Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Method Article
* Bu yazarlar eşit katkıda bulunmuştur
Bu çalışma, Drosophila'nın duyusal dendritlerinde ve nöromüsküler kavşaklarında in vivo mikrotübül (MT) artı uç dinamiklerinin otomatik, tarafsız izlenmesini ve analizini sağlamak için yeni bir yazılım stratejisiyle birleştirilmiş noninvaziv bir intravital nöronal görüntüleme stratejisi sunmaktadır.
Mikrotübüller (MT'ler) nöronal gelişimde kritik roller oynar, ancak regülasyonlarının ve işlevlerinin moleküler mekanizmaları hakkında birçok soru devam etmektedir. Ayrıca, postsinaptik MT'lerin anlaşılmasındaki ilerlemeye rağmen, presinaptik MT'lerin nöronal morfogeneze katkıları hakkında çok daha az şey bilinmektedir. Özellikle, Drosophila duyusal dendritlerindeki in vivo MT dinamikleri üzerine yapılan çalışmalar, polimer düzeyinde davranış hakkında önemli bilgiler sağlamıştır. Bununla birlikte, sinek nöromüsküler kavşağının (NMJ) canlı görüntülenmesi ile ilişkili teknik ve analitik zorluklar, presinaptik MT dinamikleri ile ilgili karşılaştırılabilir çalışmaları sınırlamıştır. Ayrıca, MT dinamiklerinin in vitro ve ex vivo otomatik analizi için oldukça etkili birçok yazılım stratejisi olsa da, in vivo veriler, görüntülerdeki doğal olarak düşük sinyal-gürültü oranı ve karmaşık hücresel morfoloji nedeniyle genellikle önemli operatör girdisi veya tamamen manuel analiz gerektirir. Bunu ele almak için bu çalışma, otomatik ve tarafsız in vivo parçacık tespiti için yeni bir yazılım platformunu optimize etti. EB1-GFP işaretli MT'lerin canlı hızlandırılmış konfokal görüntülerinin multiparametrik analizi, hem dendritlerde hem de Drosophila larvalarının NMJ'sinde gerçekleştirildi ve MT davranışlarında çarpıcı farklılıklar buldu. MT dinamikleri ayrıca, Drosophila sinaps gelişiminin önemli bir düzenleyicisi olan MT ile ilişkili protein (MAP) dTACC'nin yıkılmasının ardından analiz edildi ve vahşi tipe kıyasla MT dinamiklerinde istatistiksel olarak anlamlı değişiklikler tespit edildi. Bu sonuçlar, polimer düzeyinde hem postsinaptik öncesi hem de postsinaptik MT dinamiklerinin otomatik multiparametrik analizi için bu yeni stratejinin, döngüdeki insan kriterlerini önemli ölçüde azalttığını göstermektedir. Çalışma ayrıca, bu yöntemin dTACC-knockdown üzerine farklı MT davranışlarını tespit etmedeki faydasını göstermektedir ve bu da MT dinamiklerini in vivo olarak düzenleyen faktörlerin fonksiyonel ekranları için gelecekteki olası bir uygulamayı göstermektedir. Bu yöntemin gelecekteki uygulamaları, hücre tipi ve / veya bölmeye özgü MT davranışlarının aydınlatılmasına ve EB1-GFP'nin diğer hücresel ve hücre altı belirteçlerle çok renkli korelasyonlu görüntülenmesine de odaklanabilir.
