JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu çalışma, Drosophila'nın duyusal dendritlerinde ve nöromüsküler kavşaklarında in vivo mikrotübül (MT) artı uç dinamiklerinin otomatik, tarafsız izlenmesini ve analizini sağlamak için yeni bir yazılım stratejisiyle birleştirilmiş noninvaziv bir intravital nöronal görüntüleme stratejisi sunmaktadır.

Özet

Mikrotübüller (MT'ler) nöronal gelişimde kritik roller oynar, ancak regülasyonlarının ve işlevlerinin moleküler mekanizmaları hakkında birçok soru devam etmektedir. Ayrıca, postsinaptik MT'lerin anlaşılmasındaki ilerlemeye rağmen, presinaptik MT'lerin nöronal morfogeneze katkıları hakkında çok daha az şey bilinmektedir. Özellikle, Drosophila duyusal dendritlerindeki in vivo MT dinamikleri üzerine yapılan çalışmalar, polimer düzeyinde davranış hakkında önemli bilgiler sağlamıştır. Bununla birlikte, sinek nöromüsküler kavşağının (NMJ) canlı görüntülenmesi ile ilişkili teknik ve analitik zorluklar, presinaptik MT dinamikleri ile ilgili karşılaştırılabilir çalışmaları sınırlamıştır. Ayrıca, MT dinamiklerinin in vitro ve ex vivo otomatik analizi için oldukça etkili birçok yazılım stratejisi olsa da, in vivo veriler, görüntülerdeki doğal olarak düşük sinyal-gürültü oranı ve karmaşık hücresel morfoloji nedeniyle genellikle önemli operatör girdisi veya tamamen manuel analiz gerektirir.  Bunu ele almak için bu çalışma, otomatik ve tarafsız in vivo parçacık tespiti için yeni bir yazılım platformunu optimize etti. EB1-GFP işaretli MT'lerin canlı hızlandırılmış konfokal görüntülerinin multiparametrik analizi, hem dendritlerde hem de Drosophila larvalarının NMJ'sinde gerçekleştirildi ve MT davranışlarında çarpıcı farklılıklar buldu. MT dinamikleri ayrıca, Drosophila sinaps gelişiminin önemli bir düzenleyicisi olan MT ile ilişkili protein (MAP) dTACC'nin yıkılmasının ardından analiz edildi ve vahşi tipe kıyasla MT dinamiklerinde istatistiksel olarak anlamlı değişiklikler tespit edildi. Bu sonuçlar, polimer düzeyinde hem postsinaptik öncesi hem de postsinaptik MT dinamiklerinin otomatik multiparametrik analizi için bu yeni stratejinin, döngüdeki insan kriterlerini önemli ölçüde azalttığını göstermektedir. Çalışma ayrıca, bu yöntemin dTACC-knockdown üzerine farklı MT davranışlarını tespit etmedeki faydasını göstermektedir ve bu da MT dinamiklerini in vivo olarak düzenleyen faktörlerin fonksiyonel ekranları için gelecekteki olası bir uygulamayı göstermektedir. Bu yöntemin gelecekteki uygulamaları, hücre tipi ve / veya bölmeye özgü MT davranışlarının aydınlatılmasına ve EB1-GFP'nin diğer hücresel ve hücre altı belirteçlerle çok renkli korelasyonlu görüntülenmesine de odaklanabilir.

Giriş

Hücreler, morfogenez yoluyla hücre içi ve hücre içi değişikliklerin koordinasyonu yoluyla fonksiyonel yapılar oluşturmak üzere organize olurlar. Morfogenezin dikkate değer bir örneği, son derece uzmanlaşmış nöronal yapının gelişmesidir. Nöronlar, yapısal ve işlevsel olarak farklı iki işlem türünü, dendritleri ve aksonları1 genişlettikleri ve muazzam uzunluklara ulaşabildikleri dikkate değer bir polarizasyon sergilerler. Nöronal gelişimin karmaşıklığı, yalnızca dendritlerin ve aksonların büyüklüğünden değil, aynı zamanda karmaşık dallara ayrılmış geometrilerini oluşturmadaki zorluktan da kaynaklanmaktadır 2,3. Nöronal morfogenez ve bunun öğrenme ve hafızadaki sonuçları4, hem genetik kontrolünün hem de altta yatan hücre biyolojik mekanizmalarının devam eden araştırmasını motive eder. Bu tür mekanizmalar, bunlarla sınırlı olmamak üzere, hücre içi zar taşınmasını ve nöronal morfolojideki değişiklikler için gereken birçok hücre iskeleti yeniden düzenlemesini içerir 1,2,3.

