Method Article
* These authors contributed equally
نحن نصمم اختبار ECL متعدد الإرسال بسيط يجمع بين 7 اختبارات للأجسام المضادة الذاتية معا. الفحص قادر على فحص T1D وأمراض المناعة الذاتية الأخرى المتعددة ، في وقت واحد ، بما في ذلك مرض الاضطرابات الهضمية ، وأمراض الغدة الدرقية المناعية الذاتية ، ومتلازمة المناعة الذاتية متعددة الغدد 1.
تستخدم الأجسام المضادة الذاتية للجزيرة (IAbs) على نطاق واسع في تشخيص مرض السكري من النوع الأول (T1D) والتنبؤ به. أربعة IAbs الرئيسية إلى الأنسولين (IAA) ، ديكاربوكسيلاز الغلوتامات -65 (GADA) ، مستضد insulinoma -2 (IA-2A) ، وناقل الزنك -8 (ZnT8A) هي بنفس القدر من الأهمية في التنبؤ بالأمراض. في الوقت الحاضر ، ما يصل إلى 40 ٪ من المرضى الذين تم تشخيصهم ب T1D يستمرون في تطوير اضطرابات المناعة الذاتية الأخرى. لسوء الحظ ، فإن طرق الفحص الحالية التي تستخدم جسما مضادا ذاتيا واحدا للقياس شاقة وغير فعالة لدراسات الفحص واسعة النطاق. لقد طورنا مؤخرا اختبارا بسيطا للتلألؤ الكهروكيميائي المتعدد الإرسال (ECL) لمعالجة هذه المشكلات الحالية. يجمع الفحص بين جميع اختبارات الأجسام المضادة الذاتية ال 7 في بئر واحد. يتضمن كل بئر ثلاثة IAbs (IAA و GADA و IA-2A) ، والأجسام المضادة الذاتية لبيروكسيديز الغدة الدرقية (TPOA) والجلوبيولين الدرقي (ThGA) للكشف عن أمراض الغدة الدرقية المناعية الذاتية ، والأجسام المضادة الذاتية للأنسجة transglutaminase (TGA) لمرض الاضطرابات الهضمية ، والأجسام المضادة الذاتية للإنترفيرون ألفا (IFNαA) لمتلازمة المناعة الذاتية متعددة الغدد -1 (APS-1) ؛ كل ذلك فحص ل T1D وغيرها من أمراض المناعة الذاتية ذات الصلة ، في وقت واحد. يعتمد فحص ECL متعدد الإرسال على منصة فحص ECL المفردة ، ولكنه يستخدم بدلا من ذلك لوحة متعددة الإرسال تجمع بين اختبارات الأجسام المضادة الذاتية المتعددة ، حتى 10 ، في بئر واحد. الفرق الرئيسي عن فحص ECL الفردي هو أن كل مركب مستضد الأجسام المضادة يتكون في مرحلة السائل يتم تقييده على بقعة محددة على كل بئر من خلال نظام رابط على لوحة متعددة الإرسال. تم التحقق من صحة فحص 7-Plex ECL ، في هذه الدراسة ، مقابل مقايسات الربط الإشعاعي القياسية (RBA) وفحوصات ECL المفردة ، باستخدام مجموعة كبيرة من مرضى T1D الذين تم تشخيصهم حديثا والضوابط الصحية المتطابقة مع العمر ، مما أدى إلى حساسية وخصوصية ممتازة للفحص.
مرض السكري من النوع الأول (T1D) هو مرض مزمن خطير هو الأكثر شيوعا في مرحلة الطفولة. حاليا ، حوالي 1.4 مليون شخص لديهم T1D في الولايات المتحدة. ومن اللافت للنظر أن معدل الإصابة ب T1D يتزايد باطراد بنسبة 3-5٪ كل عام في جميع أنحاء العالم وقد تضاعف في العقدين الماضيين ، خاصة في الأطفال الصغار 1,2. الأجسام المضادة الذاتية للجزيرة (IAbs) في الدورة الدموية هي العلامة الحيوية الأكثر موثوقية في الوقت الحاضر. قد تظهر IAbs قبل سنوات من تطور T1D السريري3. حاليا ، يتم استخدام أربعة IAbs رئيسية على نطاق واسع في تشخيص T1D وفحص المخاطر بما في ذلك الأجسام المضادة الذاتية للأنسولين (IAA) ، ديكاربوكسيلاز الغلوتامات -65 (GADA) ، مستضد insulinoma -2 (IA-2A) ، وناقل الزنك -8 (ZnT8A). هذه IAbs الأربعة لها نفس القدر من الأهمية في التنبؤ بتطوير T1D. تم إعادة تعريف تصنيف T1D مؤخرا على أنه وجود ≥2 من أي 4 IAbs مع استقلاب الجلوكوز الطبيعي كمرحلة المرض 14.
في دراسة المناعة الذاتية لمرض السكري في الشباب (DAISY) ، تم الكشف عن أن واحدا من كل أربعة أطفال معرضين لخطر T1D من المرجح أن يتقدم إلى المناعة الذاتية للجزيرة أو الاضطرابات الهضمية أو الغدة الدرقية أو الروماتويد ، والأكثر لفتا للنظر ، ما يقرب من 40 ٪ من المرضى الذين تم تشخيصهم ب T1D يطورون في النهاية حالة مناعة ذاتية إضافية 5,6,7 . تحديد الأجسام المضادة الذاتية ضرورية للتنبؤ وتشخيص أمراض المناعة الذاتية هذه ويجب أن توفر رعاية سريرية أفضل للمرضى. لا توجد طريقة سهلة وغير مكلفة في الوقت الحاضر للكشف عن حالات المناعة الذاتية المتعددة هذه. طرق الفحص الحالية باستخدام فحص الربط الراديوي القياسي (RBA) ، مع قياس واحد للأجسام المضادة الذاتية ، شاقة وغير فعالة لإجراء فحص واسع النطاق.
