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Method Article
* Estos autores han contribuido por igual
Este estudio presenta una estrategia de imagen neuronal intravital no invasiva combinada con una nueva estrategia de software para lograr un seguimiento y análisis automatizados e imparciales de la dinámica de los microtúbulos (MT) en vivo en el extremo positivo de las dendritas sensoriales y las uniones neuromusculares de Drosophila.
Los microtúbulos (MT) desempeñan un papel fundamental en el desarrollo neuronal, pero aún quedan muchas preguntas sobre los mecanismos moleculares de su regulación y función. Además, a pesar de los avances en la comprensión de las MT postsinápticas, se sabe mucho menos sobre las contribuciones de las MT presinápticas a la morfogénesis neuronal. En particular, los estudios de la dinámica de la MT in vivo en dendritas sensoriales de Drosophila proporcionaron información significativa sobre el comportamiento a nivel de polímero. Sin embargo, los desafíos técnicos y analíticos asociados con la obtención de imágenes en vivo de la unión neuromuscular de la mosca (NMJ) han limitado estudios comparables de la dinámica presináptica de la MT. Además, si bien existen muchas estrategias de software altamente efectivas para el análisis automatizado de la dinámica de la TA in vitro y ex vivo, los datos in vivo a menudo requieren una participación significativa del operador o un análisis completamente manual debido a la relación señal-ruido inherentemente inferior en las imágenes y la compleja morfología celular. Para abordar esto, este estudio optimizó una nueva plataforma de software para la detección automatizada e imparcial de partículas in vivo. Se realizó un análisis multiparamétrico de imágenes confocales de lapso de tiempo en vivo de MT marcadas con EB1-GFP tanto en dendritas como en NMJ de larvas de Drosophila y encontró diferencias sorprendentes en el comportamiento de MT. Además, se analizó la dinámica de la MT tras la eliminación de la proteína asociada a la MT (MAP) dTACC, un regulador clave del desarrollo de la sinapsis de Drosophila, y se identificaron cambios estadísticamente significativos en la dinámica de la MT en comparación con el tipo salvaje. Estos resultados demuestran que esta nueva estrategia para el análisis multiparamétrico automatizado de la dinámica de la MT pre y postsináptica a nivel de polímero reduce significativamente los criterios de human-in-the-loop. Además, el estudio muestra la utilidad de este método en la detección de distintos comportamientos de la MT tras el knockdown de dTACC, lo que indica una posible aplicación futura para pantallas funcionales de factores que regulan la dinámica de la MT in vivo. Las aplicaciones futuras de este método también pueden centrarse en dilucidar el tipo de célula y/o los comportamientos de MT específicos del compartimento, y la obtención de imágenes correlativas multicolor de EB1-GFP con otros marcadores celulares y subcelulares de interés.
Las células se organizan para formar estructuras funcionales a través de la coordinación de cambios intra e intercelulares a través de la morfogénesis. Un ejemplo notable de morfogénesis es el desarrollo de la estructura neuronal altamente especializada. Las neuronas muestran una polarización notable, en la que extienden dos tipos de procesos estructural y funcionalmente distintos, dendritas y axones1, que pueden alcanzar longitudes inmensas. La complejidad del desarrollo neuronal surge no solo del gran tamaño de las dendritas y axones, sino también de la dificultad para formar sus geometrías intrincadamente ramificadas 2,3. La morfogénesis neuronal y sus consecuencias en el aprendizaje y la memoria4 motivan la investigación continua tanto de su control genético como de los mecanismos biológicos celulares subyacentes. Tales mecanismos incluyen, pero no se limitan a, el transporte de la membrana intracelular y los muchos reordenamientos del esqueleto necesarios para los cambios en la morfología neuronal 1,2,3.
Los estudios de la morfogénesis neuronal han producido una variedad de técnicas de visualización avanzadas. Los métodos estáticos, como la microscopía electrónica o la microscopía de fluorescencia de sondas fijas, se utilizan ampliamente para realizar análisis morfológicos y estructurales de alta resolución. Sin embargo, además de los artefactos que son inevitables para cualquier método de preservación, la visualización estática no puede capturar los cambios dinámicos que sustentan la morfogénesis. Por lo tanto, muchos conocimientos fundamentales se originaron a partir de la microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo de tejidos vivos. Los primeros trabajos de Lichtman y sus colegas 5,6,7 utilizaron imágenes in vivo del sistema nervioso de los mamíferos para investigar la regeneración/degeneración de los axones, la organización de los componentes sinápticos y el transporte axonal de largo alcance. Además, los estudios seminales en explantes neuronales primarios fueron críticos para establecer la importancia de la dinámica de los microtúbulos (MT) para la elongación y motilidad axonal 8,9. De manera crucial, los primeros estudios de explantes neuronales establecieron el uso de proteínas de la familia de unión a extremos (EB) marcadas con fluorescencia para obtener información invaluable sobre la dinámica de extremos positivos de MT en neuronas en desarrollo a nivel de polímeros MT individuales10. Estos estudios surgieron a partir de la observación de que el miembro de la familia EB EB1 se localiza preferentemente en MT más extremos11 en S. cerevisiae12 y en células cultivadas13. Desde entonces, EB1 y otras proteínas de seguimiento de punta plus (+TIPs)14,15 han sido ampliamente utilizadas en estudios in vivo de la inestabilidad dinámica de la MT16, incluso en el contexto del desarrollo neuronal17.
Drosophila es un potente modelo para los estudios de imagen in vivo de la dinámica de la MT durante el desarrollo neuronal debido a las vastas herramientas genéticas y de imagen disponibles para los estudios con moscas18,19, así como a las similitudes en la estructura y función entre Drosophila y las neuronas de vertebrados1. Un estudio temprano clave de la unión neuromuscular (NMJ) de las larvas de Drosophila realizó imágenes repetidas y no invasivas de un marcador de membrana fluorescente a través de la cutícula translúcida de animales intactos para documentar la morfogénesis terminal presináptica20. Utilizando un método similar para obtener imágenes de larvas de Drosophila vivas y enteras, se proporcionó una demostración inicial de análisis subcelular, a nivel de partículas, del movimiento procesal de las cargas motoras en los axones21. Más recientemente, los meticulosos estudios realizados por Rolls y sus colegas en las dendritas sensoriales de las larvas intactas de Drosophila 22,23,24,25,26,27 caracterizaron la dinámica postsináptica de la MT en el extremo positivo mediante la realización de un seguimiento de partículas y el análisis de EB1 marcado con proteína verde fluorescente (GFP). Tales estudios en Drosophila 22,23,24,25,26,27 y otros sistemas 28,29,30,31,32 han avanzado significativamente en la comprensión del comportamiento de un solo polímero de los extremos más de MT en las dendritas de las neuronas en desarrollo 33.
A pesar de los impresionantes estudios in vivo de la dinámica de la MT postsináptica 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31, ha habido muchos menos estudios comparables de la dinámica de la MT presináptica en el terminal axónico en desarrollo. La dinámica de la MT en la NMJ larvaria de Drosophila se ha estudiado mediante microscopía de moteado fluorescente (FSM) y recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP)34. Estas técnicas evalúan la cinética general de la tubulina, pero no el comportamiento de los extremos positivos de MT individuales. En el momento de escribir este artículo, ha habido una única investigación de los extremos positivos individuales de la MT en el NMJ de Drosophila: este estudio combinó imágenes de lapso de tiempo en vivo con el análisis manual de quimógrafos para caracterizar una población de MT dinámicos, EB1-GFP etiquetados como "MT pioneros" que parecían distintos de una población más amplia de MT estabilizados35. Esta falta de investigación sobre la dinámica presináptica de la TA puede deberse, al menos en parte, a la anatomía: si bien es relativamente sencillo obtener imágenes de las dendritas debido a su proximidad a la cutícula de la larva, los NMJ están obstruidos por otros tejidos, lo que dificulta la adquisición de imágenes con una relación señal-ruido suficiente para el análisis a nivel de partículas. No obstante, dada la importancia bien establecida de las MT presinápticas para la morfogénesis y la estabilización sináptica36, así como sus vínculos con los trastornos neurodegenerativos y del neurodesarrollo37, es probable que cerrar esta brecha entre la comprensión de las MT presinápticas y postsinápticas proporcione información invaluable.
Un desafío adicional para el análisis de la dinámica de la MT in vivo en general, en contraste con el análisis in vitro o ex vivo, son las limitadas herramientas de software automatizadas que pueden extraer parámetros de dinámica de datos in vivo. En la actualidad, una de las técnicas más populares y potentes para el análisis de los extremos positivos de la TA marcados con +TIP es plusTipTracker38,39, un software basado en MATLAB que permite el seguimiento y el análisis automatizados de múltiples parámetros dinámicos. En particular, plusTipTracker mide no solo el crecimiento de la TA sino también la contracción y los rescates: mientras que las etiquetas +TIP como EB1-GFP solo se asocian con extremos positivos crecientes, plusTipTracker puede inferir algorítmicamente las tasas de contracción y los eventos de rescate. Sin embargo, mientras que plusTripTracker se ha aplicado con mucho éxito en muchos contextos, incluido el análisis multiparamétrico previo de la dinámica de MT ex vivo en células S2 de Drosophila40, plusTipTracker no es óptimo para el análisis de datos in vivo dada su menor relación señal-ruido. Como resultado, los estudios in vivo de la dinámica del extremo positivo en las dendritas 22,23,24,25,26,27 y en el NMJ35 de Drosophila se han basado en la generación manual y el análisis de kymographs utilizando software como ImageJ 41, o en estrategias semiautomatizadas que involucran numerosos componentes humanos.
Este estudio presenta un flujo de trabajo experimental y analítico que reduce la sobrecarga experimental y analítica necesaria para realizar análisis no invasivos a nivel de polímero de la dinámica presináptica de la MT tanto en las dendritas sensoriales como en el terminal del axón motor de las larvas de tercer estadio de Drosophila. El protocolo utiliza larvas inmovilizadas e intactas y, por lo tanto, evita lesiones que se sabe que desencadenan respuestas al estrés, así como otras condiciones no fisiológicas que podrían perturbar la dinámica de la MT in vivo. Para etiquetar los extremos positivos de la MT dinámica, EB1-GFP se expresa panneuronalmente utilizando el sistema Gal4/UAS 42, lo que permite la visualización de las MT tanto en las dendritas como en la NMJ con un solo controlador. Si bien algunos pasos iniciales están inevitablemente sujetos a la toma de decisiones humanas, como la selección de especímenes de animales y la identificación de regiones para obtener imágenes, los pasos posteriores a la adquisición de datos están en gran medida automatizados. Fundamentalmente, la optimización de un nuevo software permitió un análisis automatizado e imparcial que requiere una intervención humana mínima. Si bien existen otros métodos de seguimiento de partículas 43,44,45, este estudio utiliza un software patentado porque era algorítmicamente adecuado para abordar los desafíos particulares de este conjunto de datos en particular. El software ahora está disponible para los usuarios para una variedad de aplicaciones. Específicamente, el uso del filtrado de difusión que mejora la coherencia46 es integral para la segmentación automatizada y la eliminación de fondo, y se implementan algoritmos personalizados específicamente para automatizar la detección y el seguimiento de partículas. Esta estrategia podría manejar de manera efectiva la baja relación señal-ruido inherente a los datos de este estudio, así como otros desafíos, como el movimiento de los cometas EB1-GFP a través de diferentes planos focales. Si bien no es factible probar exhaustivamente el rendimiento de este software en comparación con todos los demás software de análisis de partículas, el rendimiento de la presente estrategia igualó o se acercó al rendimiento humano estándar. Además, hasta donde saben los autores, no ha habido ningún otro software entrenado específicamente con datos in vivo de dendritas sensoriales y el terminal presináptico. Dado que el rendimiento de los algoritmos de análisis de imágenes es a menudo muy específico de los datos para los que fueron diseñados y que la visión generalizada por computadora aún no es posible, se espera que el entrenamiento del software descrito para los datos in vivo específicos de interés sea el enfoque más racionalmente sólido.
Dado el extenso trabajo sobre las MT dendríticas 22,23,24,25,26,27, así como la calidad constante de los datos que se pueden adquirir de este sistema, la estrategia de adquisición de imágenes y análisis de software se validó por primera vez en dendritas sensoriales de Drosophila. Es importante destacar que se encontró en las dendritas que el uso de diferentes controladores neuronales de Gal4, incluso en fondos de tipo salvaje idénticos, da como resultado diferencias significativas en la dinámica de EB1-GFP debido a las diferencias en el fondo genético, lo que enfatiza la importancia de usar un solo controlador de Gal4 para obtener resultados consistentes. Esta estrategia se utilizó posteriormente para el análisis multiparamétrico de la dinámica de EB1-GFP en el terminal presináptico de la NMJ. Para ilustrar aún más el valor investigativo de este método, se utilizó esta estrategia de imagen y software para evaluar la dinámica pre y postsináptica de EB1-GFP después de la eliminación de dTACC, el homólogo de Drosophila de la familia TACC (bobina en espiral ácida transformante) altamente conservada47,48. El trabajo previo en las célulasS2 de Drosophila 40, así como el trabajo de Lowery y sus colegas en el cono de crecimiento de Xenopus 49,50,51, han demostrado que los miembros de la familia TACC regulan la dinámica del extremo positivo de la MT. Además, la evidencia reportada recientemente de imágenes de inmunofluorescencia confocal y de súper resolución mostró que dTACC es un regulador clave de las MT presinápticas durante la morfogénesis neuronal52, lo que plantea la pregunta de si dTACC regula la dinámica de la MT en vivo. Este informe demuestra un método que puede detectar diferencias en los comportamientos de MT en vivo tras el derribo de dTACC. Por lo tanto, este estudio presenta un método in vivo que puede identificar y caracterizar de manera efectiva los reguladores clave de la dinámica de MT dentro de la neurona en desarrollo, particularmente en el compartimento presináptico.
1. Generación de ejemplares de Drosophila
2. Configuración del equipo
3. Preparación de muestras de larvas para la obtención de imágenes
4. Imágenes confocales de lapso de tiempo de muestras vivas
5. Procesamiento y análisis de imágenes basado en software
Las moscas se criaron a partir de stocks estables que expresan constitutivamente el transgén UAS-EB1-GFP ya sea panneuronalmente (elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP)58,59 o en neuronas sensoriales (221-Gal4; UAS-EB1-GFP)60,61. Se eligió EB1 para este estudio porque se localiza específicamente en los extremos en crecimiento y se disocia inmediatamente después de ...
En este artículo se discute un protocolo para realizar imágenes intravitales no invasivas de la dinámica de la MT en las dendritas y en la NMJ durante el desarrollo. Se requiere la participación humana durante las etapas experimentales, como en la selección de animales para obtener imágenes, y puede introducir sesgos en el proceso de recopilación de datos que no se pueden eliminar razonablemente. Por lo tanto, un objetivo clave del protocolo es minimizar el sesgo siempre que sea p...
Los autores Hoyin Lai, Michael Jones, Hideki Sasaki, Luciano A.G. Lucas, Sam Alworth (anteriormente) y James Shih-Jong Lee son empleados de DRVision Technologies LLC, que produce el software utilizado en este protocolo.
Agradecemos a nuestros colegas en el laboratorio de Van Vactor y en DRVision, además de a los Dres. Max Heiman, Pascal Kaeser, David Pellman y Thomas Schwarz, por su útil discusión. Agradecemos a la Dra. Melissa Rolls por proporcionar generosamente el elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP; UAS-Dcr2 y 221-Gal4; Existencias de UAS-EB1-GFP utilizadas en este estudio. Agradecemos a las Dras. Jennifer Waters y Anna Jost del Centro de Imágenes Nikon de Harvard por su experiencia en microscopía óptica. Este trabajo está financiado por los Institutos Nacionales de Salud (F31 NS101756-03 a V.T.C., SBIR 1R43MH100780-01D a J.S.L.).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 21008-959 | Sample preparation |
1000 µL TipOne pipette tips | USA Scientific | 1111-2721 | Sample preparation |
200 µL TipOne pipette tips | USA Scientific | 1120-8710 | Sample preparation |
221-Gal4 flies | Bloomington Drosophila Stock Center (US) | 26259 | Drosophila genetics/crosses |
60x Objective Lens | Nikon | Plan Apo 60x Oil | Image acquisition |
6-well plate | BD Falcon | 353224 | Sample preparation |
Agar | MoorAgar | 41084 | Drosophila food |
Aivia | DRVision LLC | Optimized as part of this study | |
Chloroform (stabilized with amylenes) | Sigma-Aldrich | C2432 | Sample preparation |
CO2 blowgun (for selection of flies for crosses) | Genesee | 54-104 | Drosophila genetics/crosses |
CO2 bubbler (for selection of flies for crosses) | Genesee | 59-180 | Drosophila genetics/crosses |
Cooled CCD camera | Hamamatsu | ORCA-R2 | Image acquisition |
Cornmeal | Genesee | 62-101 | Drosophila food |
Distilled Water | Drosophila food | ||
Double-sided tape | Scotch | Sample preparation | |
Drosophila vials | Genesee | 32-109 | Drosophila food |
Droso-plugs (foam plugs for vials) | Genesee | 59-200 | Drosophila food |
Dumont #5 Biologie Inox Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Sample preparation |
elaV-Gal4;UAS-EB1-GFP;UAS-Dcr2 flies | Gift of Melissa Rolls (Penn State University) | N/A | Drosophila genetics/crosses |
Ethanol (95%) | VWR | 75811-022 | Drosophila food |
Fiber optic illuminator/light source for stereomicroscope | Nikon | NI-150 | Sample preparation |
Flypad (for selection of flies for crosses) | Genesee | 59-172 | Drosophila genetics/crosses |
Forma Environmental Chamber/Incubator | ThermoFisher | 3940 | Drosophila genetics/crosses |
Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | Sample preparation |
Immersion Oil | Nikon | MXA22168 | Image acquisition |
Kimwipe Delicate Wipes | Fisher Scientific | 34120 | Sample preparation |
Laser Merge Module | Spectral Applied Research | LMM-5 | Image acquisition |
Light Source for Confocal | Lumencor | SOLA 54-10021 | Image acquisition |
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software | Molecular Devices | Image acquisition | |
Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2 (#1.5) | VWR | 48366-205 | Sample preparation |
Motorized inverted microscope with Perfect Focus System | Nikon | TI-ND6-PFS-S | Image acquisition |
Motorized stage and shutters | Prior | Proscan III | Image acquisition |
Multi-purpose scissors | Scotch | MMM1428 | Sample preparation |
Nail Polish | Sally Hansen | 784179032016 074170382839 | Sample preparation |
Optical Filter | Chroma | ET480/40m | Image acquisition |
P1000 Pipetman | Gilson | F123602 | Sample preparation |
P200 Pipetman | Gilson | F123601 | Sample preparation |
PBS (10X) ph 7.4 | ThermoFisher | 70011044 | Sample preparation |
Propionic Acid | Fisher | A258-500 | Drosophila food |
Spinning disk confocal scanner unit | Yokagawa | CSU-X1 | Image acquisition |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | Sample preparation |
Sugar (Sucrose) | Genesee | 62-112 | Drosophila food |
Superfrost Slide | VWR | 48311-600 | Sample preparation |
Tegosept | Genesee | 20-258 | Drosophila food |
UAS-dtacc-RNAi flies | Vienna Drosophila Resource Center (Vienna, Austria) | VDRC-101439 | Drosophila genetics/crosses |
Vaseline petroleum jelly | WB Mason | DVOCB311003 | Sample preparation |
Winsor & Newton Brush Regency Gold 520, Size 0 | Staples | 5012000 | Drosophila genetics/crosses |
Yeast | VWR | Torula Yeast IC90308580 | Drosophila food |
Yokogawa dichroic beamsplitter | Semrock | Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 | Image acquisition |
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