Nöronal morfogenez çalışmaları, çeşitli ileri görselleştirme teknikleri üretmiştir. Elektron mikroskobu veya sabit probların floresan mikroskobu gibi statik yöntemler, yüksek çözünürlüklü morfolojik ve yapısal analizler yapmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, herhangi bir koruma yöntemi için kaçınılmaz olan eserlerin yanı sıra, statik görselleştirme, morfogenezin temelini oluşturan dinamik değişiklikleri yakalayamaz. Bu nedenle, birçok önemli içgörü, canlı dokuların hızlandırılmış floresan mikroskobundan kaynaklanmaktadır. Lichtman ve meslektaşları 5,6,7 tarafından yapılan erken çalışmalar, akson rejenerasyonu/dejenerasyonu, sinaptik bileşenlerin organizasyonu ve uzun menzilli aksonal taşımayı araştırmak için memeli sinir sisteminin in vivo görüntülemesini kullandı. Ayrıca, primer nöronal eksplantlarda yapılan ufuk açıcı çalışmalar, mikrotübül (MT) dinamiklerinin aksonal uzama ve motilite için önemini belirlemek için kritik öneme sahipti 8,9. En önemlisi, erken nöronal eksplant çalışmaları, bireysel MT polimerleri10 düzeyinde nöronların geliştirilmesinde MT artı uç dinamikleri hakkında paha biçilmez bilgiler elde etmek için floresan etiketli uç bağlayıcı aile proteinlerinin (EB'ler) kullanımını ortaya koymuştur. Bu çalışmalar, EB ailesi üyesi EB1'in tercihen S. cerevisiae12'de ve kültürlenmiş hücrelerde13 MT artı uçlar11'e lokalize olduğu gözlemlerinden ortaya çıkmıştır. O zamandan beri, EB1 ve diğer artı uç izleme proteinleri (+TIP'ler)14,15, nöronal gelişim17 bağlamı da dahil olmak üzere, MT dinamik instabilitesinin16 in vivo çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır.

Drosophila, sinek çalışmaları18,19 için mevcut olan geniş genetik ve görüntüleme araçlarının yanı sıra Drosophila ve omurgalı nöronları arasındaki yapı ve işlev benzerlikleri nedeniyle, nöronal gelişim sırasında MT dinamiklerinin in vivo görüntüleme çalışmaları için güçlü bir modeldir1. Drosophila larvalarının nöromüsküler kavşağı (NMJ) ile ilgili önemli bir erken çalışma, presinaptik terminal morfogenezi20'yi belgelemek için sağlam hayvanların yarı saydam kütikülü boyunca bir floresan membran markörünün tekrarlanan noninvaziv görüntülemesini gerçekleştirdi. Bütün, canlı Drosophila larvalarını görüntülemek için benzer bir yöntem kullanılarak, aksonlardaki motor yüklerin işlemsel hareketinin hücre altı, parçacık düzeyinde analizinin ilk gösterimi sağlandı21. Daha yakın zamanlarda, Rolls ve meslektaşları tarafından bozulmamış Drosophila larvalarınınduyusal dendritleri üzerinde yapılan titiz çalışmalar 22,23,24,25,26,27, yeşil floresan proteini (GFP) etiketli EB1'in partikül takibi ve analizini gerçekleştirerek postsinaptik MT artı uç dinamiklerini karakterize etti. Drosophila 22,23,24,25,26,27 ve diğer sistemler 28,29,30,31,32'deki bu tür çalışmalar, MT'nin tek polimer davranışı ve gelişmekte olan nöronların dendritlerindeki uçların önemli ölçüde ileri düzeyde anlaşılmasına sahiptir 33.

Postsinaptik MT dinamikleri 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ile ilgili etkileyici in vivo çalışmalara rağmen, gelişmekte olan akson terminalinde presinaptik MT dinamikleri ile ilgili çok daha az karşılaştırılabilir çalışma yapılmıştır. Drosophila larva NMJ'deki MT dinamikleri, floresan benek mikroskobu (FSM) ve fotoağartma sonrası floresan geri kazanımı (FRAP) kullanılarak incelenmiştir34. Bu teknikler genel tübülin kinetiğini değerlendirir, ancak tek tek MT artı uçlarının davranışını değerlendirmez. Bu yazı itibariyle, Drosophila NMJ'de bireysel MT artı uçlarının tek bir araştırması yapılmıştır: Bu çalışma, daha geniş bir stabilize MT popülasyonundan farklı görünen dinamik, EB1-GFP etiketli "öncü MT'ler" popülasyonunu karakterize etmek için canlı hızlandırılmış görüntülemeyi kymografların manuel analiziyle birleştirdi35. Presinaptik MT dinamikleri üzerine yapılan bu araştırma eksikliği, en azından kısmen anatomiye bağlı olabilir: Larva kütikülüne yakınlıkları nedeniyle dendritlerin görüntülerini elde etmek nispeten basit olsa da, NMJ'ler diğer dokular tarafından engellenir ve bu da parçacık düzeyinde analiz için yeterli sinyal-gürültü oranına sahip görüntülerin elde edilmesini zorlaştırır. Bununla birlikte, presinaptik MT'lerin sinaptik morfogenez ve stabilizasyon36 için köklü önemi ve nörogelişimsel ve nörodejeneratif bozukluklar37 ile bağlantıları göz önüne alındığında, postsinaptik öncesi ve sonrası MT'lerin anlaşılması arasındaki bu boşluğu kapatmanın paha biçilmez içgörüler sağlaması muhtemeldir.

