123602Sample preparation
P200 PipetmanGilsonF123601Sample preparation
PBS (10X) ph 7.4ThermoFisher70011044Sample preparation
Propionic AcidFisherA258-500Drosophila food
Spinning disk confocal scanner unitYokagawaCSU-X1Image acquisition
StereomicroscopeNikonSMZ800NSample preparation
Sugar (Sucrose)Genesee62-112Drosophila food
Superfrost SlideVWR48311-600Sample preparation
TegoseptGenesee20-258Drosophila food
UAS-dtacc-RNAi fliesVienna Drosophila Resource Center (Vienna, Austria)VDRC-101439Drosophila genetics/crosses
Vaseline petroleum jellyWB MasonDVOCB311003Sample preparation
Winsor & Newton Brush Regency Gold 520, Size 0Staples5012000Drosophila genetics/crosses
YeastVWRTorula Yeast IC90308580Drosophila food
Yokogawa dichroic beamsplitterSemrockDi01-T405/488/568/647-13x15x0.5Image acquisition

参考文献

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