Hücreler, morfogenez yoluyla hücre içi ve hücre içi değişikliklerin koordinasyonu yoluyla fonksiyonel yapılar oluşturmak üzere organize olurlar. Morfogenezin dikkate değer bir örneği, son derece uzmanlaşmış nöronal yapının gelişmesidir. Nöronlar, yapısal ve işlevsel olarak farklı iki işlem türünü, dendritleri ve aksonları1 genişlettikleri ve muazzam uzunluklara ulaşabildikleri dikkate değer bir polarizasyon sergilerler. Nöronal gelişimin karmaşıklığı, yalnızca dendritlerin ve aksonların büyüklüğünden değil, aynı zamanda karmaşık dallara ayrılmış geometrilerini oluşturmadaki zorluktan da kaynaklanmaktadır 2,3. Nöronal morfogenez ve bunun öğrenme ve hafızadaki sonuçları4, hem genetik kontrolünün hem de altta yatan hücre biyolojik mekanizmalarının devam eden araştırmasını motive eder. Bu tür mekanizmalar, bunlarla sınırlı olmamak üzere, hücre içi zar taşınmasını ve nöronal morfolojideki değişiklikler için gereken birçok hücre iskeleti yeniden düzenlemesini içerir 1,2,3.
Nöronal morfogenez çalışmaları, çeşitli ileri görselleştirme teknikleri üretmiştir. Elektron mikroskobu veya sabit probların floresan mikroskobu gibi statik yöntemler, yüksek çözünürlüklü morfolojik ve yapısal analizler yapmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, herhangi bir koruma yöntemi için kaçınılmaz olan eserlerin yanı sıra, statik görselleştirme, morfogenezin temelini oluşturan dinamik değişiklikleri yakalayamaz. Bu nedenle, birçok önemli içgörü, canlı dokuların hızlandırılmış floresan mikroskobundan kaynaklanmaktadır. Lichtman ve meslektaşları 5,6,7 tarafından yapılan erken çalışmalar, akson rejenerasyonu/dejenerasyonu, sinaptik bileşenlerin organizasyonu ve uzun menzilli aksonal taşımayı araştırmak için memeli sinir sisteminin in vivo görüntülemesini kullandı. Ayrıca, primer nöronal eksplantlarda yapılan ufuk açıcı çalışmalar, mikrotübül (MT) dinamiklerinin aksonal uzama ve motilite için önemini belirlemek için kritik öneme sahipti 8,9. En önemlisi, erken nöronal eksplant çalışmaları, bireysel MT polimerleri10 düzeyinde nöronların geliştirilmesinde MT artı uç dinamikleri hakkında paha biçilmez bilgiler elde etmek için floresan etiketli uç bağlayıcı aile proteinlerinin (EB'ler) kullanımını ortaya koymuştur. Bu çalışmalar, EB ailesi üyesi EB1'in tercihen S. cerevisiae12'de ve kültürlenmiş hücrelerde13 MT artı uçlar11'e lokalize olduğu gözlemlerinden ortaya çıkmıştır. O zamandan beri, EB1 ve diğer artı uç izleme proteinleri (+TIP'ler)14,15, nöronal gelişim17 bağlamı da dahil olmak üzere, MT dinamik instabilitesinin16 in vivo çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır.
Drosophila, sinek çalışmaları18,19 için mevcut olan geniş genetik ve görüntüleme araçlarının yanı sıra Drosophila ve omurgalı nöronları arasındaki yapı ve işlev benzerlikleri nedeniyle, nöronal gelişim sırasında MT dinamiklerinin in vivo görüntüleme çalışmaları için güçlü bir modeldir1. Drosophila larvalarının nöromüsküler kavşağı (NMJ) ile ilgili önemli bir erken çalışma, presinaptik terminal morfogenezi20'yi belgelemek için sağlam hayvanların yarı saydam kütikülü boyunca bir floresan membran markörünün tekrarlanan noninvaziv görüntülemesini gerçekleştirdi. Bütün, canlı Drosophila larvalarını görüntülemek için benzer bir yöntem kullanılarak, aksonlardaki motor yüklerin işlemsel hareketinin hücre altı, parçacık düzeyinde analizinin ilk gösterimi sağlandı21. Daha yakın zamanlarda, Rolls ve meslektaşları tarafından bozulmamış Drosophila larvalarınınduyusal dendritleri üzerinde yapılan titiz çalışmalar 22,23,24,25,26,27, yeşil floresan proteini (GFP) etiketli EB1'in partikül takibi ve analizini gerçekleştirerek postsinaptik MT artı uç dinamiklerini karakterize etti. Drosophila 22,23,24,25,26,27 ve diğer sistemler 28,29,30,31,32'deki bu tür çalışmalar, MT'nin tek polimer davranışı ve gelişmekte olan nöronların dendritlerindeki uçların önemli ölçüde ileri düzeyde anlaşılmasına sahiptir 33.