İn vitro veya ex vivo analizin aksine, genel olarak in vivo MT dinamiklerinin analizine yönelik ek bir zorluk, in vivo verilerden dinamik parametreleri çıkarabilen sınırlı otomatik yazılım araçlarıdır. Şu anda, +TIP etiketli MT artı uçlarının analizi için en popüler ve güçlü tekniklerden biri, çoklu dinamik parametrelerin otomatik olarak izlenmesine ve analizine izin veren MATLAB tabanlı bir yazılım olan plusTipTracker 38,39'dur. Özellikle, plusTipTracker yalnızca MT büyümesini değil, aynı zamanda büzülmeyi ve kurtarmaları da ölçer: EB1-GFP gibi +TIP etiketleri yalnızca büyüyen artı uçlarla ilişkilendirilirken, plusTipTracker büzülme oranlarını ve kurtarma olaylarını algoritmik olarak çıkarabilir. Bununla birlikte, plusTripTracker, Drosophila S2 hücrelerinde40 ex vivo MT dinamiklerinin önceki multiparametrik analizi de dahil olmak üzere birçok bağlama çok başarılı bir şekilde uygulanmış olsa da, plusTipTracker, daha düşük sinyal-gürültü oranı göz önüne alındığında in vivo verilerin analizi için optimal değildir. Sonuç olarak, dendritler 22,23,24,25,26,27 ve Drosophila'nın NMJ 35'indeki artı uç dinamiklerinin in vivo çalışmaları, ImageJ41 gibi yazılımlar kullanılarak kimografilerin manuel olarak üretilmesine ve analizine veya çok sayıda döngüdeki insan bileşenini içeren yarı otomatik stratejilere dayanmıştır.

Bu çalışma, hem duyusal dendritlerde hem de Drosophila üçüncü instar larvalarının motor akson terminalinde presinaptik MT dinamiklerinin noninvaziv polimer düzeyinde analizini gerçekleştirmek için gereken deneysel ve analitik ek yükü azaltan deneysel ve analitik bir iş akışı sunmaktadır. Protokol hareketsizleştirilmiş, sağlam larvaları kullanır ve bu nedenle stres tepkilerini tetiklediği bilinen yaralanmaların yanı sıra in vivo MT dinamiklerini bozabilecek diğer fizyolojik olmayan durumları önler. Dinamik MT artı uçlarını etiketlemek için, EB1-GFP, Gal4/UAS sistemi42 kullanılarak pan-nöronal olarak eksprese edilir ve hem dendritlerde hem de NMJ'de MT'lerin tek bir sürücü ile görselleştirilmesine olanak tanır. Hayvan örneklerinin seçimi ve görüntülenecek bölgelerin belirlenmesi gibi bazı erken adımlar kaçınılmaz olarak insan karar verme sürecine tabi olsa da, veri toplamayı takip eden adımlar büyük ölçüde otomatiktir. En önemlisi, yeni bir yazılımın optimizasyonu, minimum insan girdisi gerektiren otomatik, tarafsız analiz sağladı. Diğer parçacık izleme yöntemlerimevcut olsa da 43,44,45, bu çalışma, bu belirli veri setinin belirli zorluklarını ele almak için algoritmik olarak çok uygun olduğu için tescilli bir yazılım kullanmaktadır. Yazılım artık çeşitli uygulamalar için kullanıcılar tarafından kullanılabilir. Spesifik olarak, tutarlılığı artıran difüzyon filtrelemenin46 kullanımı, otomatik segmentasyon ve arka plan kaldırmanın ayrılmaz bir parçasıdır ve özellikle partikül algılama ve izlemeyi otomatikleştirmek için özel algoritmalar uygulanır. Bu strateji, bu çalışmadaki verilere özgü düşük sinyal-gürültü oranının yanı sıra EB1-GFP kuyruklu yıldızlarının farklı odak düzlemleri boyunca hareketi gibi diğer zorlukları etkili bir şekilde ele alabilir. Bu yazılımın performansını diğer tüm parçacık analiz yazılımlarına karşı kapsamlı bir şekilde test etmek mümkün olmasa da, mevcut stratejinin performansı standart insan performansına eşit veya ona yaklaştı. Ayrıca, yazarların bildiği kadarıyla, duyusal dendritlerden ve presinaptik terminalden elde edilen in vivo veriler üzerinde özel olarak eğitilmiş başka bir yazılım yoktur. Görüntü analizi algoritmalarının performansının genellikle tasarlandıkları verilere oldukça spesifik olduğu ve genelleştirilmiş bilgisayar görüşünün henüz mümkün olmadığı göz önüne alındığında, açıklanan yazılımın ilgilenilen belirli in vivo verilere göre eğitilmesinin algoritmik olarak en sağlam yaklaşım olması beklenmektedir.

Dendritik MT'ler 22,23,24,25,26,27 üzerindeki kapsamlı çalışmaların yanı sıra bu sistemden elde edilebilecek tutarlı veri kalitesi göz önüne alındığında, görüntü elde etme ve yazılım analizi stratejisi ilk olarak Drosophila duyusal dendritlerinde doğrulandı. Daha da önemlisi, dendritlerde, farklı nöronal Gal4 sürücülerinin kullanılmasının, aksi takdirde aynı vahşi tip arka planlarda bile, genetik arka plandaki farklılıklar nedeniyle EB1-GFP dinamiklerinde önemli farklılıklara yol açtığı bulundu ve tutarlı sonuçlar için tek bir Gal4 sürücüsü kullanmanın önemini vurguladı. Bu strateji daha sonra NMJ'nin presinaptik terminalinde EB1-GFP dinamiklerinin multiparametrik analizi için kullanıldı. Bu yöntemin araştırma değerini daha da açıklamak için, bu görüntüleme ve yazılım stratejisi, yüksek oranda korunmuş TACC (dönüştürücü asidik sarmal bobin) ailesinin Drosophila homoloğuolan dTACC'nin yıkılmasını takiben hem sinaptik öncesi hem de postsinaptik EB47,48 sonrası dinamikleri değerlendirmek için kullanıldı. Drosophila S2 hücreleri40'taki önceki çalışmaların yanı sıra Lowery ve meslektaşları tarafından Xenopus büyüme konisi 49,50,51'deki çalışmalar, TACC ailesi üyelerinin MT artı uç dinamiklerini düzenlediğini göstermiştir. Ayrıca, konfokal ve süper çözünürlüklü immünofloresan görüntülemeden yakın zamanda bildirilen kanıtlar, dTACC'nin nöronal morfogenez52 sırasında presinaptik MT'lerin önemli bir düzenleyicisi olduğunu gösterdi ve dTACC'nin canlı MT dinamiklerini düzenleyip düzenlemediği sorusunu gündeme getirdi. Bu rapor, dTACC knockdown üzerine canlı MT davranışlarındaki farklılıkları gerçekten tespit edebilen bir yöntemi göstermektedir. Bu nedenle, bu çalışma, özellikle presinaptik bölmede, gelişmekte olan nöron içindeki MT dinamiklerinin temel düzenleyicilerini etkili bir şekilde tanımlayabilen ve karakterize edebilen in vivo bir yöntem sunmaktadır.