هنا ، سنصف فحص ECL البسيط متعدد الإرسال الذي تم تطويره حديثا ، والذي قمنا بمصادقته باستخدام منصة فحص ECL واحدة 8,9,10,11. يجمع فحص ECL متعدد الإرسال بين 7 اختبارات للأجسام المضادة الذاتية في بئر واحد ، باستخدام 15 ميكرولتر فقط من المصل ، وهو قادر على فحص T1D وأمراض المناعة الذاتية المتعددة ذات الصلة في وقت واحد بما في ذلك مرض الاضطرابات الهضمية وأمراض الغدة الدرقية المناعية الذاتية و APS-1. لم يتم تطوير فحص ZnT8A ECL في ذلك الوقت ولم يتم تضمينه في الفحص متعدد الإرسالات. يوفر فحص ECL متعدد الإرسال أداة ممتازة للإنتاجية العالية في الفحص العام للسكان ل T1D وأمراض المناعة الذاتية المتعددة.
تمت الموافقة على بروتوكول البحث من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المتعددة في كولورادو.
1. إعداد المخزن المؤقت
2. وضع علامات على كل بروتين مستضد مع البيوتين و Ru Sulfo-NHS بشكل منفصل
ملاحظة: للحصول على تفاعل وضع علامات أكثر فعالية، استخدم تركيز بروتين مستضد ≥0.5 ملغم/مل.
3. تحديد أفضل تركيز ونسب للمستضدتين الموسومتين للفحص (فحص رقعة الشطرنج)
ملاحظة: نظرا لأن فحص ECL-IAA في هذا الفحص 7-Plex يتطلب معالجة حمضية لعينات المصل ، فإن فحص رقعة الشطرنج لكل مستضد يجب أن يمر بهذه الخطوة قبل احتضانه بخليط المستضد الموسوم.
4. إنشاء حل المستضد المختلط المرتبط بالوصلة
5. احتضان عينات المصل مع المستضد المسمى
ملاحظة: نظرا لأن فحص ECL-IAA في هذا الفحص 7-Plex يتطلب معالجة حمضية لعينات المصل ، فإن كل مصل يتطلب خطوة معالجة الحمض قبل احتضانه بخليط مستضد مسمى لهذا الفحص 7-Plex.
6. إعداد لوحة متعددة الإرسال
7. نقل مصل / مستضد يحتضن في لوحة متعددة الإرسال
8. اغسل اللوحة وأضف المخزن المؤقت للقراءة
9. قراءة اللوحة وتحليل البيانات
ويبين تحليل نتائج الفحص في الجدول 1 والجدول 2 والجدول 3. تأتي قيم القراءة من البيانات من 10 نقاط داخل نفس البئر. تم حساب قيم الفهرس لكل عينة مقابل الضوابط الداخلية الإيجابية والسلبية المقابلة لها كما هو موضح في بروتوكول المقايسة. وترد أمثلة على التكرارات السيئة في الجدول 1 والتي تسببت في حدوث خطأ في حساب الفهرس النهائي في الجدول 3. يجب التحقق من جميع قيم العد الخام لتجنب أي نتائج إيجابية خاطئة أو سلبية خاطئة.
تم التحقق من صحة فحص ECL متعدد الإرسال 7 باستخدام مجموعة كبيرة من العينات من 1026 مريضا تم تشخيصهم حديثا ب T1D و 1022 من العمر والجنس المتطابقين مع مواضيع التحكم الصحية. تمت مقارنة مستويات الأجسام المضادة الذاتية من فحص 7-Plex ECL ل 1026 مريضا T1D مع المستويات من كل من اختبارات ECL الفردية المقابلة لدينا كما هو موضح في الشكل 2 ومن كل RBA قياسي واحد مقابل و ELISA كما هو موضح في الشكل 3. تم إعداد خصائص الفحص متطابقة عند 99في المائة لجميع اختبارات الأجسام المضادة الذاتية باستثناء الأجسام المضادة الذاتية للغدة الدرقية (حيث تم استخدام النسبة المئوية 95) ، من 1022 عنصر تحكم صحي لجميع طرق الفحص الثلاثة (7-Plex ECL أو ECL مفرد أو RBA أو ELISA) كما هو مدرج في الجدول 4. السير الذاتية بين الفحص من GADA و IA-2A و IAA و TPOA و THGA و TGA و IFNαA هي 6.4٪ و 4.5٪ و 9.1٪ و 4.9٪ و 5.7٪ و 11.3٪ و 5.9٪ على التوالي.
تم العثور على عدد صغير من العينات المتضاربة لكل من الأجسام المضادة الذاتية ال 7 حول خط الحدود من القطع لكل مقايسة (الشكل 2 والشكل 3). تم العثور على إحدى عشرة عينة تحكم (11/1022 ، 1.1٪) إيجابية متعددة للأجسام المضادة الذاتية فقط في فحص 7-Plex وسالبة في كل فحص واحد مقابل. وبالمثل ، حدث ذلك في 9 عينات من مرضى T1D (9/1026 ، 0.9٪). بالإضافة إلى ذلك ، تم تفويت 10 TPOA إيجابية عالية و ThGA واحد في مجموعة المرضى التي شوهدت في كل من فحص ECL الفردي و RBA في فحص 7-Plex. تم تحويل هذه العينات إيجابية في فحص 7-Plex عندما تم تخفيفها أكثر. بشكل عام ، تمت تغطية 100٪ من الإيجابية في فحص ECL الفردي أو RBA في اختبار ECL 7-Plex ، بنفس خصوصية المقايسة كما هو موضح في الجدول 4.
الشكل 1: رسم توضيحي لفحص Mutiplex ECL.