Postsinaptik MT dinamikleri 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ile ilgili etkileyici in vivo çalışmalara rağmen, gelişmekte olan akson terminalinde presinaptik MT dinamikleri ile ilgili çok daha az karşılaştırılabilir çalışma yapılmıştır. Drosophila larva NMJ'deki MT dinamikleri, floresan benek mikroskobu (FSM) ve fotoağartma sonrası floresan geri kazanımı (FRAP) kullanılarak incelenmiştir34. Bu teknikler genel tübülin kinetiğini değerlendirir, ancak tek tek MT artı uçlarının davranışını değerlendirmez. Bu yazı itibariyle, Drosophila NMJ'de bireysel MT artı uçlarının tek bir araştırması yapılmıştır: Bu çalışma, daha geniş bir stabilize MT popülasyonundan farklı görünen dinamik, EB1-GFP etiketli "öncü MT'ler" popülasyonunu karakterize etmek için canlı hızlandırılmış görüntülemeyi kymografların manuel analiziyle birleştirdi35. Presinaptik MT dinamikleri üzerine yapılan bu araştırma eksikliği, en azından kısmen anatomiye bağlı olabilir: Larva kütikülüne yakınlıkları nedeniyle dendritlerin görüntülerini elde etmek nispeten basit olsa da, NMJ'ler diğer dokular tarafından engellenir ve bu da parçacık düzeyinde analiz için yeterli sinyal-gürültü oranına sahip görüntülerin elde edilmesini zorlaştırır. Bununla birlikte, presinaptik MT'lerin sinaptik morfogenez ve stabilizasyon36 için köklü önemi ve nörogelişimsel ve nörodejeneratif bozukluklar37 ile bağlantıları göz önüne alındığında, postsinaptik öncesi ve sonrası MT'lerin anlaşılması arasındaki bu boşluğu kapatmanın paha biçilmez içgörüler sağlaması muhtemeldir.
İn vitro veya ex vivo analizin aksine, genel olarak in vivo MT dinamiklerinin analizine yönelik ek bir zorluk, in vivo verilerden dinamik parametreleri çıkarabilen sınırlı otomatik yazılım araçlarıdır. Şu anda, +TIP etiketli MT artı uçlarının analizi için en popüler ve güçlü tekniklerden biri, çoklu dinamik parametrelerin otomatik olarak izlenmesine ve analizine izin veren MATLAB tabanlı bir yazılım olan plusTipTracker 38,39'dur. Özellikle, plusTipTracker yalnızca MT büyümesini değil, aynı zamanda büzülmeyi ve kurtarmaları da ölçer: EB1-GFP gibi +TIP etiketleri yalnızca büyüyen artı uçlarla ilişkilendirilirken, plusTipTracker büzülme oranlarını ve kurtarma olaylarını algoritmik olarak çıkarabilir. Bununla birlikte, plusTripTracker, Drosophila S2 hücrelerinde40 ex vivo MT dinamiklerinin önceki multiparametrik analizi de dahil olmak üzere birçok bağlama çok başarılı bir şekilde uygulanmış olsa da, plusTipTracker, daha düşük sinyal-gürültü oranı göz önüne alındığında in vivo verilerin analizi için optimal değildir. Sonuç olarak, dendritler 22,23,24,25,26,27 ve Drosophila'nın NMJ 35'indeki artı uç dinamiklerinin in vivo çalışmaları, ImageJ41 gibi yazılımlar kullanılarak kimografilerin manuel olarak üretilmesine ve analizine veya çok sayıda döngüdeki insan bileşenini içeren yarı otomatik stratejilere dayanmıştır.
Bu çalışma, hem duyusal dendritlerde hem de Drosophila üçüncü instar larvalarının motor akson terminalinde presinaptik MT dinamiklerinin noninvaziv polimer düzeyinde analizini gerçekleştirmek için gereken deneysel ve analitik ek yükü azaltan deneysel ve analitik bir iş akışı sunmaktadır. Protokol hareketsizleştirilmiş, sağlam larvaları kullanır ve bu nedenle stres tepkilerini tetiklediği bilinen yaralanmaların yanı sıra in vivo MT dinamiklerini bozabilecek diğer fizyolojik olmayan durumları önler. Dinamik MT artı uçlarını etiketlemek için, EB1-GFP, Gal4/UAS sistemi42 kullanılarak pan-nöronal olarak eksprese edilir ve hem dendritlerde hem de NMJ'de MT'lerin tek bir sürücü ile görselleştirilmesine olanak tanır. Hayvan örneklerinin seçimi ve görüntülenecek bölgelerin belirlenmesi gibi bazı erken adımlar kaçınılmaz olarak insan karar verme sürecine tabi olsa da, veri toplamayı takip eden adımlar büyük ölçüde otomatiktir. En önemlisi, yeni bir yazılımın optimizasyonu, minimum insan girdisi gerektiren otomatik, tarafsız analiz sağladı. Diğer parçacık izleme yöntemlerimevcut olsa da 43,44,45, bu çalışma, bu belirli veri setinin belirli zorluklarını ele almak için algoritmik olarak çok uygun olduğu için tescilli bir yazılım kullanmaktadır. Yazılım artık çeşitli uygulamalar için kullanıcılar tarafından kullanılabilir. Spesifik olarak, tutarlılığı artıran difüzyon filtrelemenin46 kullanımı, otomatik segmentasyon ve arka plan kaldırmanın ayrılmaz bir parçasıdır ve özellikle partikül algılama ve izlemeyi otomatikleştirmek için özel algoritmalar uygulanır. Bu strateji, bu çalışmadaki verilere özgü düşük sinyal-gürültü oranının yanı sıra EB1-GFP kuyruklu yıldızlarının farklı odak düzlemleri boyunca hareketi gibi diğer zorlukları etkili bir şekilde ele alabilir. Bu yazılımın performansını diğer tüm parçacık analiz yazılımlarına karşı kapsamlı bir şekilde test etmek mümkün olmasa da, mevcut stratejinin performansı standart insan performansına eşit veya ona yaklaştı. Ayrıca, yazarların bildiği kadarıyla, duyusal dendritlerden ve presinaptik terminalden elde edilen in vivo veriler üzerinde özel olarak eğitilmiş başka bir yazılım yoktur. Görüntü analizi algoritmalarının performansının genellikle tasarlandıkları verilere oldukça spesifik olduğu ve genelleştirilmiş bilgisayar görüşünün henüz mümkün olmadığı göz önüne alındığında, açıklanan yazılımın ilgilenilen belirli in vivo verilere göre eğitilmesinin algoritmik olarak en sağlam yaklaşım olması beklenmektedir.