Protokol

1. Drosophila örneklerinin üretilmesi

  1. Uygun bir MT artı uç işaretçisi seçin. Bu çalışmada, güçlü, net bir sinyale11,12 sahip, iyi karakterize edilmiş bir artı uç işaretleyici olan GFP etiketli EB1 kullanılmıştır. Alternatifler arasında EB3 10,13, CLASP/Orbit53 ve CLIP-17054 gibi diğer +TIP'ler bulunur.
  2. Bir UAS promotörünün( örneğin, UAS-EB1-GFP) kontrolü altındaki MT işaretleyicisi ile sinekler elde edin veya üretin.
  3. Dokuya özel uygun Gal4 sürücüsünü seçin. Bu çalışma, hem duyusal dendritlerde hem de NMJ'de ekspresyon sağlamak için pan-nöronal sürücü elaV-Gal4 58,59'u ve dendrite özgü ekspresyon için 221-Gal460,61'i kullandı.
  4. Standart sinek yetiştirme tekniklerini kullanarak sinek yetiştirin 55,56. Optimum Gal4 / UAS ekspresyonu için sineklerin 25 ° C'de nemlendirilmiş inkübatörlerde tutulması önerilir.
  5. Standart sinek genetik tekniklerini 55,56 kullanarak, istenen hücrelerde / dokularda MT artı uç işaretçisini ifade etmek için sinekler oluşturmak için çaprazlamalar yapın.
    NOT: Herhangi bir Gal4 sürücüsü ve -transgen kombinasyonu için, deneysel tasarım, sistemi karakterize etmek ve aşırı ifadeden kaynaklanan artefaktları önlemek için kavram kanıtı ve doğrulama deneylerini içermelidir.

2. Ekipman kurulumu

  1. Larvaların sağlığını ve canlılığını uzatmak için numune hazırlama ve görüntüleme arasında harcanan süreyi en aza indirmek için sinekler, anestezik reaktifler, lam yapım malzemeleri, stereomikroskop ve aydınlatma kaynağı dahil olmak üzere konfokal mikroskoba yakın (yani aynı odada) bir iş istasyonu kurun.
  2. Anestezik% 9'luk bir kloroform karışımını (0.1 mL kloroform ve 1.0 mL halokarbon yağı) 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde karıştırarak hazırlayın. Ayrılmayı önlemek için, her yeni slaytı hazırlamadan önce tüpü ters çevirerek iyice karıştırın.
  3. Cam slaytı hazırlayın: Dört şerit çift taraflı bant (~15 mm genişliğinde) kesin. Şeritler arasında ~5 mm'lik bir boşluk bırakarak iki parçayı cam slayt üzerinde hizalayın. Bandın kalınlığını iki katına çıkarmak için kalan iki parçayı ilk ikisinin üzerine yerleştirin (Şekil 1C).
  4. Bant parçaları arasındaki 5 mm'lik boşlukta cam slayt üzerine büyük bir damla (~ 100 μL) kloroform / yağ karışımı ekleyin (Şekil 1C).

3. Görüntüleme için larva örneklerinin hazırlanması

  1. Bir kabı (örneğin, 6 kuyulu bir plaka) 1x PBS ile doldurun.
  2. Forseps veya benzeri bir alet kullanarak sinek şişesinden 3adet instar larvası toplayın. Larvaları uygun aşamada, tarama davranışlarıyla ve 9-12 belirgin, tırtıklı ağız kancasının varlığıyla tanımlayın. Larvaların evrelenmesine yardımcı olmak için bir stereomikroskop kullanın (Şekil 1D).
  3. PBS'ye bir larva yerleştirin ve yiyecek kalıntılarını veya diğer kalıntıları temizlemek için hafifçe hareket ettirin. Larvaları hassas bir doku üzerinde nazikçe kurulayın.
  4. Larvayı 2. bölümden itibaren slayt üzerindeki kloroform/yağ damlasına yerleştirerek uyuşturun (Şekil 1C).
    NOT: Larvaların dorsal/ventral oryantasyonu kritik değildir, çünkü hem duyusal hem de motor nöronlar, numunenin oryantasyonundan bağımsız olarak mikroskop aşamasını uygun odak düzlemine ayarlayarak yarı saydam kütikül yoluyla tespit edilebilir.
  5. Üstüne bir # 1.5 lamel yerleştirin. Lameli hafif bir baskı uygulayarak banda yapıştırın, böylece larvayı zarar vermeden hareketsiz hale getirin (Şekil 1C).
  6. Hazneyi vazelin veya oje ile kapatın.