الأجسام المضادة الذاتية في المصل سوف تربط مستضد Ru Sulfo-NHSged بمستضد البيوتينيلات. ويقترن ذلك برابط محدد لتشكيل مجمع من رابط المستضد والأجسام المضادة والمستضدات. يتم التقاط المجمعات على اللوحة ويتم تقييدها إلى مواقعها المحددة من خلال كل رابط محدد. يتم توضيح أرقام الروابط المقترنة على وجه التحديد ، ل 7 بروتينات مستضدية مختلفة. يتم الكشف عن إشارات الأجسام المضادة باستخدام مستضدات Ru Sulfo-NHS المسماة بالمستضدات مع التلألؤ الكهروكيميائي. الرقم مأخوذ من Gu, Y. et al.13. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مقارنة 7 مستويات من الأجسام المضادة الذاتية في 1026 مريضا جديدا يعانون من T1D بين فحص ECL الفردي وفحص ECL 7-Plex.
تعرض اللوحات A و B و C و D و E و F و G مقارنات لمستويات الأجسام المضادة الذاتية ل GADA و IA-2A و IAA و TKA و TPOA و THGA و IFNαA ، على التوالي. تمثل الخطوط المنقطة قطع الفحص لكل فحص للأجسام المضادة الذاتية. تم تعيين القطع إلى النسبة المئوية 99 من 1022 ضوابط صحية مطابقة للعمر لكل فحص (باستثناء TPOA و ThGA اللذين تم تعيينهماعلى النسبة المئوية 95) ، كما هو موضح في الجدول 4 ، من سن 1022 مطابقة الضوابط الصحية لكل من فحوصات ECL الفردية والمتعددة الإرسال. يتم وضع علامة على الماس الأحمر المغلق على أنه إيجابيات "كاذبة" في فحص 7-Plex ECL ، <1٪ من المجموعة التي تمت دراستها ، وتم التحقق من صحتها على أنها سلبية في كل من ECL الفردي و RBA. يتم وضع علامة على المربعات الحمراء القريبة على أنها سلبيات "كاذبة" في فحص ECL 7-Plex الناجم عن ظاهرة "prozone" ، والتي تحدث بشكل رئيسي في فحص TPOA في <1٪ من المجموعة التي تمت دراستها. تتم مناقشة كل من هذه النتائج الإيجابية الكاذبة والسلبية الكاذبة في قسم المناقشة. الرقم مأخوذ من Gu, Y. et al.13. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مقارنة 7 مستويات من الأجسام المضادة الذاتية في 1026 مريضا جديدا يعانون من T1D بين RBA (ELISA for IFNαA) وفحص 7-Plex ECL.
تقدم اللوحات A و B و C و D و E و F و G مقارنات لمستويات الأجسام المضادة الذاتية ل GADA و IA-2A و IAA و TKA و TPOA و THGA و IFNαA ، على التوالي. تمثل الخطوط المنقطة قطع الفحص لكل فحص للأجسام المضادة الذاتية ، وهي نفس الخصوصية المحددة لكل من RBA و 7-Plex ECL ، كما هو موضح في الجدول 4 ، من سن 1022 مطابقة الضوابط الصحية. يمثل الماس والمربعات الحمراء المغلقة إيجابيات "كاذبة" وسلبيات "كاذبة" تظهر في فحص 7-Plex ECL ، ويظهر الشيء نفسه في الشكل 2. الرقم مأخوذ من Gu, Y. et al.13. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | ||
A | 5580 | 5674 | 105 | 117 | 125 | 139 | لينكر-1 |
100 | 108 | 102 | 102 | 3956 | 3745 | لينكر-2 | |
115 | 124 | 107 | 116 | 113 | 124 | لينكر-3 | |
67 | 64 | 68 | 61 | 65 | 69 | لينكر-4 | |
89 | 87 | 98 | 92 | 90 | 80 | لينكر-5 | |
87 | 71 | 89 | 87 | 61 | 72 | لينكر-6 | |
94 | 82 | 79 | 85 | 2154 | 2280 | لينكر-7 | |
75 | 66 | 1628 | 1594 | 81 | 83 | لينكر-8 | |
98 | 103 | 71 | 84 | 69 | 85 | لينكر-9 | |
102 | 118 | 93 | 98 | 113 | 99 | لينكر-10 | |
B | 324 | 337 | 147 | 148 | 5426 | 5366 | لينكر-1 |
101 | 102 | 93 | 88 | 86 | 74 | لينكر-2 | |
111 | 119 | 119 | 123 | 66 | 72 | لينكر-3 | |
72 | 65 | 59 | 68 | 74 | 67 | لينكر-4 | |
81 | 98 | 83 | 92 | 79 | 72 | لينكر-5 | |
90 | 84 | 93 | 86 | 70 | 76 | لينكر-6 | |
101 | 105 | 101 | 97 | 956 | 944 | لينكر-7 | |
82 | 83 | 189 | 204 | 97 | 90 | لينكر-8 | |
92 | 83 | 78 | 64 | 82 | 78 | لينكر-9 | |
83 | 79 | 88 | 93 | 4722 | 4965 | لينكر-10 | |
C | 110 | 110 | 87 | 81 | 2114 | 2365 | لينكر-1 |
5526 | 5680 | 88 | 70 | 86 | 93 | لينكر-2 | |
114 | 132 | 67 | 71 | 3326 | 3284 | لينكر-3 | |
64 | 62 | 88 | 74 | 64 | 80 | لينكر-4 | |
94 | 82 | 86 | 75 | 89 | 76 | لينكر-5 | |
77 | 87 | 75 | 63 | 70 | 86 | لينكر-6 | |
77 | 86 | 71 | 84 | 138 | 121 | لينكر-7 | |
73 | 86 | 80 | 79 | 59 | 73 | لينكر-8 | |
86 | 74 | 5064 | 4923 | 88 | 86 | لينكر-9 | |
105 | 113 | 85 | 80 | 124 | 114 | لينكر-10 | |
D | 98 | 88 | 92 | 84 | 136 | 127 | لينكر-1 |
288 | 291 | 86 | 86 | 558 | 564 | لينكر-2 | |
109 | 101 | 74 | 73 | 141 | 127 | لينكر-3 | |
78 | 66 | 66 | 55 | 74 | 66 | لينكر-4 | |
79 | 83 | 79 | 86 | 96 | 91 | لينكر-5 | |
83 | 86 | 96 | 89 | 86 | 73 | لينكر-6 | |
87 | 89 | 77 | 87 | 841 | 855 | لينكر-7 | |
74 | 72 | 60 | 72 | 90 | 95 | لينكر-8 | |
68 | 75 | 331 | 328 | 2460 | 2580 | لينكر-9 | |
86 | 98 | 80 | 75 | 123 | 133 | لينكر-10 | |
E | 101 | 114 | 101 | 106 | 532 | 548 | لينكر-1 |
101 | 96 | 110 | 104 | 682 | 675 | لينكر-2 | |
6015 | 5988 | 124 | 126 | 101 | 98 | لينكر-3 | |
66 | 71 | 82 | 71 | 80 | 62 | لينكر-4 | |
102 | 97 | 99 | 80 | 83 | 110 | لينكر-5 | |
82 | 67 | 81 | 80 | 60 | 85 | لينكر-6 | |
85 | 95 | 52 | 84 | 245 | 221 | لينكر-7 | |
72 | 78 | 82 | 74 | 486 | 503 | لينكر-8 | |
77 | 97 | 97 | 77 | 56 | 66 | لينكر-9 | |
114 | 104 | 5726 | 5814 | 259 | 253 | لينكر-10 | |
F | 119 | 120 | 133 | 118 | 112 | 96 | لينكر-1 |
101 | 91 | 100 | 95 | 96 | 82 | لينكر-2 | |
406 | 395 | 111 | 123 | 2127 | 101 | لينكر-3 | |
72 | 60 | 86 | 72 | 79 | 83 | لينكر-4 | |
76 | 85 | 96 | 99 | 89 | 103 | لينكر-5 | |
88 | 78 | 91 | 83 | 89 | 95 | لينكر-6 | |
104 | 97 | 87 | 102 | 56 | 66 | لينكر-7 | |
76 | 77 | 79 | 93 | 69 | 75 | لينكر-8 | |
85 | 71 | 95 | 100 | 83 | 71 | لينكر-9 | |
131 | 131 | 358 | 364 | 92 | 86 | لينكر-10 | |
G | 90 | 95 | 85 | 82 | 105 | 107 | لينكر-1 |
99 | 86 | 77 | 76 | 1250 | 1174 | لينكر-2 | |
119 | 123 | 120 | 118 | 112 | 108 | لينكر-3 | |
76 | 83 | 77 | 80 | 86 | 76 | لينكر-4 | |
88 | 86 | 86 | 93 | 107 | 92 | لينكر-5 | |
73 | 73 | 71 | 82 | 84 | 75 | لينكر-6 | |
5210 | 5173 | 72 | 69 | 76 | 85 | لينكر-7 | |
80 | 81 | 79 | 82 | 100 | 101 | لينكر-8 | |
96 | 97 | 89 | 83 | 65 | 83 | لينكر-9 | |
98 | 103 | 86 | 88 | 1933 | 1979 | لينكر-10 | |
H | 114 | 124 | 81 | 86 | 299 | 295 | لينكر-1 |
107 | 92 | 69 | 72 | 4256 | 4388 | لينكر-2 | |
114 | 123 | 125 | 129 | 501 | 536 | لينكر-3 | |
77 | 70 | 67 | 64 | 74 | 62 | لينكر-4 | |
92 | 110 | 81 | 84 | 77 | 71 | لينكر-5 | |
87 | 79 | 72 | 76 | 83 | 81 | لينكر-6 | |
328 | 341 | 84 | 80 | 88 | 97 | لينكر-7 | |
75 | 84 | 75 | 90 | 74 | 83 | لينكر-8 | |
73 | 79 | 78 | 76 | 84 | 70 | لينكر-9 | |
113 | 120 | 81 | 76 | 2372 | 2350 | لينكر-10 |
الجدول 1: تحليل فحص ECL 7-plex: عدد CPS الخام (النصف الأيسر من اللوحة). يتم الحصول على أعداد CPS الخام من لوحة فحص (النصف الأيسر من اللوحة) ويتم تنفيذ كل عينة في نسختين. تحت كل صف من صفوف اللوحة (A-H) ، هناك 10 أسطر من قيم القراءة تمثل البيانات من 10 نقاط داخل نفس البئر ، تتوافق مع كل رقم رابط كما هو محدد. يتم تمييز أمثلة التكرارات السيئة باللون الرمادي ، كما هو موضح في الصف F-linker 3-columns 5 و 6.
صف الجدول 1 ألف | عمود الجدول 1 ألف | لينكر 1 | لينكر 2 | لينكر 3 | لينكر 7 | لينكر 8 | لينكر 9 | لينكر 10 | |
A | 1-2 | GADA PC | 5627 | 104 | 120 | 88 | 71 | 101 | 110 |
B | 1-2 | GADA منخفض الكمبيوتر | 331 | 102 | 115 | 103 | 83 | 88 | 81 |
C | 1-2 | TPOA PC | 110 | 5603 | 123 | 82 | 80 | 80 | 109 |
D | 1-2 | TPOA كمبيوتر منخفض | 93 | 290 | 105 | 88 | 73 | 72 | 92 |
E | 1-2 | TGA PC | 108 | 99 | 6002 | 90 | 75 | 87 | 109 |
F | 1-2 | TG كمبيوتر منخفض | 120 | 96 | 401 | 101 | 77 | 78 | 131 |
G | 1-2 | ThGA PC | 93 | 93 | 121 | 5192 | 81 | 97 | 101 |
H | 1-2 | ThGA منخفض الكمبيوتر | 119 | 100 | 119 | 335 | 80 | 76 | 117 |
A | 3-4 | IAA PC | 111 | 102 | 112 | 82 | 1611 | 78 | 96 |
B | 3-4 | IAA كمبيوتر منخفض | 148 | 91 | 121 | 99 | 197 | 71 | 91 |
C | 3-4 | IFNaA PC | 84 | 79 | 69 | 78 | 80 | 4994 | 83 |
D | 3-4 | IFNaA كمبيوتر منخفض | 88 | 86 | 74 | 82 | 66 | 330 | 78 |
E | 3-4 | IA-2A PC | 104 | 107 | 125 | 68 | 78 | 87 | 5770 |
F | 3-4 | IA-2A كمبيوتر منخفض | 126 | 98 | 117 | 95 | 86 | 98 | 361 |
G | 3-4 | نورث كارولاينا | 84 | 77 | 119 | 71 | 81 | 86 | 87 |
H | 3-4 | نورث كارولاينا | 84 | 71 | 127 | 82 | 78 | 77 | 79 |
A | 5-6 | عينة1 | 132 | 3851 | 119 | 2217 | 82 | 77 | 106 |
B | 5-6 | عينة2 | 5396 | 80 | 69 | 950 | 94 | 80 | 4844 |
C | 5-6 | عينة3 | 2240 | 90 | 3305 | 130 | 66 | 87 | 119 |
D | 5-6 | عينة4 | 132 | 561 | 134 | 848 | 93 | 2520 | 128 |
E | 5-6 | عينة5 | 540 | 679 | 100 | 233 | 495 | 61 | 256 |
F | 5-6 | عينة6 | 104 | 89 | 1114 | 61 | 72 | 77 | 89 |
G | 5-6 | عينة7 | 106 | 1212 | 110 | 81 | 101 | 74 | 1957 |
H | 5-6 | عينة8 | 297 | 4322 | 519 | 93 | 79 | 77 | 2361 |
الجدول 2: تحليل فحص ECL 7-plex: ترتيب بيانات الجدول 1 ، مع وضع علامة على أنها 7 روابط. وأعيد ترتيب البيانات المستمدة من الجدول 1، مع حذف الروابط من 4 إلى 6 (غير المستخدمة)، وحسبت القيم المتوسطة من كل قراءة مكررة من الجدول 1. قيم الضوابط الإيجابية القياسية الداخلية العالية والمنخفضة ، المقابلة لكل فحص للأجسام المضادة الذاتية ، المقيدة بواسطة رابط معين ، هي بخط غامق مظلم. الكمبيوتر الشخصي ، والسيطرة الإيجابية. NC ، السيطرة العادية.
مؤشر GAD | مؤشر TPOA | مؤشر TGA | مؤشر ThGA | IAA-Index | IFNaA-index | IA-2A-مؤشر | |
GADA PC | 1.000 | 0.005 | 0.000 | 0.003 | -0.006 | 0.003 | 0.004 |
GADA منخفض الكمبيوتر | 0.045 | 0.005 | -0.001 | 0.006 | 0.002 | 0.000 | -0.001 |
IAA PC | 0.005 | 1.000 | 0.001 | 0.002 | -0.001 | -0.001 | 0.004 |
IAA كمبيوتر منخفض | 0.002 | 0.039 | -0.002 | 0.003 | -0.005 | -0.003 | 0.001 |
IA-2A PC | 0.004 | 0.004 | 1.000 | 0.004 | -0.004 | 0.000 | 0.004 |
IA-2A كمبيوتر منخفض | 0.007 | 0.004 | 0.048 | 0.006 | -0.002 | -0.002 | 0.008 |
TGA PC | 0.002 | 0.003 | 0.000 | 1.000 | 0.000 | 0.002 | 0.002 |
TG كمبيوتر منخفض | 0.006 | 0.004 | 0.000 | 0.052 | -0.001 | -0.002 | 0.005 |
TPOA PC | 0.005 | 0.005 | -0.001 | 0.002 | 1.000 | -0.002 | 0.001 |
TPOA كمبيوتر منخفض | 0.012 | 0.003 | 0.000 | 0.006 | 0.076 | -0.003 | 0.001 |
ThGA PC | 0.000 | 0.000 | -0.008 | 0.001 | 0.000 | 1.000 | -0.001 |
ThGA منخفض الكمبيوتر | 0.001 | 0.002 | -0.008 | 0.002 | -0.009 | 0.050 | -0.002 |
IFNaA PC | 0.004 | 0.006 | 0.001 | 0.000 | -0.002 | 0.000 | 1.000 |
IFNaA كمبيوتر منخفض | 0.008 | 0.004 | 0.000 | 0.005 | 0.004 | 0.002 | 0.048 |
نورث كارولاينا | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
نورث كارولاينا | 0.000 | -0.001 | 0.001 | 0.002 | -0.002 | -0.002 | -0.001 |
عينة1 | 0.009 | 0.683 | 0.000 | 0.419 | 0.001 | -0.002 | 0.003 |
عينة2 | 0.958 | 0.001 | -0.008 | 0.172 | 0.009 | -0.001 | 0.837 |
عينة3 | 0.389 | 0.002 | 0.542 | 0.012 | -0.009 | 0.000 | 0.006 |
عينة4 | 0.009 | 0.088 | 0.003 | 0.152 | 0.008 | 0.496 | 0.007 |
عينة5 | 0.082 | 0.109 | -0.003 | 0.032 | 0.271 | -0.005 | 0.030 |
عينة6 | 0.004 | 0.002 | 0.169 | -0.002 | -0.006 | -0.002 | 0.000 |
عينة7 | 0.004 | 0.205 | -0.002 | 0.002 | 0.013 | -0.002 | 0.329 |
عينة8 | 0.039 | 0.768 | 0.068 | 0.004 | -0.001 | -0.002 | 0.400 |
الجدول 3: تحليل فحص ECL 7-plex: نتائج قيم المؤشر. تم حساب قيم المؤشر لكل عينة لجميع اختبارات الأجسام المضادة الذاتية ال 7 مقابل الضوابط الإيجابية والسلبية الداخلية المقابلة لها كما هو موضح في بروتوكول المقايسة. تم تعريف أي قيمة مؤشر أكبر من القيمة المقطوعة على أنها نتيجة إيجابية ، موضحة بخط غامق داكن. تم تمييز قيمة مؤشر TGA للعينة6 باللون الرمادي لأنها خطأ ناتج عن تكرارات سيئة تظهر في الصف F-linker 3-columns 5 و 6 في الجدول 1.
غادا | IA-2A | الاكاديميه | .TGA | تبوا | ثغا | IFNαA* | ||||||||
سينس | المواصفات | سينس | المواصفات | سينس | المواصفات | سينس | المواصفات | سينس | المواصفات | سينس | المواصفات | سينس | المواصفات | |
بنك الاحتياطي الأسترالي | 73.4% | 98.5% | 75.2% | 99.0% | 47.7% | 99.1% | 12.9% | 99.0% | 23.9% | 95.2% | 19.3% | 94.7% | 1.0% | 99.6% |
ECL واحد | 71.6% | 99.1% | 73.6% | 99.3% | 48.3% | 99.7% | 16.0% | 98.9% | 26.3% | 94.9% | 20.6% | 95.1% | 0.8% | 99.2% |
7-بلكس ECL | 71.2% | 98.9% | 77.3% | 98.9% | 49.5% | 98.9% | 16.5% | 98.7% | 26.1% | 94.7% | 21.1% | 94.7% | 1.7% | 99.1% |
الجدول 4: حساسية الفحص وخصوصيته بين 1026 مريضا من مرضى T1D و 1022 ضابطا ، متطابقة لكل من العمر والجنس ، في فحص ECL 7-plex ، مقارنة بفحص ECL الفردي المقابل و RBA أو ELISA *. تم تعيين فحوصات مختلفة ل T hree (RBA و ECL مفردة و 7-Plex ECL) لكل جسم مضاد ذاتي على خصائص مماثلة باستخدام الضوابط الصحية المتطابقة مع العمر والجنس 1022. تم تعيين نتيجة الخصوصية من مجموعة التحكم التي تمت دراستها حول 95٪ ل TPOA و ThGA و 99٪ ل 5 اختبارات أخرى. * علامة النجمة تشير إلى اختبار IFNαA ل ELISA ، في حين أن البعض الآخر هو RBA.
في العديد من التجارب السريرية الوطنية والدولية لمرض السكري من النوع 1 ، تم إثبات أداء فحص ECL الفردي للكشف عن الأجسام المضادة الذاتية للجزيرة والأجسام المضادة الذاتية ل transglutaminase (TGA) لمرض الاضطرابات الهضمية ،8،9،10،11. خلال هذه المسارات ، زاد هذا الفحص من حساسية وخصوصية الكشف عن المستضدات الذاتية عند تقييمها مقابل معيار RBA "الذهبي" الحالي. يمكن النظر إلى خصوصية المرض المحسنة عند التمييز بين الأجسام المضادة الذاتية للجزيرة عالية التقارب وعالية الخطورة من إشارات منخفضة الخطورة ومنخفضة التقارب ، بين فحص ECL الفردي و RBA14,15,16,17. بناء على فحص ECL واحد ، فإننا نطرح فحصا جديدا للأجسام المضادة الذاتية ECL متعددة الإرسال عالية الإنتاجية ، لتمكيننا من فحص T1D بالإضافة إلى العديد من أمراض المناعة الذاتية القابلة للتطبيق في نفس الوقت.
يستخدم فحص ECL متعدد الإرسال لوحة متعددة الإرسال ، والتي يمكن أن تجمع بين ما يصل إلى 10 اختبارات للأجسام المضادة الذاتية في بئر واحد. بالنسبة للدراسة الحالية ، يتم الجمع بين 7 اختبارات الأجسام المضادة الذاتية معا. تتكون الأجسام المضادة الذاتية من 3 IAbs (IAA و GADA و IA-2A) ، و 2 من الأجسام المضادة الذاتية لأمراض الغدة الدرقية المناعية الذاتية (TPOA و ThGA) ، والأجسام المضادة الذاتية لمرض الاضطرابات الهضمية (TGA) ، والأجسام المضادة الذاتية APS-1 للإنترفيرون ألفا (IFNαA). تعتمد آلية الفحص ، بشكل عام ، على فحص ECL واحد كما تم نشره سابقا9،10،12،18 مع بعض التعديلات. الفرق الرئيسي لفحص ECL متعدد الإرسال من فحص ECL واحد هو أن كل مركب مستضد الأجسام المضادة المتشكل في مرحلة السائل مقيد برابط معين (الشكل 1). يتم احتضان مستضد البيوتين المسمى بالستربتافيدين المقترن ، وهو رابط يستخدم لتشكيل مجمع محدد لربط المستضدات. يتشكل مركب مناعي مستضد الأجسام المضادة بعد الحضانة مع مصل المريض ويتم التقاطه في بقعة محددة من خلال نظام الرابط المحدد على كل بئر من الصفيحة المتعددة. يوفر المستضد المسمى Ru Sulfo-NHS الذي تم التقاطه بواسطة الأجسام المضادة في نفس الوقت الإشارة مع التلألؤ الكيميائي الكهربائي. يمكن لآلة قارئ اللوحات اكتشاف ما يصل إلى 10 إشارات مختلفة من المصادر الفورية الموجودة في كل بئر. للحفاظ على اتساق اختبارات الأجسام المضادة الذاتية بين الصفائح وأثناء إجراء دراسات طويلة الأجل ، نقترح استخدام نفس الرابط.
قبل إعداد فحص ECL متعدد الإرسال ، يجب تحسين اختبارات ECL المفردة لكل جسم مضاد ذاتي على لوحة متعددة الإرسال ، على التوالي ، والتحقق من صحتها مقابل كل من اختبارات RBA و ECL المفردة على لوحة ECL العادية. لتعزيز فحص رقعة الشطرنج ، إلى فحص الأجسام المضادة الذاتية ذات الصلة على لوحة الإرسال المتعدد ، تم استخدام مريض إيجابي عالي وعينة سلبية من المريض. بعد إجراء فحص رقعة الشطرنج ، فإن التركيزات الأكثر مثالية ل Ru Sulfo-NHS والبيوتين تحمل علامة المستضد حيث يتم حسابها لكل من اختبارات الأجسام المضادة الذاتية 7. وفيما يلي بيان لهذه التركيزات: 30 نانوغرام/مل و200 نانوغرام/مل ل GAD65، و 120 نانوغرام/مل و 120 نانوغرام/مل للبروأنسولين، و 10 نانوغرام/مل و 42 نانوغرام/مل ل IA-2، و 80 نانوغرام/مل و 80 نانوغرام/مل ل TG، و 8 نانوغرام/مل و 16 نانوغرام/مل ل TPO، و 31 نانوغرام/مل و 31 نانوغرام/مل ل ThG، و 12 نانوغرام/مل و 12 نانوغرام/مل على التوالي ل IFNα13. قد تحتاج تركيزات بعض المستضدات من فحص رقعة الشطرنج إلى مزيد من التعديل وفقا للنتائج في فحص الإرسال المتعدد الفعلي بعد الجمع بين جميع المقايسات معا.
نظرا لأن IAA مدرج في فحص ECL متعدد الإرسال الحالي ، فإن المعالجة الحمضية لعينات المصل إلزامية قبل احتضان المصل بالمستضد ، كما ورد في الدراسة السابقة12. بشكل عام ، عند إضافة جسم مضاد ذاتي إضافي إلى فحص متعدد الإرسال ، تتأثر خلفية الفحص وقد تعيق إشارة عالية للغاية من بقعة واحدة ، في البئر ، نتائج البقع القريبة عبر المحادثة المتقاطعة. لذلك ، يجب أن يقتصر الحد الأقصى ل CPS على 20000 عدد لكل جسم مضاد ذاتي ، أو أقل ، لأعلى العينات الإيجابية. من معرفتنا ، من أجل تقليل كمية الأحاديث المتقاطعة المعنية ، يجب فصل الأجسام المضادة الذاتية التي لها خلفية أقل ، عند تصميم خريطة البقعة ، بعيدا عن البقع ذات التردد العالي للعدد.
تم استخدام ضوابط إيجابية وسلبية عالية داخليا في كل فحص لحساب مؤشر دقيق للعينات غير المعروفة التي يتم اختبارها. لتقييم حساسية الفحص ومراقبتها بدقة ، تم استخدام ضوابط إيجابية منخفضة ، تم تعيينها بالقرب من الحد الأعلى للفحص. تم إنشاء هذه الضوابط الإيجابية والسلبية القياسية بكميات كبيرة وأليكوت للاستخدام على المدى الطويل وتخزينها عند -20 درجة مئوية أو أقل ، من أجل الاتساق بين المقاييس. لأغراض ضمان الجودة ، تم تشغيل العينات مرتين في كل فحص وتم إعادة تشغيل كل نتيجة إيجابية وتأكيدها عن طريق تشغيل العينة في فحص ECL جديد في اليوم التالي. إذا كان هناك أي خلاف مع الفحص التأكيدي الأول والثاني ، فمن الضروري إجراء فحص ثالث. من بين الفحوصات الثلاثة التي أجريت ، حددت نتائج الفحصين المتفقين (على سبيل المثال ، + أو + أو -,-) ، النتيجة النهائية (الإيجابية أو السلبية) للعينة.
في العقد الماضي ، تسعى العديد من مجموعات الدراسة إلى إجراء فحص عالي الإنتاجية باستخدام طريقة تعدد الإرسال لدمج اختبارات الأجسام المضادة الذاتية المتعددة معا في بئر واحد لفحص أعداد كبيرة من السكان. هناك عدد قليل من الدراسات التي تستخدم أنواعا مختلفة من التقنيات لإجراء اختبارات الأجسام المضادة الذاتية متعددة الإرسال19،20،21،22 ، ولكن لا توجد مقارنة لأي من هذه الفحوصات في الحساسية والخصوصية مقابل معيار RBA "الذهبي" الحالي ، عند دراسة T1D. لا يتم التحقق من صحة هذه الأنواع المختلفة من المنصات المستخدمة من خلال ورشة العمل الدولية لبرنامج توحيد الأجسام المضادة الذاتية للجزيرة (IASP) أو من خلال اختبار مجموعات كبيرة في التجارب السريرية. في فحص عام قائم على السكان مؤخرا في ألمانيا ، يتم استخدام فحص مشترك عالي الإنتاجية ، 3 Screen ICATM ELISA وزعته Kronus ، كأداة لفحص الخط الأول للكشف عن ثلاثة IAbs ، GADA ، IA-2A ، و ZnT8A ، لتحقيق التشخيص المبكر للطفولة T1D23. يقيس فحص ELISA المكون من 3 شاشات 3 أجسام مضادة ذاتية إما في 3 آبار منفصلة ، تستهلك كمية كبيرة من المصل ، أو في بئر واحد مع خلط جميع الفحوصات الثلاثة. إذا كان أحد البئرين في فحص ELISA المكون من 3 شاشات إيجابيا ، فلن يتمكن المرء من التمييز بين أي من الأجسام المضادة الذاتية الثلاثة موجودة. أكبر عيب في هذا الفحص هو عدم قدرته على تضمين قياس IAA. جميع نتائج IAA التي أجرتها ELISA ، كما ثبت في ورش عمل IASP ، ليس لها حساسية وخصوصية مقبولة24. عادة ما يكون IAA أول IAb يظهر ولديه معدل انتشار مرتفع بين الأطفال الصغار. يعد فحص IAb ، مع IAA ، ضروريا للأطفال ولا يعتبر من المقبول إجراء هذا الفحص بدون IAA لتقييم مخاطر T1D في المجتمع. بالإضافة إلى ذلك ، لا توجد دراسات أو بيانات منشورة تظهر أن اختبار مجموعة Kronus IAb هو أكثر تحديدا لمرض T1D وقادر على التمييز بين المخاطر العالية و IAbs منخفضة المخاطر. تم التحقق من صحة فحص 7-Plex ECL ، في هذه الدراسة ، باستخدام مجموعة كبيرة من المرضى الذين تم تشخيصهم حديثا ب T1D13. بالمقارنة مع RBA القياسي الحالي وفحص ECL الفردي الراسخ ، فإن اختبار 7-Plex قادر على الاحتفاظ بالإيجابية بنسبة 100٪ بنفس خصوصية المقايسة (الجدول 4). حاليا ، يتم تطبيق فحص 4-Plex ECL ، بالتوازي مع RBA القياسي ، على تجربة سريرية كبيرة مستمرة: دراسة فحص المناعة الذاتية للأطفال (ASK). تقوم هذه التجربة بفحص الأطفال في عموم السكان ، في منطقة دنفر الحضرية ، بحثا عن T1D ومرض الاضطرابات الهضمية. بالمقارنة مع RBA القياسي المستخدم في دراسة ASK ، فإن فحص ECL متعدد الإرسال يظهر حساسية ممتازة وخصوصية أعلى للمرض ، مطابقة لتقاريرنا السابقة باستخدام دراسة ECL واحدة25. علاوة على ذلك ، أظهر فحص 4-Plex ECL انخفاضا واضحا في العمالة والتكلفة وحجم المصل بنسبة 70٪ ، مقارنة بالمقايسات الفردية 4 المقابلة ل ECL و RBA. باستخدام فحص ECL متعدد الإرسال ، يمكننا تخصيص كل بئر بأرقام مختلفة ، تمثل أجساما مضادة ذاتية مختلفة (حتى 10) ، لاختبار أمراض المناعة الذاتية المختلفة الخاصة باحتياجات موقع سريري معين.
هناك بعض القيود التي لوحظت ، كما هو موضح في هذه الدراسة ، لفحص ECL متعدد الإرسال باستخدام لوحة الإرسال المتعدد. لا يمكن تعديل التخفيف النهائي للمصل ، المحتضن بالمستضد ، للحصول على أفضل الظروف لكل فحص للأجسام المضادة الذاتية التي يتم دمجها في بئر واحد. لوحظت تسع عينات (9/1026) ، من مرضى T1D ، أن لها نتيجة سلبية خاطئة لأجسام مضادة ذاتية معينة. 7 من السلبيات الكاذبة كانت ل TPOA و 2 كانت ل ThGA ، في فحص 7-Plex ECL ، ولكن تم عرض نتائج إيجابية عالية في كل من فحص ECL الفردي و RBA (الشكل 2 و 3). بعد مزيد من التخفيف لجميع العينات ال 9 ، أصبحت إيجابية على لوحة الإرسال المتعدد. هذه النتيجة ناتجة عما نصفه بظاهرة "البروزون". تتسبب هذه الظاهرة في إظهار العينة نتيجة سلبية خاطئة لأن عيارات الأجسام المضادة العالية تؤثر على تكوين شبكات الأجسام المضادة المستضدات. عند إعداد فحص متعدد الإرسال ، يوصى بإجراء اختبارات مسبقة لتحديد التخفيف الاختياري للمصل لحضانة المستضدات ذات العيار العالي جدا ، لكل من الأجسام المضادة الذاتية مجتمعة. بدلا من ذلك ، يجب اختيار اختبارات الأجسام المضادة الذاتية ذات الظروف المحسنة المماثلة لتشكيل فحص مشترك يتم من خلاله تحقيق أفضل حساسية وخصوصية للفحص لكل جسم مضاد ذاتي. في هذه الدراسة ، أسفرت 7 عينات (7/1022) ، من الضوابط الطبيعية الصحية ، عن إيجابيات خاطئة للأجسام المضادة الذاتية المتعددة في فحص 7-Plex ، ولكن بعد إجراء فحص ECL واحد و RBA (الشكل 2 و 3) ، تم العثور على هذه الأجسام المضادة الذاتية سلبية في كلا الاختبارين. الأسباب الكامنة وراء هذه النتائج الإيجابية الخاطئة التي تحدث على لوحة الإرسال المتعدد ، لهذه المجموعة الفرعية الصغيرة من العينات ، غير معروفة حاليا. بالنسبة للتطبيق الحالي لفحص ECL متعدد الإرسال ، يتم تكرار جميع العينات الإيجابية مع فحص ECL الفردي المقابل لها لتأكيد الإيجابية ، مما يزيل هذا الخطأ الإيجابي الخاطئ من فحص ECL متعدد الإرسال.
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
تم دعم هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة DK32083 ومنح JDRF 2-SRA-2015-51-Q-R و 2-SRA-2018-533-S-B.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
4 °C refrigerator | |||
–80 °C and -20 °C freezers | |||
96-well Plate Shaker | Wallac - Delfi | ||
96-well round bottom plate | Fisher | 8408220 | |
Acetic acid solution | Fisher | ||
Aluminum foil | |||
Antigen proteins | |||
Human GAD65 full length protein | Diamyd | ||
Human ThG full length protein | BioMart | ||
Human TPO full length protein | BioMart | ||
IA-2 intracellular domain protein | BioMart | ||
IFN-α protein | Abcam | ||
Proinsulin protein | AmideBio | ||
tTG protein | DiaRect | ||
Biotin | Sigma | ||
Bottle-Top 500 mL , Filter Units | Fisher | 0974064A or B | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A-7906 | |
Distilled deionized (DD) water | |||
HCl | Fisher | ||
Ice maker | |||
Ice trays | |||
MSD Sector | Perkin-Elmer | ||
Multi-channel pipette | |||
NaOH | |||
Paper tower | |||
PBS | |||
pH meter | |||
Pipette-Aid | |||
Pipettes/tips | |||
Ru Sulfo-NHS | MSD (R91AN) | ||
Trizma Base | Fisher | BP152-5 | |
Tween 20 | Sigma | P-1379 | |
Uplex Development Kit | MSD | ||
96-well UPlex plate | MSD | ||
Blocker A | MSD | R93AA | |
Linker-Streptavidin | MSD | ||
Read buffer | MSD | R92TC | |
Stop Solution | MSD | ||
Vortex mixer | |||
ZeBa Column | Pierce | 89892 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved