מעקב אחר חלקיקים תלת מימדיים לניתוח לא פולשני in vivo של דינמיקת מיקרו-צינורות סינפטיים בדנדריטים ובצמתים עצביים-שריריים של דרוזופילה

Summary

מחקר זה מציג אסטרטגיית הדמיה עצבית תוך-חיונית לא פולשנית בשילוב עם אסטרטגיית תוכנה חדשה להשגת מעקב וניתוח אוטומטיים ובלתי משוחדים של דינמיקת מיקרו-צינוריות (MT) פלוס קצה בדנדריטים החושיים ובצמתים העצביים-שריריים של דרוזופילה.

Abstract

מיקרו-צינורות (MTs) ממלאים תפקידים קריטיים בהתפתחות עצבית, אך נותרו שאלות רבות לגבי המנגנונים המולקולריים של ויסות ותפקודם. יתר על כן, למרות ההתקדמות בהבנת MTs פוסט-סינפטי, הרבה פחות ידוע על התרומות של MTs פרה-סינפטי למורפוגנזה עצבית. בפרט, מחקרים על דינמיקת MT in vivo בדנדריטים חושיים של דרוזופילה הניבו תובנות משמעותיות לגבי התנהגות ברמת הפולימר. עם זאת, האתגרים הטכניים והאנליטיים הקשורים להדמיה חיה של הצומת העצבי-שרירי של הזבוב (NMJ) הגבילו מחקרים דומים של דינמיקת MT פרה-סינפטית. יתר על כן, בעוד שישנן אסטרטגיות תוכנה יעילות רבות לניתוח אוטומטי של דינמיקת MT במבחנה וב-ex vivo, נתוני in vivo דורשים לעתים קרובות קלט מפעיל משמעותי או ניתוח ידני לחלוטין עקב יחס אות לרעש נחות מטבעו בתמונות ומורפולוגיה תאית מורכבת.  כדי לטפל בכך, מחקר זה אופטימיזציה של פלטפורמת תוכנה חדשה לזיהוי חלקיקים אוטומטי וחסר פניות in vivo. ניתוח רב-פרמטרי של תמונות קונפוקליות חיות של EB1-GFP המסומנות MTS בוצע הן בדנדריטים והן ב-NMJ של זחלי דרוזופילה ומצא הבדלים בולטים בהתנהגויות MT. דינמיקת MT נותחה בנוסף לאחר הפלת החלבון הקשור ל-MT (MAP) dTACC, מווסת מרכזי של התפתחות סינפסות דרוזופילה, וזיהתה שינויים מובהקים סטטיסטית בדינמיקת MT בהשוואה לסוג הפראי. תוצאות אלה מדגימות כי אסטרטגיה חדשה זו לניתוח רב-פרמטרי אוטומטי של דינמיקת MT קדם-סינפטית ופוסט-סינפטית ברמת הפולימר מפחיתה משמעותית את הקריטריונים של אדם בלולאה. המחקר מראה עוד את התועלת של שיטה זו בזיהוי התנהגויות MT מובחנות בעת נוקדאון dTACC, מה שמצביע על יישום עתידי אפשרי עבור מסכים פונקציונליים של גורמים המווסתים את דינמיקת MT in vivo. יישומים עתידיים של שיטה זו עשויים להתמקד גם בהבהרת סוג התא ו/או התנהגויות MT ספציפיות לתא, והדמיה מתאמת רב-צבעונית של EB1-GFP עם סמנים תאיים ותת-תאיים אחרים מעניינים.

Introduction

תאים מתארגנים ליצירת מבנים פונקציונליים באמצעות תיאום של שינויים תוך-תאיים ובין-תאיים באמצעות מורפוגנזה. דוגמה יוצאת דופן למורפוגנזה היא התפתחות המבנה העצבי המיוחד ביותר. נוירונים מציגים קיטוב יוצא דופן, שבו הם מרחיבים שני סוגים שונים של תהליכים מבניים ותפקודיים, דנדריטים ואקסונים¹, שיכולים להשיג אורכים עצומים. המורכבות של התפתחות עצבית נובעת לא רק מהגודל העצום של דנדריטים ואקסונים אלא גם מהקושי ליצור את הגיאומטריות המסועפות המורכבות שלהם ^2,3. מורפוגנזה עצבית והשלכותיה על למידה וזיכרון⁴ מניעים את החקירה המתמשכת הן של הבקרה הגנטית והן של המנגנונים הביולוגיים של התא הבסיסיים. מנגנונים כאלה כוללים, אך אינם מוגבלים להובלה תוך-תאית של הממברנה והסידורים מחדש הרבים של השלד הציטולוגי הדרושים לשינויים במורפולוגיה העצבית ^1,2,3.

מחקרים על מורפוגנזה עצבית הניבו מגוון טכניקות הדמיה מתקדמות. שיטות סטטיות, כגון מיקרוסקופ אלקטרונים או מיקרוסקופ פלואורסצנטי של בדיקות קבועות, נמצאות בשימוש נרחב לביצוע ניתוח מורפולוגי ומבני ברזולוציה גבוהה. עם זאת, מלבד החפצים הבלתי נמנעים לכל שיטת שימור, הדמיה סטטית אינה יכולה ללכוד את השינויים הדינמיים העומדים בבסיס המורפוגנזה. לפיכך, תובנות מרכזיות רבות מקורן במיקרוסקופיה פלואורסצנטית של רקמות חיות. עבודה מוקדמת של ליכטמן ועמיתיו ^5,6,7 השתמשה בהדמיה in vivo של מערכת העצבים של היונקים כדי לחקור התחדשות/ניוון אקסונים, ארגון רכיבים סינפטיים והובלה אקסונלית ארוכת טווח. יתר על כן, מחקרים מכוננים באקספלנטים עצביים ראשוניים היו קריטיים לביסוס החשיבות של דינמיקת מיקרו-צינוריות (MT) להתארכות אקסונלית ותנועתיות ^8,9. באופן מכריע, מחקרי אקספלנט עצביים מוקדמים ביססו את השימוש בחלבונים משפחתיים קושרים קצה (EBs) מתויגים פלואורסצנטיים כדי להשיג תובנות יקרות ערך לגבי דינמיקת MT פלוס קצה בפיתוח נוירונים ברמה של פולימרי MT בודדים¹⁰. מחקרים אלה נבעו מתצפיות שבן משפחת EB EB1 מתמקם באופן מועדף ל-MT plus מסתיים¹¹ ב-S. cerevisiae¹² ובתאים מתורבתים¹³. מאז, EB1 וחלבונים אחרים למעקב אחר קצה פלוס (+TIPs)^14,15 היו בשימוש נרחב במחקרי in vivo של חוסר יציבות דינמית של MT¹⁶, כולל בהקשר של התפתחות עצבית¹⁷.

דרוזופילה הוא מודל רב עוצמה למחקרי הדמיה in vivo של דינמיקת MT במהלך התפתחות עצבית בשל הכלים הגנטיים וההדמיה העצומים הזמינים למחקרי זבובים^18,19 כמו גם הדמיון במבנה ובתפקוד בין דרוזופילה לנוירונים של בעלי חוליות¹. מחקר מוקדם מרכזי של הצומת העצבי-שרירי (NMJ) של זחלי דרוזופילה ביצע הדמיה לא פולשנית חוזרת ונשנית של סמן ממברנה פלואורסצנטית דרך הציפורן השקופה של בעלי חיים שלמים כדי לתעד מורפוגנזה טרמינלית פרה-סינפטית²⁰. באמצעות שיטה דומה להדמיית זחלי דרוזופילה חיים שלמים, ניתנה הדגמה ראשונית של ניתוח תת-תאי ברמת החלקיקים של תנועה תהליכית של מטענים ממונעים באקסונים²¹. לאחרונה, מחקרים קפדניים של רולס ועמיתיו בדנדריטים החושיים של זחלי דרוזופילה שלמים 22,23,24,25,26,27 אפיינו דינמיקה פוסט-סינפטית של MT פלוס-קצה על ידי ביצוע מעקב אחר חלקיקים וניתוח של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) המתויג EB1. מחקרים כאלה בדרוזופילה 22,23,24,25,26,27 ומערכות אחרות 28,29,30,31,32 קידמו משמעותית את ההבנה של התנהגות פולימר יחיד של MT פלוס מסתיים בדנדריטים של נוירונים מתפתחים 33.

למרות מחקרי in vivo המרשימים של דינמיקת MT פוסט-סינפטית 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31, היו הרבה פחות מחקרים דומים של דינמיקת MT פרה-סינפטית במסוף האקסון המתפתח. דינמיקת MT בזחל הדרוזופילה NMJ נחקרה באמצעות מיקרוסקופ כתמים פלואורסצנטי (FSM) והתאוששות פלואורסצנטית לאחר פוטוהלבנה (FRAP)³⁴. טכניקות אלה מעריכות את הקינטיקה הכוללת של טובולין אך לא את ההתנהגות של קצוות MT פלוס בודדים. נכון לכתיבת שורות אלה, הייתה חקירה אחת יחידה של MT פלוס בודד ב-Drosophila NMJ: מחקר זה שילב הדמיה חיה עם ניתוח ידני של קימוגרפים כדי לאפיין אוכלוסייה של דינמי, EB1-GFP המסומנת כ"MTs חלוצית" שנראתה נבדלת מאוכלוסייה רחבה יותר של MTs³⁵ מיוצבים. היעדר מחקר זה על דינמיקת MT פרה-סינפטית עשוי לנבוע לפחות בחלקו מהאנטומיה: בעוד שזה פשוט יחסית להשיג תמונות של דנדריטים בשל קרבתם לציפורן הזחל, NMJs חסומים על ידי רקמות אחרות, מה שמקשה על רכישת תמונות עם יחס אות לרעש מספיק לניתוח רמת החלקיקים. עם זאת, בהתחשב בחשיבותם המבוססת של ה-MTs הקדם-סינפטי למורפוגנזה וייצוב סינפטי³⁶, כמו גם הקשרים שלהם להפרעות נוירו-התפתחותיות ונוירודגנרטיביות³⁷, סביר להניח שגישור על הפער הזה בין הבנת MTs קדם-סינפטי ופוסט-סינפטי יניב תובנות יקרות ערך.

אתגר נוסף לניתוח דינמיקת MT in vivo באופן כללי, בניגוד לניתוח in vitro או ex vivo, הוא כלי התוכנה האוטומטיים המוגבלים שיכולים לחלץ פרמטרים של דינמיקה מנתונים in vivo. כיום, אחת הטכניקות הפופולריות והחזקות ביותר לניתוח קצוות MT פלוס עם תווית +TIP היא plusTipTracker^38,39, תוכנה מבוססת MATLAB המאפשרת מעקב וניתוח אוטומטי של פרמטרים דינמיים מרובים. יש לציין כי plusTipTracker מודד לא רק את צמיחת MT אלא גם התכווצות והצלה: בעוד שתוויות +TIP כגון EB1-GFP מקשרות רק לקצוות פלוס גדלים, plusTipTracker יכול להסיק באופן אלגוריתמי שיעורי הצטמקות ואירועי הצלה. עם זאת, בעוד ש- plusTripTracker יושם בהצלחה רבה בהקשרים רבים, כולל ניתוח רב-פרמטרי קודם של דינמיקת MT ex vivo בתאי Drosophila S2⁴⁰, plusTipTracker אינו אופטימלי לניתוח נתוני in vivo בהתחשב ביחס האות לרעש הנמוך שלהם. כתוצאה מכך, מחקרי in vivo של דינמיקת פלוס-קצה בדנדריטים 22,23,24,25,26,27 וב-NMJ 35 של דרוזופילה הסתמכו על יצירה ידנית וניתוח של קימוגרפים באמצעות תוכנה כגון ImageJ⁴¹, או על אסטרטגיות אוטומטיות למחצה הכוללות רכיבים אנושיים רבים בלולאה.

מחקר זה מציג זרימת עבודה ניסויית ואנליטית המפחיתה את התקורה הניסיונית והאנליטית הנדרשת לביצוע ניתוח לא פולשני ברמת הפולימר של דינמיקת MT פרה-סינפטית הן בדנדריטים חושיים והן במסוף האקסון המוטורי של זחלי דרוזופילה כוכב שלישי. הפרוטוקול משתמש בזחלים משותקים ושלמים ולכן נמנע מפציעות הידועות כמעוררות תגובות לחץ כמו גם מצבים לא פיזיולוגיים אחרים שעלולים להפריע לדינמיקה של MT in vivo. כדי לתייג MT פלוס-קצוות דינמיים, EB1-GFP מתבטא פאן-נוירוני באמצעות מערכת Gal4/UAS ⁴², המאפשרת הדמיה של MTs הן בדנדריטים והן ב-NMJ עם דרייבר יחיד. בעוד שחלק מהצעדים המוקדמים כפופים באופן בלתי נמנע לקבלת החלטות אנושיות, כגון בחירת דגימות בעלי חיים וזיהוי אזורים לתמונה, השלבים לאחר רכישת הנתונים הם אוטומטיים ברובם. באופן מכריע, אופטימיזציה של תוכנה חדשה אפשרה ניתוח אוטומטי וחסר פניות הדורש קלט אנושי מינימלי. בעוד ששיטות אחרות למעקב אחר חלקיקים זמינות 43,44,45, מחקר זה משתמש בתוכנה קניינית מכיוון שהיא התאימה היטב מבחינה אלגוריתמית כדי להתמודד עם האתגרים הספציפיים של מערך הנתונים הספציפי הזה. התוכנה זמינה כעת למשתמשים עבור מגוון יישומים. באופן ספציפי, השימוש בסינון דיפוזיה משפר קוהרנטיות⁴⁶ הוא חלק בלתי נפרד מפילוח אוטומטי והסרת רקע, ואלגוריתמים מותאמים אישית מיושמים במיוחד כדי להפוך את זיהוי החלקיקים לאוטומטי. אסטרטגיה זו יכולה להתמודד ביעילות עם יחס האות לרעש הנמוך הטמון בנתונים במחקר זה, כמו גם אתגרים אחרים, כגון תנועה של שביטים EB1-GFP דרך מישורי מוקד שונים. אמנם לא ניתן לבדוק באופן ממצה את הביצועים של תוכנה זו מול כל תוכנות ניתוח החלקיקים האחרות, אך הביצועים של האסטרטגיה הנוכחית השתוו או התקרבו לביצועים האנושיים הסטנדרטיים. יתר על כן, למיטב ידיעת המחברים, לא הייתה תוכנה אחרת שהוכשרה במיוחד על נתוני in vivo מדנדריטים חושיים ומהטרמינל הפרה-סינפטי. בהתחשב בכך שהביצועים של אלגוריתמים לניתוח תמונה הם לרוב ספציפיים מאוד לנתונים שעבורם הם תוכננו וכי ראייה ממוחשבת כללית עדיין אינה אפשרית, צפוי כי אימון התוכנה המתוארת לנתוני in vivo הספציפיים המעניינים הוא הגישה הנכונה ביותר מבחינה אלגוריתמית.

בהתחשב בעבודה הנרחבת על MTs^{דנדריטי} 22,23,24,25,26,27 כמו גם האיכות העקבית של הנתונים שניתן לרכוש ממערכת זו, אסטרטגיית רכישת התמונה וניתוח התוכנה אומתה לראשונה בדנדריטים חושיים של דרוזופילה. חשוב לציין, נמצא בדנדריטים כי השימוש במניעי Gal4 עצביים שונים, אפילו ברקע פראי זהה, מביא להבדלים משמעותיים בדינמיקה של EB1-GFP עקב הבדלים ברקע הגנטי, תוך הדגשת החשיבות של שימוש במנהל התקן Gal4 יחיד לתוצאות עקביות. אסטרטגיה זו שימשה לאחר מכן לניתוח רב-פרמטרי של דינמיקת EB1-GFP במסוף הפרה-סינפטי של NMJ. כדי להמחיש עוד יותר את הערך החקירתי של שיטה זו, נעשה שימוש באסטרטגיית הדמיה ותוכנה זו כדי להעריך את דינמיקת EB1-GFP הקדם-סינפטית והפוסט-סינפטית לאחר הפלת dTACC, הומולוג הדרוזופילה של משפחת TACC (טרנספורמציה של סליל מפותל חומצי)^47,48. עבודה קודמת בתאי Drosophila S2⁴⁰, כמו גם עבודה של לאורי ועמיתיו בחרוט הגידול Xenopus 49,50,51, הראו שבני משפחת TACC מווסתים את הדינמיקה של MT plus-end. יתר על כן, עדויות שדווחו לאחרונה מהדמיה אימונופלואורסצנטית קונפוקלית וסופר-רזולוציה הראו כי dTACC הוא מווסת מרכזי של MTs פרה-סינפטי במהלך מורפוגנזה עצבית⁵², מה שמעלה את השאלה האם dTACC מווסת דינמיקת MT חיה. דוח זה מדגים שיטה שאכן יכולה לזהות הבדלים בהתנהגויות MT חיות עם נוק-דאון dTACC. לפיכך, מחקר זה מציג שיטה in vivo שיכולה לזהות ולאפיין ביעילות מווסתים מרכזיים של דינמיקת MT בתוך הנוירון המתפתח, במיוחד בתא הפרה-סינפטי.

Protocol

1. דור דגימות דרוזופילה

1. בחר סמן MT פלוס מתאים. מחקר זה השתמש ב-EB1 מתויג GFP, סמן פלוס קצה מאופיין היטב עם אות חזק וברור^11,12. חלופות כוללות +TIPs אחרים כגון EB3^10,13, CLASP/Orbit⁵³ ו-CLIP-170⁵⁴.
2. השג או צור זבובים עם סמן MT בשליטה של מקדם כטב"מים (למשל, UAS-EB1-GFP).
3. בחר את מנהל ההתקן המתאים לרקמה הספציפי לרקמה. מחקר זה השתמש במניע הפאן-עצבי elaV-Gal4^58,59 כדי להניע ביטוי הן בדנדריטים חושיים והן ב-NMJ וב-221-Gal4^60,61 לביטוי ספציפי לדנדריטים.
4. גידול זבובים באמצעות טכניקות גידול זבובים סטנדרטיות^55,56. מומלץ להחזיק את הזבובים באינקובטורים לחים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס לביטוי אופטימלי של Gal4/UAS.
5. באמצעות טכניקות גנטיות סטנדרטיות של זבובים^55,56, בצע צלבים ליצירת זבובים כדי לבטא את סמן ה-MT plus-end בתאים/רקמות הרצויים.
   הערה: עבור כל שילוב של דוחף Gal4 ו-transgene, התכנון הניסיוני צריך לכלול ניסויי הוכחת היתכנות ואימות כדי לאפיין את המערכת ולמנוע ביטוי יתר של חפצים.

2. הגדרת ציוד

1. הקימו תחנת עבודה, הכוללת את הזבובים, ריאגנטים להרדמה, חומרי בנייה לשקופיות, סטריאומיקרוסקופ ומקור תאורה, קרוב למיקרוסקופ הקונפוקלי (כלומר, באותו החדר) כדי למזער את הזמן המושקע בין הכנת הדגימה להדמיה כדי להאריך את בריאותם וחיותם של הזחלים.
2. מכינים את חומר ההרדמה על ידי ערבוב תערובת כלורופורם של 9% (0.1 מ"ל כלורופורם ו-1.0 מ"ל שמן הלוקרבון) בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל. כדי למנוע היפרדות, ערבבו היטב על ידי היפוך השפופרת לפני הכנת כל שקופית חדשה.
3. הכן את שקופית הזכוכית: חותכים ארבע רצועות של סרט דו צדדי (רוחב ~15 מ"מ). יישר שניים מהחלקים על מגלשת הזכוכית, והשאיר רווח של ~5 מ"מ בין הרצועות. שכבו את שני החלקים הנותרים על גבי השניים הראשונים כדי להכפיל את עובי הסרט (איור 1C).
4. הוסף טיפה גדולה (~100 מיקרוליטר) של תערובת כלורופורם/שמן על מגלשת הזכוכית ברווח של 5 מ"מ בין חלקי הסרט (איור 1C).

3. הכנת דגימות זחל להדמיה

1. מלאו מיכל (למשל, צלחת 6 בארות) ב-1x PBS.
2. אסוף זחלי כוכב 3 מבקבוקון הזבוב באמצעות מלקחיים או מכשיר דומה. זהה זחלים בשלב המתאים על ידי התנהגות הזחילה שלהם ועל ידי נוכחותם של 9-12 ווים משוננים בולטים בפה. השתמשו בסטריאומיקרוסקופ כדי לסייע בבימוי הזחלים (איור 1D).
3. הניחו זחל ב-PBS והזיזו אותו בעדינות כדי לשטוף שאריות מזון או פסולת אחרת. יבש את הזחל בעדינות על רקמה עדינה.
4. הרדמו את הזחל על ידי הנחתו לתוך טיפת כלורופורם/שמן על השקופית מקטע 2 (איור 1C).
   הערה: הכיוון הגבי/גחוני של הזחל אינו קריטי מכיוון שניתן לזהות נוירונים חושיים ומוטוריים דרך הקוטיקולה השקופה על ידי הגדרת שלב המיקרוסקופ למישור המוקד המתאים, ללא קשר לכיוון הדגימה.
5. הניחו כיסוי #1.5 מעל. הדביקו את הכיסוי לסרט על ידי הפעלת לחץ עדין, ובכך שיתקו את הזחל מבלי לפגוע בו (איור 1C).
6. אטמו את החדר עם ג'לי נפט או לק.

4. הדמיה קונפוקלית בזמן-lapse של דגימות חיות

1. הכן מיקרוסקופ קונפוקלי ואת עדשת האובייקט פי 60 עם טבילה בשמן. הנח את הדגימה על הבמה (איור 1A,B).
2. השתמש בתוכנת הרכישה כדי להגדיר ניסויים.
   הערה: במחקר זה, כל סדרת הדמיה נרכשה במישור מוקד יחיד בניגוד למחסנית z.
   1. הגדר את משך קיטועי הזמן ל-30 שניות במרווח של 2 שניות, בסך הכל 16 פריימים.
   2. הגדר את החשיפה והעוצמה של הלייזר כדי להבטיח אות מספיק תוך הימנעות מרוויה והלבנת אור.
   3. עבור הדמיית EB1-GFP, הלייזר של 488 ננומטר הוגדר לזמן חשיפה של 100 אלפיות השנייה ולעוצמה של 30%. ערכים אלה עשויים להשתנות עבור שימושים שונים בפרוטוקול זה ויש לשנות אותם באופן אמפירי.
3. השתמש בעיניות המיקרוסקופ כדי למצוא את הזחל בתאורה ירוקה רחבה. מצא את הדנדריטים או ה-NMJs על ידי התאמת השלב לאט. אין לחשוף את הזחל לתאורה (שדה רחב או קונפוקלי) למשך זמן רב מהנדרש.
   1. דנדריטים נראים כרשתות דקיקות בצבע ירוק בהיר של עצבים שאפשר להבחין בהן בקלות מצרורות אקסונים ארוכים ועבים (איור 1E).
   2. NMJs מופיעים כקבוצות של בוטונים בודדים בצבע ירוק בהיר, בקוטר של כ-5 מיקרומטר, בקצוות של צרורות אקסונים ארוכים ועבים שמתפצלים מחוט העצב (איור 1F).
4. באמצעות הזנת המצלמה החיה, התמקד במהירות באזור העניין באמצעות תאורה של 488 ננומטר. הפסק מיד את התאורה ברגע שנמצא המיקוד המתאים כדי למנוע פוטוטוקסיות.
5. התחל רכישת תמונות. ניתן לזהות שביטים EB1 כפונקטות בהירות ותנועתיות.
6. עיין בפרוטוקולים שפורסמו בעבר לפרטים נוספים והנחיות בנושא הדמיה חיה פלואורסצנטית⁵⁷.

5. עיבוד וניתוח תמונה מבוססי תוכנה

1. נתח כל קובץ וידאו בנפרד. בתוך התוכנה (ממשק המשתמש מוצג באיור 2), בחר File | יבוא | רצף תמונות וגרור קבצי TIF בתיבה שמופיעה. צפו בתצוגה מקדימה של הסרטון.
2. בתפריט פרמטרי זיהוי , כוונן את פרמטרי התוכנה כדי להבטיח זיהוי של נקודות פיסוק גלויות בבירור בלבד והימנע מזיהוי אובייקטים מזויפים. לדוגמה, הפחתת עוצמת החלקיקים מביאה לרגישות רבה יותר של תוכנה לפיסוק אך מגדילה את התוצאות החיוביות השגויות הפוטנציאליות. הערכים המדויקים של הפרמטרים ישתנו באופן אמפירי. תיאורים של פרמטרי הזיהוי והמעקב זמינים מהמחברים על פי בקשה.
3. השתמשו במתכון מעקב אחר חלקיקי תאי עצב כדי לנתח את התמונה באמצעות הכפתור 'מהתחלה ' (חץ כחול, איור 2B). התוכנה תפיק תוצאות עבור פרמטרי המעקב המפורטים בטבלה 1 לגיליון האלקטרוני של התוצאות (תיבה ירוקה, איור 2B). כדי להקל על ניתוח ופרשנות מאוחרים יותר, ניתן לאחסן את התוצאות בתוכנת גיליון אלקטרוני באמצעות פונקציית הייצוא שנמצאת בסעיף גיליון אלקטרוני של תוצאות .
4. נווט את הסמן לנקודה שזוהתה בשלב הקודם ולחץ באמצעות לחצן העכבר השמאלי כדי לבחור או לבטל את הבחירה. ניתן לבחור מספר פונקטה בו זמנית באמצעות Ctrl + לחיצה שמאלית.
   הערה: בהתאם למטרות הפרויקט וליישומים, ניתן להשתמש בהיוריסטיקה נוספת כדי לסנן את הפיסוק. לדוגמה, נקודות עם אורך חיים של פחות מ-8-10 שניות (4-5 פריימים) עשויות להיות מושמטות מכיוון שהן אינן מציגות מידע מספיק על כל אירוע הגדילה. הצורך בהיוריסטיקות כאלה ישתנה מבחינה אמפירית. פרטים נוספים על פונקציונליות התוכנה זמינים מהמחברים על פי בקשה.

תוצאות

זבובים גודלו ממאגרים יציבים המבטאים באופן מכונן את הטרנסגן UAS-EB1-GFP באופן פאן-נוירוני (elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP)^58,59 או בנוירונים חושיים (221-Gal4; UAS-EB1-GFP)^60,61. EB1 נבחר למחקר זה מכיוון שהוא מתמקם באופן ספציפי בקצוות הגי...

Discussion

מאמר זה דן בפרוטוקול לביצוע הדמיה תוך-חיונית לא פולשנית של דינמיקת MT בדנדריטים וב-NMJ במהלך ההתפתחות. קלט אנושי נדרש במהלך שלבי הניסוי, כגון בבחירת בעלי חיים לתמונה, ועלול להכניס הטיה בתהליך איסוף הנתונים שלא ניתן להסיר באופן סביר. לפיכך, מטרה מרכזית של הפרוטוקול היא למזער...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Eppendorf	21008-959	Sample preparation
1000 µL TipOne pipette tips	USA Scientific	1111-2721	Sample preparation
200 µL TipOne pipette tips	USA Scientific	1120-8710	Sample preparation
221-Gal4 flies	Bloomington Drosophila Stock Center (US)	26259	Drosophila genetics/crosses
60x Objective Lens	Nikon	Plan Apo 60x Oil	Image acquisition
6-well plate	BD Falcon	353224	Sample preparation
Agar	MoorAgar	41084	Drosophila food
Aivia	DRVision LLC		Optimized as part of this study
Chloroform (stabilized with amylenes)	Sigma-Aldrich	C2432	Sample preparation
CO2 blowgun (for selection of flies for crosses)	Genesee	54-104	Drosophila genetics/crosses
CO2 bubbler (for selection of flies for crosses)	Genesee	59-180	Drosophila genetics/crosses
Cooled CCD camera	Hamamatsu	ORCA-R2	Image acquisition
Cornmeal	Genesee	62-101	Drosophila food
Distilled Water			Drosophila food
Double-sided tape	Scotch		Sample preparation
Drosophila vials	Genesee	32-109	Drosophila food
Droso-plugs (foam plugs for vials)	Genesee	59-200	Drosophila food
Dumont #5 Biologie Inox Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Sample preparation
elaV-Gal4;UAS-EB1-GFP;UAS-Dcr2 flies	Gift of Melissa Rolls (Penn State University)	N/A	Drosophila genetics/crosses
Ethanol (95%)	VWR	75811-022	Drosophila food
Fiber optic illuminator/light source for stereomicroscope	Nikon	NI-150	Sample preparation
Flypad (for selection of flies for crosses)	Genesee	59-172	Drosophila genetics/crosses
Forma Environmental Chamber/Incubator	ThermoFisher	3940	Drosophila genetics/crosses
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898	Sample preparation
Immersion Oil	Nikon	MXA22168	Image acquisition
Kimwipe Delicate Wipes	Fisher Scientific	34120	Sample preparation
Laser Merge Module	Spectral Applied Research	LMM-5	Image acquisition
Light Source for Confocal	Lumencor	SOLA 54-10021	Image acquisition
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software	Molecular Devices		Image acquisition
Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2 (#1.5)	VWR	48366-205	Sample preparation
Motorized inverted microscope with Perfect Focus System	Nikon	TI-ND6-PFS-S	Image acquisition
Motorized stage and shutters	Prior	Proscan III	Image acquisition
Multi-purpose scissors	Scotch	MMM1428	Sample preparation
Nail Polish	Sally Hansen	784179032016 074170382839	Sample preparation
Optical Filter	Chroma	ET480/40m	Image acquisition
P1000 Pipetman	Gilson	F123602	Sample preparation
P200 Pipetman	Gilson	F123601	Sample preparation
PBS (10X) ph 7.4	ThermoFisher	70011044	Sample preparation
Propionic Acid	Fisher	A258-500	Drosophila food
Spinning disk confocal scanner unit	Yokagawa	CSU-X1	Image acquisition
Stereomicroscope	Nikon	SMZ800N	Sample preparation
Sugar (Sucrose)	Genesee	62-112	Drosophila food
Superfrost Slide	VWR	48311-600	Sample preparation
Tegosept	Genesee	20-258	Drosophila food
UAS-dtacc-RNAi flies	Vienna Drosophila Resource Center (Vienna, Austria)	VDRC-101439	Drosophila genetics/crosses
Vaseline petroleum jelly	WB Mason	DVOCB311003	Sample preparation
Winsor & Newton Brush Regency Gold 520, Size 0	Staples	5012000	Drosophila genetics/crosses
Yeast	VWR	Torula Yeast IC90308580	Drosophila food
Yokogawa dichroic beamsplitter	Semrock	Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5	Image acquisition