4. Canlı numunelerin hızlandırılmış konfokal görüntülemesi

  1. Konfokal mikroskobu ve 60x objektif lensi yağa daldırarak hazırlayın. Numuneyi sahneye yerleştirin (Şekil 1A,B).
  2. Deneyleri yapılandırmak için edinme yazılımını kullanın.
    NOT: Bu çalışma için, her görüntüleme serisi, bir z-yığınının aksine tek bir odak düzleminde elde edildi.
    1. Hızlandırılmış çekim süresini 2 sn aralıklarla 30 sn ile toplam 16 kare olacak şekilde ayarlayın.
    2. Doygunluk ve fotoağartmadan kaçınırken yeterli sinyali sağlamak için lazer pozlamasını ve yoğunluğunu ayarlayın.
    3. EB1-GFP görüntüleme için 488 nm lazer, 100 ms'lik bir pozlama süresine ve %30'luk bir yoğunluğa ayarlandı. Bu değerler, bu protokolün farklı kullanımları için değişebilir ve ampirik olarak değiştirilmelidir.
  3. Geniş alan yeşili aydınlatmada larvayı bulmak için mikroskobun göz merceklerini kullanın. Sahneyi yavaşça ayarlayarak dendritleri veya NMJ'leri bulun. Larvaları gerekenden daha uzun süre aydınlatmaya (geniş alan veya konfokal) maruz bırakmayın.
    1. Dendritler, kalın uzun akson demetlerinden kolayca ayırt edilebilen ince, parlak yeşil sinir ağları olarak görünür (Şekil 1E).
    2. NMJ'ler, sinir kordonundan ayrılan kalın uzun akson demetlerinin uçlarında, yaklaşık 5 μm çapında parlak yeşil bireysel bouton grupları olarak görülür (Şekil 1F).
  4. Canlı kamera akışını kullanarak, 488 nm aydınlatma kullanarak ilgilenilen bölgeye hızlı bir şekilde odaklanın. Fototoksisiteyi önlemek için uygun odak bulunduğunda aydınlatmayı hemen durdurun.
  5. Görüntü alımını başlatın. EB1 kuyruklu yıldızları parlak, hareketli punktae olarak tanınabilir.
  6. Floresan canlı görüntüleme57 ile ilgili ek ayrıntılar ve yönergeler için daha önce yayınlanmış protokollere bakın.

5. Yazılım tabanlı görüntü işleme ve analizi

  1. Her video dosyasını ayrı ayrı analiz edin. Yazılım içinde (Şekil 2'de gösterilen kullanıcı arayüzü), Dosya | İthalat | Görüntü Sırası ve görüntülenen kutuya TIF dosyalarını sürükleyin. Videoyu önizleyin.
  2. Algılama Parametreleri menüsü altında, yalnızca açıkça görülebilen noktaların algılanmasını sağlamak ve sahte nesnelerin algılanmasını önlemek için yazılım parametrelerini ayarlayın. Örneğin, parçacık yoğunluğunun azaltılması, yazılımın punctae'ye karşı daha fazla hassasiyetine neden olur, ancak potansiyel yanlış pozitifleri artırır. Parametrelerin kesin değerleri ampirik olarak değişecektir. Algılama ve İzleme Parametrelerinin açıklamaları, talep üzerine yazarlardan temin edilebilir.
  3. Baştan düğmesini kullanarak görüntüyü analiz etmek için Nöron Parçacık İzleme tarifini uygulayın (mavi ok, Şekil 2B). Yazılım, Tablo 1'de listelenen izleme parametreleri için sonuçları Sonuçlar Elektronik Tablosuna (yeşil kutu, Şekil 2B) çıkaracaktır. Daha sonra analiz ve yorumlama kolaylığı için sonuçlar, Sonuçlar Elektronik Tablosu bölümünde bulunan Dışa Aktar işlevi kullanılarak elektronik tablo yazılımında saklanabilir.
  4. İmleci önceki adımda algılanan puncta'ya getirin ve seçmek veya seçimi kaldırmak için sol tıklayın . Ctrl + sol tıklama kullanılarak aynı anda birden fazla nokta seçilebilir.
    NOT: Proje amaçlarına ve uygulamalarına bağlı olarak, punktaları filtrelemek için ek sezgisel yöntemler kullanılabilir. Örneğin, ömrü 8-10 saniyeden (4-5 kare) az olan punctae, tüm büyüme olayı hakkında yeterli bilgi sunmadıkları için ihmal edilebilir. Bu tür buluşsal yöntemlere duyulan ihtiyaç ampirik olarak değişecektir. Yazılım işlevselliği ile ilgili ek ayrıntılar, talep üzerine yazarlardan temin edilebilir.

Sonuçlar

Sinekler, UAS-EB1-GFP transgenini pan-nöronal olarak (elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP)58,59 veya duyusal nöronlarda (221-Gal4; UAS-EB1-GFP)60,61. EB1 bu çalışma için seçilmiştir, çünkü özellikle büyüyen uçlara lokalize olur ve duraklama ve büzülme14,15 üzerine hemen ayrışır ve Drosoph...

Tartışmalar

Bu makale, dendritlerde ve gelişim sırasında NMJ'de MT dinamiklerinin noninvaziv intravital görüntülemesini gerçekleştirmek için bir protokolü tartışmaktadır. Görüntülenecek hayvanların seçilmesi gibi deneysel adımlar sırasında insan girdisi gereklidir ve veri toplama sürecinde makul bir şekilde ortadan kaldırılamayan önyargılara neden olabilir. Bu nedenle, protokolün temel amacı, in vivo verilerin doğasında bulunan düşük sinyal-gürültü oranını işl...

Açıklamalar

Yazarlar Hoyin Lai, Michael Jones, Hideki Sasaki, Luciano AG Lucas, Sam Alworth (eskiden) ve James Shih-Jong Lee, bu protokolde kullanılan yazılımı üreten DRVision Technologies LLC'nin çalışanlarıdır.

Teşekkürler

Yararlı tartışmalar için Dr. Max Heiman, Pascal Kaeser, David Pellman ve Thomas Schwarz'a ek olarak Van Vactor laboratuvarındaki ve DRVision'daki meslektaşlarımıza teşekkür ederiz. elaV-Gal4'ü cömertçe sağladığı için Dr. Melissa Rolls'a teşekkür ederiz ; UAS-EB1-GFP; UAS-DCR2 ve 221-Gal4; Bu çalışmada UAS-EB1-GFP hisse senetleri kullanılmıştır. Harvard'daki Nikon Görüntüleme Merkezi'nden Dr. Jennifer Waters ve Anna Jost'a ışık mikroskobu uzmanlığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından finanse edilmektedir (F31 NS101756-03 - V.T.C., SBIR 1R43MH100780-01D - JSL).

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubeEppendorf21008-959Sample preparation
1000 µL TipOne pipette tipsUSA Scientific1111-2721Sample preparation
200 µL TipOne pipette tipsUSA Scientific1120-8710Sample preparation
221-Gal4 fliesBloomington Drosophila Stock Center (US)26259Drosophila genetics/crosses
60x Objective LensNikonPlan Apo 60x OilImage acquisition
6-well plateBD Falcon353224Sample preparation
AgarMoorAgar41084Drosophila food
AiviaDRVision LLCOptimized as part of this study
Chloroform (stabilized with amylenes)Sigma-AldrichC2432Sample preparation
CO2 blowgun (for selection of flies for crosses)Genesee54-104Drosophila genetics/crosses
CO2 bubbler (for selection of flies for crosses)Genesee59-180Drosophila genetics/crosses
Cooled CCD cameraHamamatsuORCA-R2Image acquisition
CornmealGenesee62-101Drosophila food
Distilled WaterDrosophila food
Double-sided tapeScotchSample preparation
Drosophila vialsGenesee32-109Drosophila food
Droso-plugs (foam plugs for vials)Genesee59-200Drosophila food
Dumont #5 Biologie Inox ForcepsFine Science Tools11252-20Sample preparation
elaV-Gal4;UAS-EB1-GFP;UAS-Dcr2 fliesGift of Melissa Rolls (Penn State University)N/ADrosophila genetics/crosses
Ethanol (95%)VWR75811-022Drosophila food
Fiber optic illuminator/light source for stereomicroscopeNikonNI-150Sample preparation
Flypad (for selection of flies for crosses)Genesee59-172Drosophila genetics/crosses
Forma Environmental Chamber/IncubatorThermoFisher3940Drosophila genetics/crosses
Halocarbon oil 700Sigma-AldrichH8898Sample preparation
Immersion OilNikonMXA22168Image acquisition
Kimwipe Delicate WipesFisher Scientific34120Sample preparation
Laser Merge ModuleSpectral Applied ResearchLMM-5Image acquisition
Light Source for ConfocalLumencorSOLA 54-10021Image acquisition
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis SoftwareMolecular DevicesImage acquisition
Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2 (#1.5)VWR48366-205Sample preparation
Motorized inverted microscope with Perfect Focus SystemNikonTI-ND6-PFS-SImage acquisition
Motorized stage and shuttersPriorProscan IIIImage acquisition
Multi-purpose scissorsScotchMMM1428Sample preparation
Nail PolishSally Hansen784179032016 074170382839Sample preparation
Optical FilterChromaET480/40mImage acquisition
P1000 PipetmanGilsonF123602Sample preparation
P200 PipetmanGilsonF123601Sample preparation
PBS (10X) ph 7.4ThermoFisher70011044Sample preparation
Propionic AcidFisherA258-500Drosophila food
Spinning disk confocal scanner unitYokagawaCSU-X1Image acquisition
StereomicroscopeNikonSMZ800NSample preparation
Sugar (Sucrose)Genesee62-112Drosophila food
Superfrost SlideVWR48311-600Sample preparation
TegoseptGenesee20-258Drosophila food
UAS-dtacc-RNAi fliesVienna Drosophila Resource Center (Vienna, Austria)VDRC-101439Drosophila genetics/crosses
Vaseline petroleum jellyWB MasonDVOCB311003Sample preparation
Winsor & Newton Brush Regency Gold 520, Size 0Staples5012000Drosophila genetics/crosses
YeastVWRTorula Yeast IC90308580Drosophila food
Yokogawa dichroic beamsplitterSemrockDi01-T405/488/568/647-13x15x0.5Image acquisition

Referanslar

  1. Rolls, M. M. Neuronal polarity in Drosophila: Sorting out axons and dendrites. Developmental Neurobiology. 71 (6), 419-429 (2011).
  2. Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: Mechanisms of dendritic arborization. Nature Reviews Neuroscience. 11 (5), 316-328 (2010).
  3. Lewis, T. L., Courchet, J., Polleux, F. Cell biology in neuroscience: Cellular and molecular mechanisms underlying axon formation, growth, and branching. Journal of Cell Biology. 202 (6), 837-848 (2013).
  4. Kandel, E. R. The Molecular Biology of Memory Storage: A Dialogue Between Genes and Synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
  5. Turney, S. G., Lichtman, J. W. Chapter 11: Imaging Fluorescent Mice In Vivo Using Confocal Microscopy. Methods in Cell Biology. 89 (8), 309-327 (2008).
  6. McCann, C. M., Lichtman, J. W. In vivo imaging of presynaptic terminals and postsynaptic sites in the mouse submandibular ganglion. Developmental Neurobiology. 68 (6), 760-770 (2008).
  7. Turney, S. G., Walsh, M. K., Lichtman, J. W. In vivo imaging of the developing neuromuscular junction in neonatal mice. Cold Spring Harbor Protocols. 7 (11), 1166-1176 (2012).
  8. Tanaka, E., Ho, T., Kirschner, M. W. The role of microtubule dynamics in growth cone motility and axonal growth. Journal of Cell Biology. 128 (1-2), 139-155 (1995).
  9. Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. Journal of Cell Biology. 115 (2), 345-363 (1991).
  10. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  11. Tirnauer, J. S., Bierer, B. E. EB1 proteins regulate microtubule dynamics, cell polarity, and chromosome stability. Journal of Cell Biology. 149 (4), 761-766 (2000).
  12. Schwartz, K., Richards, K., Botstein, D. BIM1 encodes a microtubule-binding protein in yeast. Molecular Biology of the Cell. 8 (12), 2677-2691 (1997).
  13. Juwana, J. P., et al. EB/RP gene family encodes tubulin binding proteins. International Journal of Cancer. 81 (2), 275-284 (1999).
  14. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (4), 309-322 (2008).
  15. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: Two ends in the limelight. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (12), 711-726 (2015).
  16. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic Instability of microtubule growth. Nature. 312 (15), 237-242 (1984).
  17. Van De Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A. Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).
  18. Rebollo, E., Karkali, K., Mangione, F., Martín-Blanco, E. Live imaging in Drosophila: The optical and genetic toolkits. Methods. 68 (1), 48-59 (2014).
  19. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nature Reviews Genetics. 6 (1), 9-23 (2005).
  20. Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila. Neuron. 22 (4), 719-729 (1999).
  21. Miller, K. E., et al. Direct observation demonstrates that Liprin-alpha is required for trafficking of synaptic vesicles. Current Biology. 15 (7), 684-689 (2005).
  22. Rao, K., et al. Spastin, atlastin, and ER relocalization are involved in axon but not dendrite regeneration. Molecular Biology of the Cell. 27 (21), 3245-3256 (2016).
  23. Hill, S. E., et al. Development of dendrite polarity in Drosophila neurons. Neural Development. 7, 34 (2012).
  24. Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite. Molecular Biology of the Cell. 21 (5), 767-777 (2010).
  25. Mattie, F. J., et al. Directed microtubule growth, +TIPs, and kinesin-2 are required for uniform microtubule polarity in dendrites. Current Biology. 20 (24), 2169-2177 (2010).
  26. Stone, M. C., Roegiers, F., Rolls, M. M. Microtubules Have Opposite Orientation in Axons and Dendrites of Drosophila Neurons. Molecular Biology of the Cell. 19 (10), 4122-4129 (2008).
  27. Rolls, M. M., et al. Polarity and intracellular compartmentalization of Drosophila neurons. Neural Development. 2, 7 (2007).
  28. Hu, X., Viesselmann, C., Nam, S., Merriam, E., Dent, E. W. Activity-dependent dynamic microtubule invasion of dendritic spines. Journal of Neuroscience. 28 (49), 13094-13105 (2008).
  29. Merriam, E. B., et al. Dynamic microtubules promote synaptic NMDA receptor-dependent spine enlargement. PLoS One. 6 (11), 27688 (2011).
  30. Hu, X., et al. BDNF-induced increase of PSD-95 in dendritic spines requires dynamic microtubule invasions. Journal of Neuroscience. 31 (43), 15597-15603 (2011).
  31. Merriam, E. B., et al. Synaptic regulation of microtubule dynamics in dendritic spines by calcium, F-actin, and drebrin. Journal of Neuroscience. 33 (42), 16471-16482 (2013).
  32. Jaworski, J., et al. Dynamic Microtubules Regulate Dendritic Spine Morphology and Synaptic Plasticity. Neuron. 61 (1), 85-100 (2009).
  33. Dent, E. W. Of microtubules and memory: Implications for microtubule dynamics in dendrites and spines. Molecular Biology of the Cell. 28 (1), 1-8 (2017).
  34. Yan, Y., Broadie, K. In vivo assay of presynaptic microtubule cytoskeleton dynamics in Drosophila. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 198-205 (2007).
  35. Pawson, C., Eaton, B. A., Davis, G. W. Formin-dependent synaptic growth: evidence that Dlar signals via Diaphanous to modulate synaptic actin and dynamic pioneer microtubules. Journal of Neuroscience. 28 (44), 11111-11123 (2008).
  36. Ruiz-Cañada, C., Budnik, V. Synaptic cytoskeleton at the neuromuscular junction. International Review of Neurobiology. 75 (6), 217-236 (2006).
  37. Bodaleo, F. J., Gonzalez-Billault, C. The presynaptic microtubule cytoskeleton in physiological and pathological conditions: lessons from Drosophila Fragile X syndrome and hereditary spastic paraplegias. Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 60 (2016).
  38. Applegate, K. T., et al. PlusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).
  39. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nature Methods. 7 (9), 761-768 (2010).
  40. Long, J. B., et al. Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics. Molecular and Cellular Biology. 33 (8), 1528-1545 (2013).
  41. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  42. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  43. Ma, Y., Wang, X., Liu, H., Wei, L., Xiao, L. Recent advances in optical microscopic methods for single-particle tracking in biological samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (19), 4445-4463 (2019).
  44. Shen, H., et al. Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications. Chemical Reviews. 117 (11), 7331-7376 (2017).
  45. Zwetsloot, A. J., Tut, G., Straube, A. Measuring microtubule dynamics. Essays in Biochemistry. 62 (6), 725-735 (2018).
  46. Weickert, J. Coherence-Enhancing Diffusion Filtering. International Journal of Computer Vision. 31 (2-3), 111-127 (1999).
  47. Peset, I., Vernos, I. The TACC proteins: TACC-ling microtubule dynamics and centrosome function. Trends in Cell Biology. 18 (8), 379-388 (2008).
  48. Hood, F. E., Royle, S. J. Pulling it together. Bioarchitecture. 1 (3), 105-109 (2011).
  49. Lucaj, C. M., et al. Xenopus TACC1 is a microtubule plus-end tracking protein that can regulate microtubule dynamics during embryonic development. Cytoskeleton. 72 (5), 225-234 (2015).
  50. Nwagbara, B. U., et al. TACC3 is a microtubule plus end-tracking protein that promotes axon elongation and also regulates microtubule plus end dynamics in multiple embryonic cell types. Molecular Biology of the Cell. 25 (21), 3350-3362 (2014).
  51. Rutherford, E. L., et al. Xenopus TACC2 is a microtubule plus end-tracking protein that can promote microtubule polymerization during embryonic development. Molecular Biology of the Cell. 27 (20), 3013-3020 (2016).
  52. Chou, V. T., Johnson, S., Long, J., Vounatsos, M. dTACC restricts bouton addition and regulates microtubule organization at the Drosophila neuromuscular junction. Cytoskeleton. 77 (1-2), 4-15 (2019).
  53. Maiato, H., et al. Human CLASP1 Is an Outer Kinetochore Component that Regulates Spindle Microtubule Dynamics. Cell. 113 (7), 891-904 (2003).
  54. Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. Life cycle of MTs persistent growth in the cell interior , asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary. Journal of Cell Science. 115, 3527-3539 (2002).
  55. Greenspan, R. J. . Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. , (2004).
  56. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: A primer on the drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
  57. Waters, J. C. Live-cell fluorescence imaging. Methods in Cell Biology. 114, 125-150 (2007).
  58. Berger, C., Renner, S., Lüer, K., Technau, G. M. The commonly used marker ELAV is transiently expressed in neuroblasts and glial cells in the Drosophila embryonic CNS. Developmental Dynamics. 236 (12), 3562-3568 (2007).
  59. Robinow, S., White, K. Characterization and spatial distribution of the ELAV protein during Drosophila melanogaster development. Journal of Neurobiology. 22 (5), 443-461 (1991).
  60. Parrish, J. Z., Kim, M. D., Lily, Y. J., Yuh, N. J. Genome-wide analyses identify transcription factors required for proper morphogenesis of Drosophila sensory neuron dendrites. Genes and Development. 20 (7), 820-835 (2006).
  61. Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons. Cell. 112 (6), 805-818 (2003).
  62. Zhang, T., et al. Microtubule plus-end binding protein EB1 is necessary for muscle cell differentiation, elongation and fusion. Journal of Cell Science. 122 (9), 1401-1409 (2009).
  63. Yang, C., et al. EB1 and EB3 regulate microtubule minus end organization and Golgi morphology. Journal of Cell Biology. 216 (10), 3179-3198 (2017).
  64. Allison, A., Nunn, J. Effect of general anaesthetics on microtubules. Lancet. 292 (7582), 1326-1329 (1968).
  65. Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, drosophila and zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (67), e3780 (2012).
  66. Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments. (84), e50998 (2014).
  67. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible neurotechnique cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (5), 451-461 (1999).
  68. Resh, M. D. Fatty acylation of proteins: New insights into membrane targeting of myristoylated and palmitoylated proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1451 (1), 1-16 (1999).
  69. Edwards, K. A., Demsky, M., Montague, R. A., Weymouth, N., Kiehart, D. P. GFP-moesin illuminates actin cytoskeleton dynamics in living tissue and demonstrates cell shape changes during morphogenesis in Drosophila. Developmental Biology. 191 (1), 103-117 (1997).
  70. Riedl, J., et al. Lifeact a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  71. Dent, E. W., Kalil, K. Axon Branching Requires Interactions between Dynamic Microtubules and Actin Filaments. Journal of Neuroscience. 21 (24), 9757-9769 (2001).
  72. Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones. Journal of Cell Biology. 158 (1), 139-152 (2002).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

3D Par ac k zlemeNoninvaziv AnalizSinaptik Mikrot b l Dinami iDendritlerN rom sk ler Kav aklarDrosophilaMikrot b llerCanl G r nt lemeOtomatik AnalizEB1 GFPMT ile li kili ProteinDTACC KnockdownMultiparametrik AnalizPolimer D zeyinde DavranH cresel Morfoloji

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır