JoVE Logo
Auteurs
Contactez-nous

S'identifier

Un abonnement à JoVE est nécessaire pour voir ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.

Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Cette étude présente une stratégie d’imagerie neuronale intravitale non invasive combinée à une nouvelle stratégie logicielle pour réaliser un suivi et une analyse automatisés et impartiaux de la dynamique positive des microtubules (MT) in vivo dans les dendrites sensorielles et les jonctions neuromusculaires de la drosophile.

Résumé

Les microtubules (MT) jouent un rôle essentiel dans le développement neuronal, mais de nombreuses questions subsistent sur les mécanismes moléculaires de leur régulation et de leur fonction. De plus, malgré les progrès réalisés dans la compréhension des MT postsynaptiques, on en sait beaucoup moins sur les contributions des MT présynaptiques à la morphogenèse neuronale. En particulier, des études de la dynamique des MT in vivo dans les dendrites sensorielles de la drosophile ont permis de mieux comprendre le comportement au niveau des polymères. Cependant, les défis techniques et analytiques associés à l’imagerie en direct de la jonction neuromusculaire de la mouche (JNM) ont limité les études comparables de la dynamique présynaptique de la MT. De plus, bien qu’il existe de nombreuses stratégies logicielles très efficaces pour l’analyse automatisée de la dynamique de la traduction automatique in vitro et ex vivo, les données in vivo nécessitent souvent une intervention importante de l’opérateur ou une analyse entièrement manuelle en raison du rapport signal/bruit intrinsèquement inférieur dans les images et de la morphologie cellulaire complexe.  Pour y remédier, cette étude a optimisé une nouvelle plate-forme logicielle pour la détection automatisée et impartiale des particules in vivo. Une analyse multiparamétrique d’images confocales en direct en time-lapse de MT marquées EB1-GFP a été réalisée à la fois dans les dendrites et la NMJ des larves de drosophile et a révélé des différences frappantes dans les comportements des MT. La dynamique des MT a en outre été analysée après l’inactivation de la protéine associée aux MT (MAP) dTACC, un régulateur clé du développement des synapses de la drosophile, et a identifié des changements statistiquement significatifs dans la dynamique des MT par rapport au type sauvage. Ces résultats démontrent que cette nouvelle stratégie d’analyse multiparamétrique automatisée de la dynamique pré- et postsynaptique de la MT au niveau du polymère réduit considérablement les critères de l’human-in-the-loop. L’étude montre en outre l’utilité de cette méthode dans la détection de comportements distincts de MT lors de l’inactivation de dTACC, indiquant une éventuelle application future pour les cribles fonctionnels des facteurs qui régulent la dynamique de la MT in vivo. Les applications futures de cette méthode pourraient également se concentrer sur l’élucidation des comportements MT spécifiques au type de cellule et/ou au compartiment, et l’imagerie corrélative multicolore de EB1-GFP avec d’autres marqueurs cellulaires et subcellulaires d’intérêt.

Introduction

Les cellules s’organisent pour former des structures fonctionnelles par la coordination des changements intra- et intercellulaires via la morphogenèse. Un exemple remarquable de morphogenèse est le développement de la structure neuronale hautement spécialisée. Les neurones présentent une polarisation remarquable, dans laquelle ils étendent deux types de processus structurellement et fonctionnellement distincts, les dendrites et les axones1, qui peuvent atteindre des longueurs immenses. La complexité du développement neuronal provient non seulement de la taille des dendrites et des axones, mais aussi de la difficulté à former leurs géométries ramifiées complexes 2,3. La morphogenèse neuronale et ses conséquences sur l’apprentissage et la mémoire4 motivent l’étude en cours de son contrôle génétique et des mécanismes biologiques cellulaires sous-jacents. Ces mécanismes comprennent, sans s’y limiter, le transport membranaire intracellulaire et les nombreux réarrangements cytosquelettiques nécessaires aux modifications de la morphologie neuronale 1,2,3.

L’étude de la morphogenèse neuronale a produit une variété de techniques de visualisation avancées. Les méthodes statiques, telles que la microscopie électronique ou la microscopie à fluorescence de sondes fixes, sont largement utilisées pour effectuer des analyses morphologiques et structurelles à haute résolution. Cependant, outre les artefacts qui sont inévitables à toute méthode de conservation, la visualisation statique ne peut pas capturer les changements dynamiques qui sous-tendent la morphogenèse. Ainsi, de nombreuses informations cruciales ont été obtenues grâce à la microscopie à fluorescence en accéléré de tissus vivants. Les premiers travaux de Lichtman et de ses collègues 5,6,7 ont utilisé l’imagerie in vivo du système nerveux des mammifères pour étudier la régénération/dégénérescence des axones, l’organisation des composants synaptiques et le transport axonal à longue distance. De plus, des études fondamentales sur des explants neuronaux primaires ont été essentielles pour établir l’importance de la dynamique des microtubules (MT) pour l’élongation et la motilité axonales 8,9. De manière cruciale, les premières études sur les explants neuronaux ont établi l’utilisation de protéines de la famille des fins de liaison (EB) marquées par fluorescence pour obtenir des informations inestimables sur la dynamique de l’extrémité positive de la MT dans les neurones en développement au niveau des polymères MT10 individuels. Ces études sont nées d’observations selon lesquelles le membre de la famille EB EB1 se localise préférentiellement aux extrémités MT plus11 chez S. cerevisiae12 et dans les cellules cultivées13. Depuis lors, EB1 et d’autres protéines de suivi de pointe (+TIP)14,15 ont été largement utilisées dans les études in vivo de l’instabilité dynamique de la MT16, y compris dans le contexte du développement neuronal17.

La drosophile est un modèle puissant pour les études d’imagerie in vivo de la dynamique de la MT au cours du développement neuronal en raison des vastes outils génétiques et d’imagerie disponibles pour les études sur les mouches18,19 ainsi que des similitudes de structure et de fonction entre la drosophile et les neurones vertébrés1. Une étude précoce clé de la jonction neuromusculaire (JNM) des larves de drosophile a effectué une imagerie non invasive répétée d’un marqueur de membrane fluorescente à travers la cuticule translucide d’animaux intacts pour documenter la morphogenèse terminale présynaptique20. En utilisant une méthode similaire pour imager des larves de drosophile entières et vivantes, une démonstration initiale de l’analyse subcellulaire au niveau des particules du mouvement processif des cargaisons motorisées dans les axones a été fournie21. Plus récemment, des études méticuleuses menées par Rolls et ses collègues sur les dendrites sensorielles de larves intactes de drosophile22, 23, 24, 25, 26, 27 ont caractérisé la dynamique positive de la MT postsynaptique en effectuant un suivi des particules et une analyse de la protéine fluorescente verte (GFP) étiquetée EB1. De telles études chez la drosophile 22,23,24,25,26,27 et d’autres systèmes 28,29,30,31,32 ont considérablement fait progresser la compréhension du comportement monopolymère des extrémités MT plus dans les dendrites des neurones en développement 33.

Malgré les études in vivo impressionnantes de la dynamique de la MT postsynaptique 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31, il y a eu beaucoup moins d’études comparables de la dynamique de la MT présynaptique au terminal axonal en développement. La dynamique de la MT au niveau de la NMJ de la larve de drosophile a été étudiée à l’aide de la microscopie à moucheture fluorescente (FSM) et de la récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP)34. Ces techniques évaluent la cinétique globale de la tubuline, mais pas le comportement des extrémités individuelles de MT plus. Au moment d’écrire ces lignes, il n’y a eu qu’une seule étude des extrémités individuelles de MT plus au NMJ de la drosophile : cette étude a combiné l’imagerie en direct et l’analyse manuelle de kymographes pour caractériser une population de MT dynamiques, étiquetées EB1-GFP « pionnières » qui semblaient distinctes d’une population plus large de MT stabilisées35. Ce manque de recherche sur la dynamique présynaptique des MT peut être dû au moins en partie à l’anatomie : alors qu’il est relativement simple d’obtenir des images des dendrites en raison de leur proximité avec la cuticule larvaire, les NMJ sont obstruées par d’autres tissus, ce qui rend difficile l’acquisition d’images avec un rapport signal/bruit suffisant pour l’analyse au niveau des particules. Néanmoins, étant donné l’importance bien établie des MT présynaptiques pour la morphogenèse et la stabilisation synaptiques36, ainsi que leurs liens avec les troubles neurodéveloppementaux et neurodégénératifs37, combler ce fossé entre la compréhension des MT pré- et postsynaptiques est susceptible de fournir des informations inestimables.

Un défi supplémentaire pour l’analyse de la dynamique de la traduction automatique in vivo en général, par rapport à l’analyse in vitro ou ex vivo, est le nombre limité d’outils logiciels automatisés capables d’extraire des paramètres dynamiques à partir de données in vivo. À l’heure actuelle, l’une des techniques les plus populaires et les plus puissantes pour l’analyse des extrémités MT plus étiquetées +TIP est plusTipTracker38,39, un logiciel basé sur MATLAB qui permet le suivi et l’analyse automatisés de plusieurs paramètres dynamiques. Notamment, plusTipTracker mesure non seulement la croissance de la traduction automatique, mais aussi la perte de poids et les sauvetages : alors que les étiquettes +TIP telles que EB1-GFP ne s’associent qu’aux extrémités positives en croissance, plusTipTracker peut déduire algorithmiquement les taux de rétrécissement et les événements de sauvetage. Cependant, alors que plusTripTracker a été appliqué avec beaucoup de succès à de nombreux contextes, y compris l’analyse multiparamétrique précédente de la dynamique MT ex vivo dans les cellules S2 de la drosophile40, plusTipTracker n’est pas optimal pour l’analyse de données in vivo étant donné leur rapport signal/bruit plus faible. Par conséquent, les études in vivo de la dynamique positive aux dendrites22, 23, 24, 25, 26, 27 et au NMJ35 de la drosophile ont reposé sur la génération et l’analyse manuelles de kymographes à l’aide d’un logiciel tel qu’ImageJ41, ou sur des stratégies semi-automatisées impliquant de nombreux composants humains dans la boucle.

Cette étude présente un flux de travail expérimental et analytique qui réduit les frais généraux expérimentaux et analytiques nécessaires pour effectuer une analyse non invasive au niveau des polymères de la dynamique présynaptique des MT dans les dendrites sensorielles et la terminaison axonale motrice des larves de drosophile du troisième stade. Le protocole utilise des larves immobilisées et intactes et évite donc les blessures connues pour déclencher des réponses au stress ainsi que d’autres conditions non physiologiques qui pourraient perturber la dynamique de la MT in vivo. Pour marquer les extrémités positives MT dynamiques, EB1-GFP est exprimé pan-neuronalement à l’aide du système Gal4/UAS 42, permettant de visualiser les MT à la fois aux dendrites et à la NMJ avec un seul pilote. Alors que certaines étapes précoces sont inévitablement soumises à la prise de décision humaine, comme la sélection des spécimens d’animaux et l’identification des régions à imager, les étapes qui suivent l’acquisition des données sont largement automatisées. L’optimisation d’un nouveau logiciel a permis une analyse automatisée et impartiale nécessitant un minimum d’intervention humaine. Bien que d’autres méthodes de suivi des particules soient disponibles 43,44,45, cette étude utilise un logiciel propriétaire car il était bien adapté sur le plan algorithmique pour relever les défis particuliers de cet ensemble de données particulier. Le logiciel est maintenant disponible pour une variété d’applications. Plus précisément, l’utilisation du filtrage de diffusion46, qui améliore la cohérence, fait partie intégrante de la segmentation automatisée et de la suppression de l’arrière-plan, et des algorithmes personnalisés sont mis en œuvre spécifiquement pour automatiser la détection et le suivi des particules. Cette stratégie pourrait gérer efficacement le faible rapport signal/bruit inhérent aux données de cette étude, ainsi que d’autres défis, tels que le mouvement des comètes EB1-GFP à travers différents plans focaux. Bien qu’il ne soit pas possible de tester de manière exhaustive les performances de ce logiciel par rapport à tous les autres logiciels d’analyse de particules, les performances de la stratégie actuelle étaient égales ou proches des performances humaines standard. De plus, à la connaissance des auteurs, il n’existe aucun autre logiciel spécifiquement entraîné sur des données in vivo provenant de dendrites sensorielles et du terminal présynaptique. Étant donné que les performances des algorithmes d’analyse d’images sont souvent très spécifiques aux données pour lesquelles ils ont été conçus et que la vision par ordinateur généralisée n’est pas encore possible, on s’attend à ce que l’entraînement du logiciel décrit aux données in vivo spécifiques d’intérêt soit l’approche la plus solide sur le plan algorithmique.

Compte tenu des travaux approfondis sur les MT dendritiques 22,23,24,25,26,27 ainsi que de la qualité constante des données pouvant être acquises à partir de ce système, la stratégie d’acquisition d’images et d’analyse logicielle a d’abord été validée chez les dendrites sensorielles de la drosophile. Il est important de noter que l’utilisation de différents pilotes neuronaux Gal4, même dans des milieux sauvages par ailleurs identiques, entraîne des différences significatives dans la dynamique EB1-GFP en raison de différences dans le patrimoine génétique, soulignant l’importance d’utiliser un seul pilote Gal4 pour des résultats cohérents. Cette stratégie a ensuite été utilisée pour l’analyse multiparamétrique de la dynamique EB1-GFP au niveau de la terminaison présynaptique du NMJ. Pour illustrer davantage la valeur investigatrice de cette méthode, cette stratégie d’imagerie et de logiciel a été utilisée pour évaluer la dynamique pré- et postsynaptique EB1-GFP après knockdown de dTACC, l’homologue de la drosophile de la famille hautement conservée TACC (transforming acidic coiled coil)47,48. Des travaux antérieurs sur les cellules S240 de la drosophile, ainsi que sur les travaux de Lowery et de ses collègues sur le cône de croissance du xénope 49,50,51, ont montré que les membres de la famille TACC régulent la dynamique positive de la MT. De plus, des preuves récemment rapportées de l’imagerie d’immunofluorescence confocale et à super-résolution ont montré que le dTACC est un régulateur clé des MT présynaptiques au cours de la morphogenèse neuronale52, soulevant la question de savoir si le dTACC régule la dynamique des MT en direct. Ce rapport fait la démonstration d’une méthode qui permet en effet de détecter les différences dans les comportements de la MT en direct lors de l’inactivation du dTACC. Ainsi, cette étude présente une méthode in vivo qui permet d’identifier et de caractériser efficacement les principaux régulateurs de la dynamique de la MT au sein du neurone en développement, en particulier dans le compartiment présynaptique.

Protocole

1. Génération de spécimens de drosophile

  1. Sélectionnez un marqueur MT plus-end approprié. Cette étude a utilisé EB1 marqué GFP, un marqueur positif bien caractérisé avec un signal fort et clair11,12. Les alternatives incluent d’autres +TIPs tels que EB310,13, CLASP/Orbit53 et CLIP-17054.
  2. Obtenir ou générer des mouches avec le marqueur MT sous le contrôle d’un promoteur UAS (p. ex., UAS-EB1-GFP).
  3. Choisissez le haut-parleur Gal4 spécifique au tissu. Cette étude a utilisé le pilote panneuronal elaV-Gal458,59 pour piloter l’expression à la fois dans les dendrites sensorielles et au NMJ et 221-Gal460,61 pour l’expression spécifique des dendrites.
  4. Élever des mouches en utilisant des techniques standard d’élevage de mouches55,56. Il est recommandé de garder les mouches dans des incubateurs humidifiés à 25 °C pour une expression optimale de Gal4/UAS.
  5. À l’aide de techniques génétiques de mouches standard55,56, effectuez des croisements pour générer des mouches afin d’exprimer le marqueur MT plus-end dans les cellules/tissus souhaités.
    REMARQUE : Pour toute combinaison de pilote Gal4 et de transgène, le plan expérimental doit inclure des expériences de validation de concept et de validation pour caractériser le système et éviter les artefacts dus à la surexpression.

2. Configuration de l’équipement

  1. Installez un poste de travail, y compris les mouches, les réactifs anesthésiques, les matériaux de construction des lames, le stéréomicroscope et la source d’éclairage, à proximité du microscope confocal (c.-à-d. dans la même pièce) afin de minimiser le temps passé entre la préparation de l’échantillon et l’imagerie afin de prolonger la santé et la viabilité des larves.
  2. Préparez l’anesthésique en mélangeant un mélange de chloroforme à 9 % (0,1 mL de chloroforme et 1,0 mL d’huile d’halocarbure) dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Pour éviter la séparation, mélangez bien en inversant le tube avant de préparer chaque nouvelle lame.
  3. Préparez la lame de verre : Coupez quatre bandes de ruban adhésif double face (~15 mm de large). Alignez deux des morceaux sur la lame de verre, en laissant un espace de ~5 mm entre les bandes. Superposez les deux morceaux restants sur les deux premiers pour doubler l’épaisseur du ruban (Figure 1C).
  4. Ajouter une grosse goutte (~100 μL) de mélange chloroforme/huile sur la lame de verre dans l’espace de 5 mm entre les morceaux de ruban (figure 1C).

3. Préparation des échantillons larvaires pour l’imagerie

  1. Remplissez un récipient (par exemple, une plaque à 6 puits) avec 1x PBS.
  2. Prélevez les larves du 3e stade dans la fiole à mouches à l’aide d’une pince ou d’un instrument similaire. Identifiez les larves au bon stade par leur comportement rampant et par la présence de 9 à 12 crochets buccaux dentelés proéminents. Utiliser un stéréomicroscope pour aider à stadifier les larves (figure 1D).
  3. Placez une larve dans le PBS et déplacez-la doucement pour éliminer tout reste de nourriture ou d’autres débris. Séchez doucement la larve sur un tissu délicat.
  4. Anesthésier la larve en la plaçant dans une goutte de chloroforme ou d’huile sur la lame de la section 2 (figure 1C).
    REMARQUE : L’orientation dorsale/ventrale de la larve n’est pas critique car les neurones sensoriels et moteurs peuvent être détectés à travers la cuticule translucide en réglant la platine du microscope sur le plan focal approprié, quelle que soit l’orientation de l’échantillon.
  5. Placez une lamelle #1.5 sur le dessus. Collez la lamelle sur le ruban en exerçant une légère pression, immobilisant ainsi la larve sans l’endommager (figure 1C).
  6. Scellez la chambre avec de la vaseline ou du vernis à ongles.

4. Imagerie confocale en accéléré d’échantillons vivants

  1. Préparez le microscope confocal et l’objectif 60x avec immersion dans l’huile. Placez l’échantillon sur la platine (Figure 1A,B).
  2. Utilisez le logiciel d’acquisition pour configurer les expériences.
    REMARQUE : Pour cette étude, chaque série d’images a été acquise à un seul plan focal par opposition à une pile z.
    1. Réglez la durée du time-lapse sur 30 s à 2 s d’intervalle, pour un total de 16 images.
    2. Réglez l’exposition et l’intensité du laser pour assurer un signal suffisant tout en évitant la saturation et le photoblanchiment.
    3. Pour l’imagerie EB1-GFP, le laser de 488 nm a été réglé sur un temps d’exposition de 100 ms et une intensité de 30 %. Ces valeurs peuvent varier selon les utilisations de ce protocole et doivent être modifiées empiriquement.
  3. Utilisez les oculaires du microscope pour trouver la larve dans un éclairage vert grand champ. Trouvez les dendrites ou NMJ en ajustant lentement la scène. N’exposez pas les larves à un éclairage (grand champ ou confocal) plus longtemps que nécessaire.
    1. Les dendrites se présentent sous la forme de fines toiles de nerfs vert vif facilement distinguables des longs faisceaux axonaux épais (Figure 1E).
    2. Les NMJ apparaissent sous la forme de groupes de boutons individuels vert vif, d’environ 5 μm de diamètre, aux extrémités de longs faisceaux axonaux épais qui divergent du cordon nerveux (Figure 1F).
  4. À l’aide du flux de caméra en direct, faites rapidement la mise au point sur la région d’intérêt à l’aide d’un éclairage de 488 nm. Arrêtez immédiatement l’éclairage une fois que la mise au point appropriée est trouvée pour éviter la phototoxicité.
  5. Lancez l’acquisition de l’image. Les comètes EB1 sont reconnaissables comme des ponctuales brillantes et mobiles.
  6. Reportez-vous aux protocoles publiés précédemment pour plus de détails et de directives sur l’imagerie en direct par fluorescence57.

5. Traitement et analyse d’images par logiciel

  1. Analysez chaque fichier vidéo individuellement. Dans le logiciel (interface utilisateur illustrée à la figure 2), sélectionnez Fichier | Importation | Séquence d’images et faites glisser les fichiers TIF dans la zone qui s’affiche. Prévisualisez la vidéo.
  2. Dans le menu Paramètres de détection , réglez les paramètres du logiciel pour garantir la détection uniquement des points clairement visibles et éviter la détection d’objets parasites. Par exemple, la réduction de l’intensité des particules entraîne une plus grande sensibilité du logiciel aux points de ponctuation, mais augmente le potentiel de faux positifs. Les valeurs précises des paramètres varient empiriquement. Les descriptions des paramètres de détection et de suivi sont disponibles sur demande auprès des auteurs.
  3. Appliquez la recette de suivi des particules de neurones pour analyser l’image à l’aide du bouton Depuis le début (flèche bleue, Figure 2B). Le logiciel transmettra les résultats des paramètres de suivi énumérés au tableau 1 à la feuille de calcul des résultats (encadré vert, figure 2B). Pour faciliter l’analyse et l’interprétation ultérieures, les résultats peuvent être stockés dans un tableur à l’aide de la fonction d’exportation qui se trouve dans la section Feuille de calcul des résultats .
  4. Naviguez le curseur jusqu’au point détecté à l’étape précédente et cliquez avec le bouton gauche pour sélectionner ou désélectionner. Plusieurs points peuvent être sélectionnés simultanément à l’aide de Ctrl + clic gauche.
    REMARQUE : Selon les objectifs et les applications du projet, des heuristiques supplémentaires peuvent être utilisées pour filtrer les ponctuations. Par exemple, les ponctuations ayant une durée de vie inférieure à 8 à 10 s (4 à 5 images) peuvent être omises parce qu’elles ne présentent pas suffisamment d’informations sur l’ensemble de l’événement de croissance. La nécessité de telles heuristiques variera empiriquement. Des détails supplémentaires sur les fonctionnalités du logiciel sont disponibles sur demande auprès des auteurs.

Résultats

Les mouches ont été élevées à partir de stocks stables qui expriment constitutivement le transgène UAS-EB1-GFP soit panneuronalement (elaV-Gal4 ; UAS-EB1-GFP)58,59 ou dans les neurones sensoriels (221-Gal4 ; UAS-EB1-GFP)60,61. EB1 a été choisi pour cette étude parce qu’il se localise spécifiquement aux extrémités en croissance et se dissoc...

Discussion

Cet article traite d’un protocole permettant d’effectuer une imagerie intravitale non invasive de la dynamique de la MT dans les dendrites et au niveau de la NMJ pendant le développement. L’intervention humaine est nécessaire au cours des étapes expérimentales, par exemple pour sélectionner les animaux à imager, et peut introduire dans le processus de collecte de données un biais qui ne peut être raisonnablement éliminé. Ainsi, l’un des principaux objectifs du protocole...

Déclarations de divulgation

Les auteurs Hoyin Lai, Michael Jones, Hideki Sasaki, Luciano A.G. Lucas, Sam Alworth (anciennement) et James Shih-Jong Lee sont des employés de DRVision Technologies LLC, qui produit le logiciel utilisé dans ce protocole.

Remerciements

Nous remercions nos collègues du laboratoire Van Vactor et de DRVision, ainsi que les Drs Max Heiman, Pascal Kaeser, David Pellman et Thomas Schwarz pour leur discussion utile. Nous remercions le Dr Melissa Rolls d’avoir généreusement fourni l’elaV-Gal4 ; UAS-EB1-GFP ; UAS-Dcr2 et 221-GA4 ; Actions UAS-EB1-GFP utilisées dans cette étude. Nous remercions les Dres Jennifer Waters et Anna Jost du Nikon Imaging Center de Harvard pour leur expertise en microscopie optique. Ce travail est financé par les National Institutes of Health (F31 NS101756-03 à V.T.C., SBIR 1R43MH100780-01D à J.S.L.).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubeEppendorf21008-959Sample preparation
1000 µL TipOne pipette tipsUSA Scientific1111-2721Sample preparation
200 µL TipOne pipette tipsUSA Scientific1120-8710Sample preparation
221-Gal4 fliesBloomington Drosophila Stock Center (US)26259Drosophila genetics/crosses
60x Objective LensNikonPlan Apo 60x OilImage acquisition
6-well plateBD Falcon353224Sample preparation
AgarMoorAgar41084Drosophila food
AiviaDRVision LLCOptimized as part of this study
Chloroform (stabilized with amylenes)Sigma-AldrichC2432Sample preparation
CO2 blowgun (for selection of flies for crosses)Genesee54-104Drosophila genetics/crosses
CO2 bubbler (for selection of flies for crosses)Genesee59-180Drosophila genetics/crosses
Cooled CCD cameraHamamatsuORCA-R2Image acquisition
CornmealGenesee62-101Drosophila food
Distilled WaterDrosophila food
Double-sided tapeScotchSample preparation
Drosophila vialsGenesee32-109Drosophila food
Droso-plugs (foam plugs for vials)Genesee59-200Drosophila food
Dumont #5 Biologie Inox ForcepsFine Science Tools11252-20Sample preparation
elaV-Gal4;UAS-EB1-GFP;UAS-Dcr2 fliesGift of Melissa Rolls (Penn State University)N/ADrosophila genetics/crosses
Ethanol (95%)VWR75811-022Drosophila food
Fiber optic illuminator/light source for stereomicroscopeNikonNI-150Sample preparation
Flypad (for selection of flies for crosses)Genesee59-172Drosophila genetics/crosses
Forma Environmental Chamber/IncubatorThermoFisher3940Drosophila genetics/crosses
Halocarbon oil 700Sigma-AldrichH8898Sample preparation
Immersion OilNikonMXA22168Image acquisition
Kimwipe Delicate WipesFisher Scientific34120Sample preparation
Laser Merge ModuleSpectral Applied ResearchLMM-5Image acquisition
Light Source for ConfocalLumencorSOLA 54-10021Image acquisition
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis SoftwareMolecular DevicesImage acquisition
Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2 (#1.5)VWR48366-205Sample preparation
Motorized inverted microscope with Perfect Focus SystemNikonTI-ND6-PFS-SImage acquisition
Motorized stage and shuttersPriorProscan IIIImage acquisition
Multi-purpose scissorsScotchMMM1428Sample preparation
Nail PolishSally Hansen784179032016 074170382839Sample preparation
Optical FilterChromaET480/40mImage acquisition
P1000 PipetmanGilsonF123602Sample preparation
P200 PipetmanGilsonF123601Sample preparation
PBS (10X) ph 7.4ThermoFisher70011044Sample preparation
Propionic AcidFisherA258-500Drosophila food
Spinning disk confocal scanner unitYokagawaCSU-X1Image acquisition
StereomicroscopeNikonSMZ800NSample preparation
Sugar (Sucrose)Genesee62-112Drosophila food
Superfrost SlideVWR48311-600Sample preparation
TegoseptGenesee20-258Drosophila food
UAS-dtacc-RNAi fliesVienna Drosophila Resource Center (Vienna, Austria)VDRC-101439Drosophila genetics/crosses
Vaseline petroleum jellyWB MasonDVOCB311003Sample preparation
Winsor & Newton Brush Regency Gold 520, Size 0Staples5012000Drosophila genetics/crosses
YeastVWRTorula Yeast IC90308580Drosophila food
Yokogawa dichroic beamsplitterSemrockDi01-T405/488/568/647-13x15x0.5Image acquisition

Références

  1. Rolls, M. M. Neuronal polarity in Drosophila: Sorting out axons and dendrites. Developmental Neurobiology. 71 (6), 419-429 (2011).
  2. Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: Mechanisms of dendritic arborization. Nature Reviews Neuroscience. 11 (5), 316-328 (2010).
  3. Lewis, T. L., Courchet, J., Polleux, F. Cell biology in neuroscience: Cellular and molecular mechanisms underlying axon formation, growth, and branching. Journal of Cell Biology. 202 (6), 837-848 (2013).
  4. Kandel, E. R. The Molecular Biology of Memory Storage: A Dialogue Between Genes and Synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
  5. Turney, S. G., Lichtman, J. W. Chapter 11: Imaging Fluorescent Mice In Vivo Using Confocal Microscopy. Methods in Cell Biology. 89 (8), 309-327 (2008).
  6. McCann, C. M., Lichtman, J. W. In vivo imaging of presynaptic terminals and postsynaptic sites in the mouse submandibular ganglion. Developmental Neurobiology. 68 (6), 760-770 (2008).
  7. Turney, S. G., Walsh, M. K., Lichtman, J. W. In vivo imaging of the developing neuromuscular junction in neonatal mice. Cold Spring Harbor Protocols. 7 (11), 1166-1176 (2012).
  8. Tanaka, E., Ho, T., Kirschner, M. W. The role of microtubule dynamics in growth cone motility and axonal growth. Journal of Cell Biology. 128 (1-2), 139-155 (1995).
  9. Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. Journal of Cell Biology. 115 (2), 345-363 (1991).
  10. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  11. Tirnauer, J. S., Bierer, B. E. EB1 proteins regulate microtubule dynamics, cell polarity, and chromosome stability. Journal of Cell Biology. 149 (4), 761-766 (2000).
  12. Schwartz, K., Richards, K., Botstein, D. BIM1 encodes a microtubule-binding protein in yeast. Molecular Biology of the Cell. 8 (12), 2677-2691 (1997).
  13. Juwana, J. P., et al. EB/RP gene family encodes tubulin binding proteins. International Journal of Cancer. 81 (2), 275-284 (1999).
  14. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (4), 309-322 (2008).
  15. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: Two ends in the limelight. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (12), 711-726 (2015).
  16. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic Instability of microtubule growth. Nature. 312 (15), 237-242 (1984).
  17. Van De Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A. Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).
  18. Rebollo, E., Karkali, K., Mangione, F., Martín-Blanco, E. Live imaging in Drosophila: The optical and genetic toolkits. Methods. 68 (1), 48-59 (2014).
  19. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nature Reviews Genetics. 6 (1), 9-23 (2005).
  20. Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila. Neuron. 22 (4), 719-729 (1999).
  21. Miller, K. E., et al. Direct observation demonstrates that Liprin-alpha is required for trafficking of synaptic vesicles. Current Biology. 15 (7), 684-689 (2005).
  22. Rao, K., et al. Spastin, atlastin, and ER relocalization are involved in axon but not dendrite regeneration. Molecular Biology of the Cell. 27 (21), 3245-3256 (2016).
  23. Hill, S. E., et al. Development of dendrite polarity in Drosophila neurons. Neural Development. 7, 34 (2012).
  24. Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite. Molecular Biology of the Cell. 21 (5), 767-777 (2010).
  25. Mattie, F. J., et al. Directed microtubule growth, +TIPs, and kinesin-2 are required for uniform microtubule polarity in dendrites. Current Biology. 20 (24), 2169-2177 (2010).
  26. Stone, M. C., Roegiers, F., Rolls, M. M. Microtubules Have Opposite Orientation in Axons and Dendrites of Drosophila Neurons. Molecular Biology of the Cell. 19 (10), 4122-4129 (2008).
  27. Rolls, M. M., et al. Polarity and intracellular compartmentalization of Drosophila neurons. Neural Development. 2, 7 (2007).
  28. Hu, X., Viesselmann, C., Nam, S., Merriam, E., Dent, E. W. Activity-dependent dynamic microtubule invasion of dendritic spines. Journal of Neuroscience. 28 (49), 13094-13105 (2008).
  29. Merriam, E. B., et al. Dynamic microtubules promote synaptic NMDA receptor-dependent spine enlargement. PLoS One. 6 (11), 27688 (2011).
  30. Hu, X., et al. BDNF-induced increase of PSD-95 in dendritic spines requires dynamic microtubule invasions. Journal of Neuroscience. 31 (43), 15597-15603 (2011).
  31. Merriam, E. B., et al. Synaptic regulation of microtubule dynamics in dendritic spines by calcium, F-actin, and drebrin. Journal of Neuroscience. 33 (42), 16471-16482 (2013).
  32. Jaworski, J., et al. Dynamic Microtubules Regulate Dendritic Spine Morphology and Synaptic Plasticity. Neuron. 61 (1), 85-100 (2009).
  33. Dent, E. W. Of microtubules and memory: Implications for microtubule dynamics in dendrites and spines. Molecular Biology of the Cell. 28 (1), 1-8 (2017).
  34. Yan, Y., Broadie, K. In vivo assay of presynaptic microtubule cytoskeleton dynamics in Drosophila. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 198-205 (2007).
  35. Pawson, C., Eaton, B. A., Davis, G. W. Formin-dependent synaptic growth: evidence that Dlar signals via Diaphanous to modulate synaptic actin and dynamic pioneer microtubules. Journal of Neuroscience. 28 (44), 11111-11123 (2008).
  36. Ruiz-Cañada, C., Budnik, V. Synaptic cytoskeleton at the neuromuscular junction. International Review of Neurobiology. 75 (6), 217-236 (2006).
  37. Bodaleo, F. J., Gonzalez-Billault, C. The presynaptic microtubule cytoskeleton in physiological and pathological conditions: lessons from Drosophila Fragile X syndrome and hereditary spastic paraplegias. Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 60 (2016).
  38. Applegate, K. T., et al. PlusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).
  39. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nature Methods. 7 (9), 761-768 (2010).
  40. Long, J. B., et al. Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics. Molecular and Cellular Biology. 33 (8), 1528-1545 (2013).
  41. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  42. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  43. Ma, Y., Wang, X., Liu, H., Wei, L., Xiao, L. Recent advances in optical microscopic methods for single-particle tracking in biological samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (19), 4445-4463 (2019).
  44. Shen, H., et al. Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications. Chemical Reviews. 117 (11), 7331-7376 (2017).
  45. Zwetsloot, A. J., Tut, G., Straube, A. Measuring microtubule dynamics. Essays in Biochemistry. 62 (6), 725-735 (2018).
  46. Weickert, J. Coherence-Enhancing Diffusion Filtering. International Journal of Computer Vision. 31 (2-3), 111-127 (1999).
  47. Peset, I., Vernos, I. The TACC proteins: TACC-ling microtubule dynamics and centrosome function. Trends in Cell Biology. 18 (8), 379-388 (2008).
  48. Hood, F. E., Royle, S. J. Pulling it together. Bioarchitecture. 1 (3), 105-109 (2011).
  49. Lucaj, C. M., et al. Xenopus TACC1 is a microtubule plus-end tracking protein that can regulate microtubule dynamics during embryonic development. Cytoskeleton. 72 (5), 225-234 (2015).
  50. Nwagbara, B. U., et al. TACC3 is a microtubule plus end-tracking protein that promotes axon elongation and also regulates microtubule plus end dynamics in multiple embryonic cell types. Molecular Biology of the Cell. 25 (21), 3350-3362 (2014).
  51. Rutherford, E. L., et al. Xenopus TACC2 is a microtubule plus end-tracking protein that can promote microtubule polymerization during embryonic development. Molecular Biology of the Cell. 27 (20), 3013-3020 (2016).
  52. Chou, V. T., Johnson, S., Long, J., Vounatsos, M. dTACC restricts bouton addition and regulates microtubule organization at the Drosophila neuromuscular junction. Cytoskeleton. 77 (1-2), 4-15 (2019).
  53. Maiato, H., et al. Human CLASP1 Is an Outer Kinetochore Component that Regulates Spindle Microtubule Dynamics. Cell. 113 (7), 891-904 (2003).
  54. Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. Life cycle of MTs persistent growth in the cell interior , asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary. Journal of Cell Science. 115, 3527-3539 (2002).
  55. Greenspan, R. J. . Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. , (2004).
  56. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: A primer on the drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
  57. Waters, J. C. Live-cell fluorescence imaging. Methods in Cell Biology. 114, 125-150 (2007).
  58. Berger, C., Renner, S., Lüer, K., Technau, G. M. The commonly used marker ELAV is transiently expressed in neuroblasts and glial cells in the Drosophila embryonic CNS. Developmental Dynamics. 236 (12), 3562-3568 (2007).
  59. Robinow, S., White, K. Characterization and spatial distribution of the ELAV protein during Drosophila melanogaster development. Journal of Neurobiology. 22 (5), 443-461 (1991).
  60. Parrish, J. Z., Kim, M. D., Lily, Y. J., Yuh, N. J. Genome-wide analyses identify transcription factors required for proper morphogenesis of Drosophila sensory neuron dendrites. Genes and Development. 20 (7), 820-835 (2006).
  61. Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons. Cell. 112 (6), 805-818 (2003).
  62. Zhang, T., et al. Microtubule plus-end binding protein EB1 is necessary for muscle cell differentiation, elongation and fusion. Journal of Cell Science. 122 (9), 1401-1409 (2009).
  63. Yang, C., et al. EB1 and EB3 regulate microtubule minus end organization and Golgi morphology. Journal of Cell Biology. 216 (10), 3179-3198 (2017).
  64. Allison, A., Nunn, J. Effect of general anaesthetics on microtubules. Lancet. 292 (7582), 1326-1329 (1968).
  65. Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, drosophila and zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (67), e3780 (2012).
  66. Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments. (84), e50998 (2014).
  67. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible neurotechnique cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (5), 451-461 (1999).
  68. Resh, M. D. Fatty acylation of proteins: New insights into membrane targeting of myristoylated and palmitoylated proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1451 (1), 1-16 (1999).
  69. Edwards, K. A., Demsky, M., Montague, R. A., Weymouth, N., Kiehart, D. P. GFP-moesin illuminates actin cytoskeleton dynamics in living tissue and demonstrates cell shape changes during morphogenesis in Drosophila. Developmental Biology. 191 (1), 103-117 (1997).
  70. Riedl, J., et al. Lifeact a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  71. Dent, E. W., Kalil, K. Axon Branching Requires Interactions between Dynamic Microtubules and Actin Filaments. Journal of Neuroscience. 21 (24), 9757-9769 (2001).
  72. Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones. Journal of Cell Biology. 158 (1), 139-152 (2002).

Réimpressions et Autorisations

Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demande d’autorisation

Explorer plus d’articles

Suivi de particules 3Danalyse non invasivedynamique des microtubules synaptiquesdendritesjonctions neuromusculairesdrosophilemicrotubulesimagerie en directanalyse automatis eEB1 GFPprot ine associ e la MTknockdown DTACCanalyse multiparam triquecomportement au niveau du polym remorphologie cellulaire

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Contactez-nous

RECOMMANDER À LA BIBLIOTHÈQUE

NEWSLETTERS JoVE

Recherche

Enseignement

Auteurs

Bibliothécaires

À PROPOS DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.