Dendritik MT'ler 22,23,24,25,26,27 üzerindeki kapsamlı çalışmaların yanı sıra bu sistemden elde edilebilecek tutarlı veri kalitesi göz önüne alındığında, görüntü elde etme ve yazılım analizi stratejisi ilk olarak Drosophila duyusal dendritlerinde doğrulandı. Daha da önemlisi, dendritlerde, farklı nöronal Gal4 sürücülerinin kullanılmasının, aksi takdirde aynı vahşi tip arka planlarda bile, genetik arka plandaki farklılıklar nedeniyle EB1-GFP dinamiklerinde önemli farklılıklara yol açtığı bulundu ve tutarlı sonuçlar için tek bir Gal4 sürücüsü kullanmanın önemini vurguladı. Bu strateji daha sonra NMJ'nin presinaptik terminalinde EB1-GFP dinamiklerinin multiparametrik analizi için kullanıldı. Bu yöntemin araştırma değerini daha da açıklamak için, bu görüntüleme ve yazılım stratejisi, yüksek oranda korunmuş TACC (dönüştürücü asidik sarmal bobin) ailesinin Drosophila homoloğuolan dTACC'nin yıkılmasını takiben hem sinaptik öncesi hem de postsinaptik EB47,48 sonrası dinamikleri değerlendirmek için kullanıldı. Drosophila S2 hücreleri40'taki önceki çalışmaların yanı sıra Lowery ve meslektaşları tarafından Xenopus büyüme konisi 49,50,51'deki çalışmalar, TACC ailesi üyelerinin MT artı uç dinamiklerini düzenlediğini göstermiştir. Ayrıca, konfokal ve süper çözünürlüklü immünofloresan görüntülemeden yakın zamanda bildirilen kanıtlar, dTACC'nin nöronal morfogenez52 sırasında presinaptik MT'lerin önemli bir düzenleyicisi olduğunu gösterdi ve dTACC'nin canlı MT dinamiklerini düzenleyip düzenlemediği sorusunu gündeme getirdi. Bu rapor, dTACC knockdown üzerine canlı MT davranışlarındaki farklılıkları gerçekten tespit edebilen bir yöntemi göstermektedir. Bu nedenle, bu çalışma, özellikle presinaptik bölmede, gelişmekte olan nöron içindeki MT dinamiklerinin temel düzenleyicilerini etkili bir şekilde tanımlayabilen ve karakterize edebilen in vivo bir yöntem sunmaktadır.
1. Drosophila örneklerinin üretilmesi
2. Ekipman kurulumu
3. Görüntüleme için larva örneklerinin hazırlanması
4. Canlı numunelerin hızlandırılmış konfokal görüntülemesi
5. Yazılım tabanlı görüntü işleme ve analizi
Sinekler, UAS-EB1-GFP transgenini pan-nöronal olarak (elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP)58,59 veya duyusal nöronlarda (221-Gal4; UAS-EB1-GFP)60,61. EB1 bu çalışma için seçilmiştir, çünkü özellikle büyüyen uçlara lokalize olur ve duraklama ve büzülme14,15 üzerine hemen ayrışır ve Drosoph...
Bu makale, dendritlerde ve gelişim sırasında NMJ'de MT dinamiklerinin noninvaziv intravital görüntülemesini gerçekleştirmek için bir protokolü tartışmaktadır. Görüntülenecek hayvanların seçilmesi gibi deneysel adımlar sırasında insan girdisi gereklidir ve veri toplama sürecinde makul bir şekilde ortadan kaldırılamayan önyargılara neden olabilir. Bu nedenle, protokolün temel amacı, in vivo verilerin doğasında bulunan düşük sinyal-gürültü oranını işl...
Yazarlar Hoyin Lai, Michael Jones, Hideki Sasaki, Luciano AG Lucas, Sam Alworth (eskiden) ve James Shih-Jong Lee, bu protokolde kullanılan yazılımı üreten DRVision Technologies LLC'nin çalışanlarıdır.
Yararlı tartışmalar için Dr. Max Heiman, Pascal Kaeser, David Pellman ve Thomas Schwarz'a ek olarak Van Vactor laboratuvarındaki ve DRVision'daki meslektaşlarımıza teşekkür ederiz. elaV-Gal4'ü cömertçe sağladığı için Dr. Melissa Rolls'a teşekkür ederiz ; UAS-EB1-GFP; UAS-DCR2 ve 221-Gal4; Bu çalışmada UAS-EB1-GFP hisse senetleri kullanılmıştır. Harvard'daki Nikon Görüntüleme Merkezi'nden Dr. Jennifer Waters ve Anna Jost'a ışık mikroskobu uzmanlığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından finanse edilmektedir (F31 NS101756-03 - V.T.C., SBIR 1R43MH100780-01D - JSL).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 21008-959 | Sample preparation |
1000 µL TipOne pipette tips | USA Scientific | 1111-2721 | Sample preparation |
200 µL TipOne pipette tips | USA Scientific | 1120-8710 | Sample preparation |
221-Gal4 flies | Bloomington Drosophila Stock Center (US) | 26259 | Drosophila genetics/crosses |
60x Objective Lens | Nikon | Plan Apo 60x Oil | Image acquisition |
6-well plate | BD Falcon | 353224 | Sample preparation |
Agar | MoorAgar | 41084 | Drosophila food |
Aivia | DRVision LLC | Optimized as part of this study | |
Chloroform (stabilized with amylenes) | Sigma-Aldrich | C2432 | Sample preparation |
CO2 blowgun (for selection of flies for crosses) | Genesee | 54-104 | Drosophila genetics/crosses |
CO2 bubbler (for selection of flies for crosses) | Genesee | 59-180 | Drosophila genetics/crosses |
Cooled CCD camera | Hamamatsu | ORCA-R2 | Image acquisition |
Cornmeal | Genesee | 62-101 | Drosophila food |
Distilled Water | Drosophila food | ||
Double-sided tape | Scotch | Sample preparation | |
Drosophila vials | Genesee | 32-109 | Drosophila food |
Droso-plugs (foam plugs for vials) | Genesee | 59-200 | Drosophila food |
Dumont #5 Biologie Inox Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Sample preparation |
elaV-Gal4;UAS-EB1-GFP;UAS-Dcr2 flies | Gift of Melissa Rolls (Penn State University) | N/A | Drosophila genetics/crosses |
Ethanol (95%) | VWR | 75811-022 | Drosophila food |
Fiber optic illuminator/light source for stereomicroscope | Nikon | NI-150 | Sample preparation |
Flypad (for selection of flies for crosses) | Genesee | 59-172 | Drosophila genetics/crosses |
Forma Environmental Chamber/Incubator | ThermoFisher | 3940 | Drosophila genetics/crosses |
Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | Sample preparation |
Immersion Oil | Nikon | MXA22168 | Image acquisition |
Kimwipe Delicate Wipes | Fisher Scientific | 34120 | Sample preparation |
Laser Merge Module | Spectral Applied Research | LMM-5 | Image acquisition |
Light Source for Confocal | Lumencor | SOLA 54-10021 | Image acquisition |
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software | Molecular Devices | Image acquisition | |
Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2 (#1.5) | VWR | 48366-205 | Sample preparation |
Motorized inverted microscope with Perfect Focus System | Nikon | TI-ND6-PFS-S | Image acquisition |
Motorized stage and shutters | Prior | Proscan III | Image acquisition |
Multi-purpose scissors | Scotch | MMM1428 | Sample preparation |
Nail Polish | Sally Hansen | 784179032016 074170382839 | Sample preparation |
Optical Filter | Chroma | ET480/40m | Image acquisition |
P1000 Pipetman | Gilson | F123602 | Sample preparation |
P200 Pipetman | Gilson | F123601 | Sample preparation |
PBS (10X) ph 7.4 | ThermoFisher | 70011044 | Sample preparation |
Propionic Acid | Fisher | A258-500 | Drosophila food |
Spinning disk confocal scanner unit | Yokagawa | CSU-X1 | Image acquisition |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | Sample preparation |
Sugar (Sucrose) | Genesee | 62-112 | Drosophila food |
Superfrost Slide | VWR | 48311-600 | Sample preparation |
Tegosept | Genesee | 20-258 | Drosophila food |
UAS-dtacc-RNAi flies | Vienna Drosophila Resource Center (Vienna, Austria) | VDRC-101439 | Drosophila genetics/crosses |
Vaseline petroleum jelly | WB Mason | DVOCB311003 | Sample preparation |
Winsor & Newton Brush Regency Gold 520, Size 0 | Staples | 5012000 | Drosophila genetics/crosses |
Yeast | VWR | Torula Yeast IC90308580 | Drosophila food |
Yokogawa dichroic beamsplitter | Semrock | Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 | Image acquisition |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır