A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
* These authors contributed equally
מחקר זה מציג אסטרטגיית הדמיה עצבית תוך-חיונית לא פולשנית בשילוב עם אסטרטגיית תוכנה חדשה להשגת מעקב וניתוח אוטומטיים ובלתי משוחדים של דינמיקת מיקרו-צינוריות (MT) פלוס קצה בדנדריטים החושיים ובצמתים העצביים-שריריים של דרוזופילה.
מיקרו-צינורות (MTs) ממלאים תפקידים קריטיים בהתפתחות עצבית, אך נותרו שאלות רבות לגבי המנגנונים המולקולריים של ויסות ותפקודם. יתר על כן, למרות ההתקדמות בהבנת MTs פוסט-סינפטי, הרבה פחות ידוע על התרומות של MTs פרה-סינפטי למורפוגנזה עצבית. בפרט, מחקרים על דינמיקת MT in vivo בדנדריטים חושיים של דרוזופילה הניבו תובנות משמעותיות לגבי התנהגות ברמת הפולימר. עם זאת, האתגרים הטכניים והאנליטיים הקשורים להדמיה חיה של הצומת העצבי-שרירי של הזבוב (NMJ) הגבילו מחקרים דומים של דינמיקת MT פרה-סינפטית. יתר על כן, בעוד שישנן אסטרטגיות תוכנה יעילות רבות לניתוח אוטומטי של דינמיקת MT במבחנה וב-ex vivo, נתוני in vivo דורשים לעתים קרובות קלט מפעיל משמעותי או ניתוח ידני לחלוטין עקב יחס אות לרעש נחות מטבעו בתמונות ומורפולוגיה תאית מורכבת. כדי לטפל בכך, מחקר זה אופטימיזציה של פלטפורמת תוכנה חדשה לזיהוי חלקיקים אוטומטי וחסר פניות in vivo. ניתוח רב-פרמטרי של תמונות קונפוקליות חיות של EB1-GFP המסומנות MTS בוצע הן בדנדריטים והן ב-NMJ של זחלי דרוזופילה ומצא הבדלים בולטים בהתנהגויות MT. דינמיקת MT נותחה בנוסף לאחר הפלת החלבון הקשור ל-MT (MAP) dTACC, מווסת מרכזי של התפתחות סינפסות דרוזופילה, וזיהתה שינויים מובהקים סטטיסטית בדינמיקת MT בהשוואה לסוג הפראי. תוצאות אלה מדגימות כי אסטרטגיה חדשה זו לניתוח רב-פרמטרי אוטומטי של דינמיקת MT קדם-סינפטית ופוסט-סינפטית ברמת הפולימר מפחיתה משמעותית את הקריטריונים של אדם בלולאה. המחקר מראה עוד את התועלת של שיטה זו בזיהוי התנהגויות MT מובחנות בעת נוקדאון dTACC, מה שמצביע על יישום עתידי אפשרי עבור מסכים פונקציונליים של גורמים המווסתים את דינמיקת MT in vivo. יישומים עתידיים של שיטה זו עשויים להתמקד גם בהבהרת סוג התא ו/או התנהגויות MT ספציפיות לתא, והדמיה מתאמת רב-צבעונית של EB1-GFP עם סמנים תאיים ותת-תאיים אחרים מעניינים.
תאים מתארגנים ליצירת מבנים פונקציונליים באמצעות תיאום של שינויים תוך-תאיים ובין-תאיים באמצעות מורפוגנזה. דוגמה יוצאת דופן למורפוגנזה היא התפתחות המבנה העצבי המיוחד ביותר. נוירונים מציגים קיטוב יוצא דופן, שבו הם מרחיבים שני סוגים שונים של תהליכים מבניים ותפקודיים, דנדריטים ואקסונים1, שיכולים להשיג אורכים עצומים. המורכבות של התפתחות עצבית נובעת לא רק מהגודל העצום של דנדריטים ואקסונים אלא גם מהקושי ליצור את הגיאומטריות המסועפות המורכבות שלהם 2,3. מורפוגנזה עצבית והשלכותיה על למידה וזיכרון4 מניעים את החקירה המתמשכת הן של הבקרה הגנטית והן של המנגנונים הביולוגיים של התא הבסיסיים. מנגנונים כאלה כוללים, אך אינם מוגבלים להובלה תוך-תאית של הממברנה והסידורים מחדש הרבים של השלד הציטולוגי הדרושים לשינויים במורפולוגיה העצבית 1,2,3.
מחקרים על מורפוגנזה עצבית הניבו מגוון טכניקות הדמיה מתקדמות. שיטות סטטיות, כגון מיקרוסקופ אלקטרונים או מיקרוסקופ פלואורסצנטי של בדיקות קבועות, נמצאות בשימוש נרחב לביצוע ניתוח מורפולוגי ומבני ברזולוציה גבוהה. עם זאת, מלבד החפצים הבלתי נמנעים לכל שיטת שימור, הדמיה סטטית אינה יכולה ללכוד את השינויים הדינמיים העומדים בבסיס המורפוגנזה. לפיכך, תובנות מרכזיות רבות מקורן במיקרוסקופיה פלואורסצנטית של רקמות חיות. עבודה מוקדמת של ליכטמן ועמיתיו 5,6,7 השתמשה בהדמיה in vivo של מערכת העצבים של היונקים כדי לחקור התחדשות/ניוון אקסונים, ארגון רכיבים סינפטיים והובלה אקסונלית ארוכת טווח. יתר על כן, מחקרים מכוננים באקספלנטים עצביים ראשוניים היו קריטיים לביסוס החשיבות של דינמיקת מיקרו-צינוריות (MT) להתארכות אקסונלית ותנועתיות 8,9. באופן מכריע, מחקרי אקספלנט עצביים מוקדמים ביססו את השימוש בחלבונים משפחתיים קושרים קצה (EBs) מתויגים פלואורסצנטיים כדי להשיג תובנות יקרות ערך לגבי דינמיקת MT פלוס קצה בפיתוח נוירונים ברמה של פולימרי MT בודדים10. מחקרים אלה נבעו מתצפיות שבן משפחת EB EB1 מתמקם באופן מועדף ל-MT plus מסתיים11 ב-S. cerevisiae12 ובתאים מתורבתים13. מאז, EB1 וחלבונים אחרים למעקב אחר קצה פלוס (+TIPs)14,15 היו בשימוש נרחב במחקרי in vivo של חוסר יציבות דינמית של MT16, כולל בהקשר של התפתחות עצבית17.
דרוזופילה הוא מודל רב עוצמה למחקרי הדמיה in vivo של דינמיקת MT במהלך התפתחות עצבית בשל הכלים הגנטיים וההדמיה העצומים הזמינים למחקרי זבובים18,19 כמו גם הדמיון במבנה ובתפקוד בין דרוזופילה לנוירונים של בעלי חוליות1. מחקר מוקדם מרכזי של הצומת העצבי-שרירי (NMJ) של זחלי דרוזופילה ביצע הדמיה לא פולשנית חוזרת ונשנית של סמן ממברנה פלואורסצנטית דרך הציפורן השקופה של בעלי חיים שלמים כדי לתעד מורפוגנזה טרמינלית פרה-סינפטית20. באמצעות שיטה דומה להדמיית זחלי דרוזופילה חיים שלמים, ניתנה הדגמה ראשונית של ניתוח תת-תאי ברמת החלקיקים של תנועה תהליכית של מטענים ממונעים באקסונים21. לאחרונה, מחקרים קפדניים של רולס ועמיתיו בדנדריטים החושיים של זחלי דרוזופילה שלמים 22,23,24,25,26,27 אפיינו דינמיקה פוסט-סינפטית של MT פלוס-קצה על ידי ביצוע מעקב אחר חלקיקים וניתוח של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) המתויג EB1. מחקרים כאלה בדרוזופילה 22,23,24,25,26,27 ומערכות אחרות 28,29,30,31,32 קידמו משמעותית את ההבנה של התנהגות פולימר יחיד של MT פלוס מסתיים בדנדריטים של נוירונים מתפתחים 33.
למרות מחקרי in vivo המרשימים של דינמיקת MT פוסט-סינפטית 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31, היו הרבה פחות מחקרים דומים של דינמיקת MT פרה-סינפטית במסוף האקסון המתפתח. דינמיקת MT בזחל הדרוזופילה NMJ נחקרה באמצעות מיקרוסקופ כתמים פלואורסצנטי (FSM) והתאוששות פלואורסצנטית לאחר פוטוהלבנה (FRAP)34. טכניקות אלה מעריכות את הקינטיקה הכוללת של טובולין אך לא את ההתנהגות של קצוות MT פלוס בודדים. נכון לכתיבת שורות אלה, הייתה חקירה אחת יחידה של MT פלוס בודד ב-Drosophila NMJ: מחקר זה שילב הדמיה חיה עם ניתוח ידני של קימוגרפים כדי לאפיין אוכלוסייה של דינמי, EB1-GFP המסומנת כ"MTs חלוצית" שנראתה נבדלת מאוכלוסייה רחבה יותר של MTs35 מיוצבים. היעדר מחקר זה על דינמיקת MT פרה-סינפטית עשוי לנבוע לפחות בחלקו מהאנטומיה: בעוד שזה פשוט יחסית להשיג תמונות של דנדריטים בשל קרבתם לציפורן הזחל, NMJs חסומים על ידי רקמות אחרות, מה שמקשה על רכישת תמונות עם יחס אות לרעש מספיק לניתוח רמת החלקיקים. עם זאת, בהתחשב בחשיבותם המבוססת של ה-MTs הקדם-סינפטי למורפוגנזה וייצוב סינפטי36, כמו גם הקשרים שלהם להפרעות נוירו-התפתחותיות ונוירודגנרטיביות37, סביר להניח שגישור על הפער הזה בין הבנת MTs קדם-סינפטי ופוסט-סינפטי יניב תובנות יקרות ערך.
אתגר נוסף לניתוח דינמיקת MT in vivo באופן כללי, בניגוד לניתוח in vitro או ex vivo, הוא כלי התוכנה האוטומטיים המוגבלים שיכולים לחלץ פרמטרים של דינמיקה מנתונים in vivo. כיום, אחת הטכניקות הפופולריות והחזקות ביותר לניתוח קצוות MT פלוס עם תווית +TIP היא plusTipTracker38,39, תוכנה מבוססת MATLAB המאפשרת מעקב וניתוח אוטומטי של פרמטרים דינמיים מרובים. יש לציין כי plusTipTracker מודד לא רק את צמיחת MT אלא גם התכווצות והצלה: בעוד שתוויות +TIP כגון EB1-GFP מקשרות רק לקצוות פלוס גדלים, plusTipTracker יכול להסיק באופן אלגוריתמי שיעורי הצטמקות ואירועי הצלה. עם זאת, בעוד ש- plusTripTracker יושם בהצלחה רבה בהקשרים רבים, כולל ניתוח רב-פרמטרי קודם של דינמיקת MT ex vivo בתאי Drosophila S240, plusTipTracker אינו אופטימלי לניתוח נתוני in vivo בהתחשב ביחס האות לרעש הנמוך שלהם. כתוצאה מכך, מחקרי in vivo של דינמיקת פלוס-קצה בדנדריטים 22,23,24,25,26,27 וב-NMJ 35 של דרוזופילה הסתמכו על יצירה ידנית וניתוח של קימוגרפים באמצעות תוכנה כגון ImageJ41, או על אסטרטגיות אוטומטיות למחצה הכוללות רכיבים אנושיים רבים בלולאה.
מחקר זה מציג זרימת עבודה ניסויית ואנליטית המפחיתה את התקורה הניסיונית והאנליטית הנדרשת לביצוע ניתוח לא פולשני ברמת הפולימר של דינמיקת MT פרה-סינפטית הן בדנדריטים חושיים והן במסוף האקסון המוטורי של זחלי דרוזופילה כוכב שלישי. הפרוטוקול משתמש בזחלים משותקים ושלמים ולכן נמנע מפציעות הידועות כמעוררות תגובות לחץ כמו גם מצבים לא פיזיולוגיים אחרים שעלולים להפריע לדינמיקה של MT in vivo. כדי לתייג MT פלוס-קצוות דינמיים, EB1-GFP מתבטא פאן-נוירוני באמצעות מערכת Gal4/UAS 42, המאפשרת הדמיה של MTs הן בדנדריטים והן ב-NMJ עם דרייבר יחיד. בעוד שחלק מהצעדים המוקדמים כפופים באופן בלתי נמנע לקבלת החלטות אנושיות, כגון בחירת דגימות בעלי חיים וזיהוי אזורים לתמונה, השלבים לאחר רכישת הנתונים הם אוטומטיים ברובם. באופן מכריע, אופטימיזציה של תוכנה חדשה אפשרה ניתוח אוטומטי וחסר פניות הדורש קלט אנושי מינימלי. בעוד ששיטות אחרות למעקב אחר חלקיקים זמינות 43,44,45, מחקר זה משתמש בתוכנה קניינית מכיוון שהיא התאימה היטב מבחינה אלגוריתמית כדי להתמודד עם האתגרים הספציפיים של מערך הנתונים הספציפי הזה. התוכנה זמינה כעת למשתמשים עבור מגוון יישומים. באופן ספציפי, השימוש בסינון דיפוזיה משפר קוהרנטיות46 הוא חלק בלתי נפרד מפילוח אוטומטי והסרת רקע, ואלגוריתמים מותאמים אישית מיושמים במיוחד כדי להפוך את זיהוי החלקיקים לאוטומטי. אסטרטגיה זו יכולה להתמודד ביעילות עם יחס האות לרעש הנמוך הטמון בנתונים במחקר זה, כמו גם אתגרים אחרים, כגון תנועה של שביטים EB1-GFP דרך מישורי מוקד שונים. אמנם לא ניתן לבדוק באופן ממצה את הביצועים של תוכנה זו מול כל תוכנות ניתוח החלקיקים האחרות, אך הביצועים של האסטרטגיה הנוכחית השתוו או התקרבו לביצועים האנושיים הסטנדרטיים. יתר על כן, למיטב ידיעת המחברים, לא הייתה תוכנה אחרת שהוכשרה במיוחד על נתוני in vivo מדנדריטים חושיים ומהטרמינל הפרה-סינפטי. בהתחשב בכך שהביצועים של אלגוריתמים לניתוח תמונה הם לרוב ספציפיים מאוד לנתונים שעבורם הם תוכננו וכי ראייה ממוחשבת כללית עדיין אינה אפשרית, צפוי כי אימון התוכנה המתוארת לנתוני in vivo הספציפיים המעניינים הוא הגישה הנכונה ביותר מבחינה אלגוריתמית.
בהתחשב בעבודה הנרחבת על MTsדנדריטי 22,23,24,25,26,27 כמו גם האיכות העקבית של הנתונים שניתן לרכוש ממערכת זו, אסטרטגיית רכישת התמונה וניתוח התוכנה אומתה לראשונה בדנדריטים חושיים של דרוזופילה. חשוב לציין, נמצא בדנדריטים כי השימוש במניעי Gal4 עצביים שונים, אפילו ברקע פראי זהה, מביא להבדלים משמעותיים בדינמיקה של EB1-GFP עקב הבדלים ברקע הגנטי, תוך הדגשת החשיבות של שימוש במנהל התקן Gal4 יחיד לתוצאות עקביות. אסטרטגיה זו שימשה לאחר מכן לניתוח רב-פרמטרי של דינמיקת EB1-GFP במסוף הפרה-סינפטי של NMJ. כדי להמחיש עוד יותר את הערך החקירתי של שיטה זו, נעשה שימוש באסטרטגיית הדמיה ותוכנה זו כדי להעריך את דינמיקת EB1-GFP הקדם-סינפטית והפוסט-סינפטית לאחר הפלת dTACC, הומולוג הדרוזופילה של משפחת TACC (טרנספורמציה של סליל מפותל חומצי)47,48. עבודה קודמת בתאי Drosophila S240, כמו גם עבודה של לאורי ועמיתיו בחרוט הגידול Xenopus 49,50,51, הראו שבני משפחת TACC מווסתים את הדינמיקה של MT plus-end. יתר על כן, עדויות שדווחו לאחרונה מהדמיה אימונופלואורסצנטית קונפוקלית וסופר-רזולוציה הראו כי dTACC הוא מווסת מרכזי של MTs פרה-סינפטי במהלך מורפוגנזה עצבית52, מה שמעלה את השאלה האם dTACC מווסת דינמיקת MT חיה. דוח זה מדגים שיטה שאכן יכולה לזהות הבדלים בהתנהגויות MT חיות עם נוק-דאון dTACC. לפיכך, מחקר זה מציג שיטה in vivo שיכולה לזהות ולאפיין ביעילות מווסתים מרכזיים של דינמיקת MT בתוך הנוירון המתפתח, במיוחד בתא הפרה-סינפטי.
1. דור דגימות דרוזופילה
2. הגדרת ציוד
3. הכנת דגימות זחל להדמיה
4. הדמיה קונפוקלית בזמן-lapse של דגימות חיות
5. עיבוד וניתוח תמונה מבוססי תוכנה
זבובים גודלו ממאגרים יציבים המבטאים באופן מכונן את הטרנסגן UAS-EB1-GFP באופן פאן-נוירוני (elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP)58,59 או בנוירונים חושיים (221-Gal4; UAS-EB1-GFP)60,61. EB1 נבחר למחקר זה מכיוון שהוא מתמקם באופן ספציפי בקצוות הגי...
מאמר זה דן בפרוטוקול לביצוע הדמיה תוך-חיונית לא פולשנית של דינמיקת MT בדנדריטים וב-NMJ במהלך ההתפתחות. קלט אנושי נדרש במהלך שלבי הניסוי, כגון בבחירת בעלי חיים לתמונה, ועלול להכניס הטיה בתהליך איסוף הנתונים שלא ניתן להסיר באופן סביר. לפיכך, מטרה מרכזית של הפרוטוקול היא למזער...
המחברים הויין לאי, מייקל ג'ונס, הידקי ססאקי, לוצ'יאנו א.ג. לוקאס, סם אלוורת' (לשעבר) וג'יימס שי-ג'ונג לי הם עובדים של DRVision Technologies LLC, המייצרת את התוכנה המשמשת בפרוטוקול זה.
אנו מודים לעמיתינו במעבדת Van Vactor וב-DRVision בנוסף לד"ר מקס היימן, פסקל קייזר, דיוויד פלמן ותומאס שוורץ על דיון מועיל. אנו מודים לד"ר מליסה רולס על שסיפקה בנדיבות את ה-elaV-Gal4; כטב"ם-EB1-GFP; UAS-DCR2 ו-221-Gal4; מניות UAS-EB1-GFP ששימשו במחקר זה. אנו מודים לד"ר ג'ניפר ווטרס ואנה ג'וסט ממרכז ההדמיה של Nikon בהרווארד על המומחיות במיקרוסקופ אור. עבודה זו ממומנת על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (F31 NS101756-03 ל-V.T.C., SBIR 1R43MH100780-01D ל-J.S.L).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 21008-959 | Sample preparation |
1000 µL TipOne pipette tips | USA Scientific | 1111-2721 | Sample preparation |
200 µL TipOne pipette tips | USA Scientific | 1120-8710 | Sample preparation |
221-Gal4 flies | Bloomington Drosophila Stock Center (US) | 26259 | Drosophila genetics/crosses |
60x Objective Lens | Nikon | Plan Apo 60x Oil | Image acquisition |
6-well plate | BD Falcon | 353224 | Sample preparation |
Agar | MoorAgar | 41084 | Drosophila food |
Aivia | DRVision LLC | Optimized as part of this study | |
Chloroform (stabilized with amylenes) | Sigma-Aldrich | C2432 | Sample preparation |
CO2 blowgun (for selection of flies for crosses) | Genesee | 54-104 | Drosophila genetics/crosses |
CO2 bubbler (for selection of flies for crosses) | Genesee | 59-180 | Drosophila genetics/crosses |
Cooled CCD camera | Hamamatsu | ORCA-R2 | Image acquisition |
Cornmeal | Genesee | 62-101 | Drosophila food |
Distilled Water | Drosophila food | ||
Double-sided tape | Scotch | Sample preparation | |
Drosophila vials | Genesee | 32-109 | Drosophila food |
Droso-plugs (foam plugs for vials) | Genesee | 59-200 | Drosophila food |
Dumont #5 Biologie Inox Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Sample preparation |
elaV-Gal4;UAS-EB1-GFP;UAS-Dcr2 flies | Gift of Melissa Rolls (Penn State University) | N/A | Drosophila genetics/crosses |
Ethanol (95%) | VWR | 75811-022 | Drosophila food |
Fiber optic illuminator/light source for stereomicroscope | Nikon | NI-150 | Sample preparation |
Flypad (for selection of flies for crosses) | Genesee | 59-172 | Drosophila genetics/crosses |
Forma Environmental Chamber/Incubator | ThermoFisher | 3940 | Drosophila genetics/crosses |
Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | Sample preparation |
Immersion Oil | Nikon | MXA22168 | Image acquisition |
Kimwipe Delicate Wipes | Fisher Scientific | 34120 | Sample preparation |
Laser Merge Module | Spectral Applied Research | LMM-5 | Image acquisition |
Light Source for Confocal | Lumencor | SOLA 54-10021 | Image acquisition |
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software | Molecular Devices | Image acquisition | |
Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2 (#1.5) | VWR | 48366-205 | Sample preparation |
Motorized inverted microscope with Perfect Focus System | Nikon | TI-ND6-PFS-S | Image acquisition |
Motorized stage and shutters | Prior | Proscan III | Image acquisition |
Multi-purpose scissors | Scotch | MMM1428 | Sample preparation |
Nail Polish | Sally Hansen | 784179032016 074170382839 | Sample preparation |
Optical Filter | Chroma | ET480/40m | Image acquisition |
P1000 Pipetman | Gilson | F123602 | Sample preparation |
P200 Pipetman | Gilson | F123601 | Sample preparation |
PBS (10X) ph 7.4 | ThermoFisher | 70011044 | Sample preparation |
Propionic Acid | Fisher | A258-500 | Drosophila food |
Spinning disk confocal scanner unit | Yokagawa | CSU-X1 | Image acquisition |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | Sample preparation |
Sugar (Sucrose) | Genesee | 62-112 | Drosophila food |
Superfrost Slide | VWR | 48311-600 | Sample preparation |
Tegosept | Genesee | 20-258 | Drosophila food |
UAS-dtacc-RNAi flies | Vienna Drosophila Resource Center (Vienna, Austria) | VDRC-101439 | Drosophila genetics/crosses |
Vaseline petroleum jelly | WB Mason | DVOCB311003 | Sample preparation |
Winsor & Newton Brush Regency Gold 520, Size 0 | Staples | 5012000 | Drosophila genetics/crosses |
Yeast | VWR | Torula Yeast IC90308580 | Drosophila food |
Yokogawa dichroic beamsplitter | Semrock | Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 | Image acquisition |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved