Method Article
* Bu yazarlar eşit katkıda bulunmuştur
7 otoantikor testini bir araya getiren basit bir çoklanmış ECL testi modelliyoruz. Tahlil, çölyak hastalığı, otoimmün tiroid hastalığı ve otoimmün poliglandüler sendrom 1 dahil olmak üzere T1D ve diğer birçok otoimmün hastalığı aynı anda tarayabilir.
Adacık otoantikorları (IAbs) tip 1 diyabet (T1D) tanı ve tahmininde yaygın olarak kullanılmaktadır. İnsülin (IAA), glutamat dekarboksilaz-65 (GADA), insülinoma antijeni-2 (IA-2A) ve çinko taşıyıcı-8 (ZnT8A) olmak üzere dört ana IAb, hastalık tahmininde eşit derecede önemlidir. Halen, T1D tanısı alan hastaların% 40'ına kadarı diğer otoimmün bozuklukları geliştirmeye devam etmektedir. Ne yazık ki, ölçüm için tek bir otoantikor kullanan mevcut tarama yöntemleri, büyük ölçekli tarama çalışmaları için zahmetli ve verimsizdir. Yakın zamanda bu güncel sorunları ele almak için basit bir çoklanmış elektrokemilüminesans (ECL) testi geliştirdik. Tahlil, 7 otoantikor testinin tümünü tek bir kuyuda birleştirir. Her kuyucuk üç IAb (IAA, GADA ve IA-2A), otoimmün tiroid hastalığını tespit etmek için tiroid peroksidaz (TPOA) ve tiroid globuline (ThGA) karşı otoantikorlar, çölyak hastalığı için doku transglutaminazına (TGA) otoantikorlar ve otoimmün poliglandüler sendrom-1 (APS-1) için interferon alfaya (IFN�A) otoantikorlar içerir; bunların hepsi aynı anda T1D ve diğer ilgili otoimmün hastalıkları tarar. Multipleks ECL testi, tek ECL tahlil platformuna dayanır, ancak bunun yerine, 10'a kadar çoklu otoantikor tahlillerini tek bir kuyucukta birleştiren multipleks plakayı kullanır. Tek ECL tahlilinden temel farkı, sıvı fazında oluşan her antikor-antijen kompleksinin, multipleks plaka üzerindeki bir bağlayıcı sistem aracılığıyla her bir kuyucukta belirli bir noktaya tutulmasıdır. Bu çalışmada 7-Plex ECL testi, yeni teşhis edilen T1D hastalarının büyük bir kohortu ve yaşa uygun sağlıklı kontroller kullanılarak standart radyo-bağlayıcı testlere (RBA) ve tek ECL tahlillerine karşı doğrulanmıştır ve bu da mükemmel tahlil duyarlılığı ve özgüllüğü ile sonuçlanmıştır.
Tip 1 diyabet (T1D) çocukluk çağında en sık görülen ciddi kronik bir hastalıktır. Şu anda, Amerika Birleşik Devletleri'nde yaklaşık 1,4 milyon insan T1D'ye sahiptir; Çarpıcı bir şekilde, T1D insidansı dünya çapında her yıl% 3-5 oranında istikrarlı bir şekilde artmaktadır ve son yirmi yılda, özellikle küçük çocuklarda 1,2 oranında iki katına çıkmıştır. Kan dolaşımındaki adacık otoantikorları (IAbs) şu anda en güvenilir biyobelirteçtir. IAbs, klinik T1D'nin3 gelişmesinden yıllar önce ortaya çıkabilir. Günümüzde T1D tanı ve risk taramasında insülin (IAA), glutamat dekarboksilaz-65 (GADA), insülinoma antijeni-2 (IA-2A) ve çinko taşıyıcı-8'e (ZnT8A) karşı otoantikorlar dahil olmak üzere dört ana IAb yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu dört IAb, T1D gelişiminin tahmininde eşit derecede önemlidir. T1D'nin sınıflandırılması son zamanlarda hastalık evresi 1 4 olarak normal bir glukoz metabolizmasına sahip herhangi bir 4 IAb'nin ≥2'sinin varlığı olarak yeniden tanımlanmıştır.
Gençlerde Diyabet Otoimmünite Çalışmasında (DAISY), T1D riski altındaki dört çocuktan birinin adacık, çölyak, tiroid veya romatoid otoimmüniteye ilerlemesinin muhtemel olduğu ve daha çarpıcı bir şekilde, T1D tanısı alan hastaların yaklaşık% 40'ının sonunda ek bir otoimmün durum geliştirdiği ortaya çıkmıştır 5,6,7 . Otoantikorların tanımlanması bu otoimmün hastalıkların öngörülmesi ve teşhisi için gereklidir ve hastalar için daha iyi klinik bakım sağlamalıdır. Şu anda bu çoklu otoimmün koşulları taramanın kolay ve ucuz bir yolu yoktur. Tek bir otoantikor ölçümü ile standart radyo-bağlayıcı tahlil (RBA) kullanan mevcut tarama yöntemleri, büyük ölçekli bir tarama için zahmetli ve verimsizdir.
Burada, tek bir ECL tahlil platformu 8,9,10,11 kullanarak doğruladığımız yeni geliştirilen basit çoklanmış ECL testini açıklayacağız. Multipleks ECL testi, sadece 15 μL serum kullanarak 7 otoantikor testini tek bir kuyucukta birleştirir ve çölyak hastalığı, otoimmün tiroid hastalığı ve APS-1 dahil olmak üzere T1D ve çoklu ilgili otoimmün hastalıkları aynı anda tarayabilir. Bir ZnT8A ECL testi o sırada geliştirilmemişti ve çoklanmış tahlilde yer almadı. Multipleks ECL testi, T1D ve çoklu otoimmün hastalıklar için genel popülasyon taramasında yüksek verim için mükemmel bir araç sağlar.
Araştırma protokolü Colorado Çoklu Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylandı.
1. Tampon hazırlama
2. Her antijen proteininin biyotin ve Ru Sulfo-NHS ile ayrı ayrı etiketlenmesi
NOT: Daha etkili bir etiketleme reaksiyonuna sahip olmak için, ≥0.5 mg / mL'lik bir antijen protein konsantrasyonu kullanın.
3. Tahlil için iki etiketli antijen için en iyi konsantrasyonu ve oranları tanımlayın (dama tahtası testi)
NOT: Bu 7-Plex testindeki ECL-IAA testi, serum örneklerinin asit tedavisini gerektirdiğinden, her antijen için dama tahtası testi, etiketli antijen karışımı ile inkübe edilmeden önce bu adımdan geçmelidir.
4. Karışık bağlayıcı bağlantılı antijen çözeltisini oluşturun
5. Serum örneklerini etiketli antijenle inkübe edin
NOT: Bu 7-Plex tahlilindeki ECL-IAA testi, serum örneklerinin asit muamelesini gerektirdiğinden, her serum, bu 7-Plex testi için etiketli antijen karışımı ile inkübe edilmeden önce asit tedavi adımını gerektirir.
6. Multipleks plakayı hazırlayın
7. Serum/antijen inkübatörlerini multipleks plakaya aktarın
8. Plakayı yıkayın ve okuma tamponu ekleyin
9. Plakayı okuyun ve verileri analiz edin
Tahlil sonuçlarının analizi Tablo 1, Tablo 2 ve Tablo 3'te gösterilmiştir. Okuma değerleri, aynı kuyu içindeki 10 noktadan gelen verilerden gelir. Her numune için indeks değerleri, tahlil protokolünde açıklandığı gibi karşılık gelen iç pozitif ve negatif kontrollere karşı hesaplanmıştır. Hatalı yineleme örnekleri Tablo 1'de gösterilmiştir ve Tablo 3'te son dizin hesaplama hatasına neden olmuştur. Yanlış pozitif veya yanlış negatif sonuçlardan kaçınmak için tüm ham sayım değerleri kontrol edilmelidir.
7-multipleks ECL testi, T1D'li 1026 yeni tanı konmuş hastadan alınan örneklerin büyük bir kohortu kullanılarak doğrulandı ve 1022 yaş ve cinsiyet uyumlu sağlıklı kontrol denekleri. 1026 T1D hastaları için 7-Plex ECL testinden elde edilen otoantikorların seviyeleri, Şekil 2'de gösterildiği gibi karşılık gelen tek ECL tahlillerimizin her birinden ve Şekil 3'te gösterildiği gibi karşılık gelen her bir standart RBA ve ELISA'dan alınan seviyelerle karşılaştırılmıştır. Tahlil özgüllükleri, tiroid otoantikorları (95. persentilin kullanıldığı yerlerde) dışındaki tüm otoantikor tahlilleri için 99. persentillerde, Tablo 4'te listelenen üç tahlil yönteminin (7-Plex ECL, tek ECL, RBA veya ELISA) 1022 sağlıklı kontrolünün aynısı olarak ayarlanmıştır. GADA, IA-2A, IAA, TPOA, ThGA, TGA ve IFN�A'nın tahliller arası özgeçmişleri sırasıyla %6.4, %4.5, %9.1, %4.9, %5.7, %11.3 ve %5.9'dur.
7 otoantikorun her biri için az sayıda uyumsuz örnek, her tahlil için kesiklerin sınır çizgisi etrafında bulundu (Şekil 2 ve Şekil 3). On bir kontrol örneğinde (11/1022, %1.1) sadece 7-Plex testinde çoklu otoantikor pozitif, karşılık gelen her bir testte negatif bulundu. Benzer şekilde, T1D hastalarının 9 örneğinde de görüldü (9/1026,% 0.9). Ek olarak, 7-Plex testinde hem de RBA'da görülen hasta kohortunda 10 yüksek pozitif TPOA ve bir ThGA kaçırıldı. Bu örnekler, daha fazla seyreltildiğinde 7-Plex testinde pozitif olarak dönüştürüldü. Genel olarak, tek ECL tahlilinde veya RBA'da pozitifliğin% 100'ü, Tablo 4'te gösterildiği gibi aynı tahlil özgüllüğü ile 7-Plex ECL testinde ele alınmıştır.
Resim 1: Mutiplex ECL testinin çizimi.
Serumdaki otoantikorlar Ru Sulfo-NHSged antijenini biyotinile antijene bağlayacaktır. Bu, bir antijen-antikor-antijen-bağlayıcı kompleksi oluşturmak için spesifik bir bağlayıcı ile birleştirilir. Kompleksler plakaya yakalanır ve her bir özel bağlayıcı aracılığıyla belirli noktalarına kadar tutulur. 7 farklı antijen proteini için özel olarak bağlanmış bağlayıcı sayıları gösterilmiştir. Antikor sinyallerinin tespiti, elektrokemilüminesanslı Ru Sulfo-NHS etiketli antijenler kullanılarak gerçekleştirilir. Şekil Gu, Y. ve ark.13'tendir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: T1D'li 1026 yeni başlangıçlı hastada 7 otoantikor düzeyinin tek EKL testi ile 7-Plex EKL testi arasında karşılaştırılması.
A, b, c, d, e, f ve g panelleri sırasıyla GADA, IA-2A, IAA, TGA, TPOA, ThGA ve IFNαA için otoantikor seviyelerinin karşılaştırmalarını gösterir. Noktalı çizgiler, her otoantikor testi için tahlil kesiklerini temsil eder. Kesikler, Tablo4'te gösterildiği gibi, her bir tahlil için 1022 yaş uyumlu sağlıklı kontrolün 99. yüzdelik dilimine (95. yüzdelik dilime ayarlanmış TPOA ve ThGA hariç), hem tek hem de multipleks ECL testleri için 1022 yaş eşleştirilmiş sağlıklı kontrollerden ayarlanmıştır. Kırmızı kapalı elmaslar, incelenen kohortun% <1'i olan 7-Plex ECL testinde 'yanlış' pozitifler olarak işaretlenmiştir ve hem tek ECL hem de RBA'da negatif olarak doğrulanmıştır. Kırmızı yakın kareler, 'prozon' fenomeninin neden olduğu 7-Plex ECL testinde, esas olarak incelenen kohortun% <1'inde TPOA testinde meydana gelen 'yanlış' negatifler olarak işaretlenmiştir. Bu yanlış pozitif ve yanlış negatif sonuçların her ikisi de tartışma bölümünde tartışılmaktadır. Şekil Gu, Y. ve ark.13'tendir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: T1D'li 1026 yeni başlangıçlı hastada RBA (IFNαA için ELISA) ve 7-Plex ECL testi arasında 7 otoantikor seviyesinin karşılaştırılması.
Panel a, b, c, d, e, f ve g sırasıyla GADA, IA-2A, IAA, TGA, TPOA, ThGA ve IFNαA için otoantikor düzeylerinin karşılaştırmalarını sunar. Noktalı çizgiler, her otoantikor testi için tahlil kesiklerini, hem RBA hem de 7-Plex ECL testi için ayarlanan aynı özgüllüğü, Tablo 4'te gösterildiği gibi, 1022 yaş uyumlu sağlıklı kontrollerden temsil eder. Kırmızı kapalı elmaslar ve kareler, 7-Plex ECL testinde görünen 'yanlış' pozitifleri ve 'yanlış' negatifleri temsil eder, aynısı Şekil 2'de gösterilmiştir. Şekil Gu, Y. ve ark.13'tendir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | ||
A | 5580 | 5674 | 105 | 117 | 125 | 139 | bağlayıcı-1 |
100 | 108 | 102 | 102 | 3956 | 3745 | bağlayıcı-2 | |
115 | 124 | 107 | 116 | 113 | 124 | bağlayıcı-3 | |
67 | 64 | 68 | 61 | 65 | 69 | bağlayıcı-4 | |
89 | 87 | 98 | 92 | 90 | 80 | bağlayıcı-5 | |
87 | 71 | 89 | 87 | 61 | 72 | bağlayıcı-6 | |
94 | 82 | 79 | 85 | 2154 | 2280 | bağlayıcı-7 | |
75 | 66 | 1628 | 1594 | 81 | 83 | bağlayıcı-8 | |
98 | 103 | 71 | 84 | 69 | 85 | bağlayıcı-9 | |
102 | 118 | 93 | 98 | 113 | 99 | bağlayıcı-10 | |
B | 324 | 337 | 147 | 148 | 5426 | 5366 | bağlayıcı-1 |
101 | 102 | 93 | 88 | 86 | 74 | bağlayıcı-2 | |
111 | 119 | 119 | 123 | 66 | 72 | bağlayıcı-3 | |
72 | 65 | 59 | 68 | 74 | 67 | bağlayıcı-4 | |
81 | 98 | 83 | 92 | 79 | 72 | bağlayıcı-5 | |
90 | 84 | 93 | 86 | 70 | 76 | bağlayıcı-6 | |
101 | 105 | 101 | 97 | 956 | 944 | bağlayıcı-7 | |
82 | 83 | 189 | 204 | 97 | 90 | bağlayıcı-8 | |
92 | 83 | 78 | 64 | 82 | 78 | bağlayıcı-9 | |
83 | 79 | 88 | 93 | 4722 | 4965 | bağlayıcı-10 | |
C | 110 | 110 | 87 | 81 | 2114 | 2365 | bağlayıcı-1 |
5526 | 5680 | 88 | 70 | 86 | 93 | bağlayıcı-2 | |
114 | 132 | 67 | 71 | 3326 | 3284 | bağlayıcı-3 | |
64 | 62 | 88 | 74 | 64 | 80 | bağlayıcı-4 | |
94 | 82 | 86 | 75 | 89 | 76 | bağlayıcı-5 | |
77 | 87 | 75 | 63 | 70 | 86 | bağlayıcı-6 | |
77 | 86 | 71 | 84 | 138 | 121 | bağlayıcı-7 | |
73 | 86 | 80 | 79 | 59 | 73 | bağlayıcı-8 | |
86 | 74 | 5064 | 4923 | 88 | 86 | bağlayıcı-9 | |
105 | 113 | 85 | 80 | 124 | 114 | bağlayıcı-10 | |
D | 98 | 88 | 92 | 84 | 136 | 127 | bağlayıcı-1 |
288 | 291 | 86 | 86 | 558 | 564 | bağlayıcı-2 | |
109 | 101 | 74 | 73 | 141 | 127 | bağlayıcı-3 | |
78 | 66 | 66 | 55 | 74 | 66 | bağlayıcı-4 | |
79 | 83 | 79 | 86 | 96 | 91 | bağlayıcı-5 | |
83 | 86 | 96 | 89 | 86 | 73 | bağlayıcı-6 | |
87 | 89 | 77 | 87 | 841 | 855 | bağlayıcı-7 | |
74 | 72 | 60 | 72 | 90 | 95 | bağlayıcı-8 | |
68 | 75 | 331 | 328 | 2460 | 2580 | bağlayıcı-9 | |
86 | 98 | 80 | 75 | 123 | 133 | bağlayıcı-10 | |
E | 101 | 114 | 101 | 106 | 532 | 548 | bağlayıcı-1 |
101 | 96 | 110 | 104 | 682 | 675 | bağlayıcı-2 | |
6015 | 5988 | 124 | 126 | 101 | 98 | bağlayıcı-3 | |
66 | 71 | 82 | 71 | 80 | 62 | bağlayıcı-4 | |
102 | 97 | 99 | 80 | 83 | 110 | bağlayıcı-5 | |
82 | 67 | 81 | 80 | 60 | 85 | bağlayıcı-6 | |
85 | 95 | 52 | 84 | 245 | 221 | bağlayıcı-7 | |
72 | 78 | 82 | 74 | 486 | 503 | bağlayıcı-8 | |
77 | 97 | 97 | 77 | 56 | 66 | bağlayıcı-9 | |
114 | 104 | 5726 | 5814 | 259 | 253 | bağlayıcı-10 | |
F | 119 | 120 | 133 | 118 | 112 | 96 | bağlayıcı-1 |
101 | 91 | 100 | 95 | 96 | 82 | bağlayıcı-2 | |
406 | 395 | 111 | 123 | 2127 | 101 | bağlayıcı-3 | |
72 | 60 | 86 | 72 | 79 | 83 | bağlayıcı-4 | |
76 | 85 | 96 | 99 | 89 | 103 | bağlayıcı-5 | |
88 | 78 | 91 | 83 | 89 | 95 | bağlayıcı-6 | |
104 | 97 | 87 | 102 | 56 | 66 | bağlayıcı-7 | |
76 | 77 | 79 | 93 | 69 | 75 | bağlayıcı-8 | |
85 | 71 | 95 | 100 | 83 | 71 | bağlayıcı-9 | |
131 | 131 | 358 | 364 | 92 | 86 | bağlayıcı-10 | |
G | 90 | 95 | 85 | 82 | 105 | 107 | bağlayıcı-1 |
99 | 86 | 77 | 76 | 1250 | 1174 | bağlayıcı-2 | |
119 | 123 | 120 | 118 | 112 | 108 | bağlayıcı-3 | |
76 | 83 | 77 | 80 | 86 | 76 | bağlayıcı-4 | |
88 | 86 | 86 | 93 | 107 | 92 | bağlayıcı-5 | |
73 | 73 | 71 | 82 | 84 | 75 | bağlayıcı-6 | |
5210 | 5173 | 72 | 69 | 76 | 85 | bağlayıcı-7 | |
80 | 81 | 79 | 82 | 100 | 101 | bağlayıcı-8 | |
96 | 97 | 89 | 83 | 65 | 83 | bağlayıcı-9 | |
98 | 103 | 86 | 88 | 1933 | 1979 | bağlayıcı-10 | |
H | 114 | 124 | 81 | 86 | 299 | 295 | bağlayıcı-1 |
107 | 92 | 69 | 72 | 4256 | 4388 | bağlayıcı-2 | |
114 | 123 | 125 | 129 | 501 | 536 | bağlayıcı-3 | |
77 | 70 | 67 | 64 | 74 | 62 | bağlayıcı-4 | |
92 | 110 | 81 | 84 | 77 | 71 | bağlayıcı-5 | |
87 | 79 | 72 | 76 | 83 | 81 | bağlayıcı-6 | |
328 | 341 | 84 | 80 | 88 | 97 | bağlayıcı-7 | |
75 | 84 | 75 | 90 | 74 | 83 | bağlayıcı-8 | |
73 | 79 | 78 | 76 | 84 | 70 | bağlayıcı-9 | |
113 | 120 | 81 | 76 | 2372 | 2350 | bağlayıcı-10 |
Tablo 1: 7-plex ECL testinin analizi: ham CPS sayıları (plakanın sol yarısı). Ham CPS sayımları bir tahlil plakasından (plakanın sol yarısı) elde edilir ve her numune çift olarak gerçekleştirilir. Plakanın her satırının (A-H) altında, aynı kuyucuk içindeki 10 noktadan gelen verileri temsil eden ve işaretlenmiş her bağlayıcı numarasına karşılık gelen 10 satır okuma değeri vardır. Hatalı yineleme örnekleri, satır F-bağlayıcı 3-sütun 5 ve 6'da görüldüğü gibi gri renkle vurgulanır.
Tablo 1A Satırı | Tablo 1A Sütunu | bağlayıcı 1 | bağlayıcı 2 | bağlayıcı 3 | bağlayıcı 7 | bağlayıcı 8 | bağlayıcı 9 | bağlayıcı 10 | |
A | 1-2 | GADA PC | 5627 | 104 | 120 | 88 | 71 | 101 | 110 |
B | 1-2 | GADA Düşük PC | 331 | 102 | 115 | 103 | 83 | 88 | 81 |
C | 1-2 | TPOA Bilgisayar | 110 | 5603 | 123 | 82 | 80 | 80 | 109 |
D | 1-2 | TPOA Düşük PC | 93 | 290 | 105 | 88 | 73 | 72 | 92 |
E | 1-2 | TGA Bilgisayar | 108 | 99 | 6002 | 90 | 75 | 87 | 109 |
F | 1-2 | TG Düşük PC | 120 | 96 | 401 | 101 | 77 | 78 | 131 |
G | 1-2 | ThGA Bilgisayar | 93 | 93 | 121 | 5192 | 81 | 97 | 101 |
H | 1-2 | ThGA Düşük PC | 119 | 100 | 119 | 335 | 80 | 76 | 117 |
A | 3-4 | IAA Bilgisayar | 111 | 102 | 112 | 82 | 1611 | 78 | 96 |
B | 3-4 | IAA Düşük PC | 148 | 91 | 121 | 99 | 197 | 71 | 91 |
C | 3-4 | IFNaA Bilgisayar | 84 | 79 | 69 | 78 | 80 | 4994 | 83 |
D | 3-4 | IFNaA Düşük PC | 88 | 86 | 74 | 82 | 66 | 330 | 78 |
E | 3-4 | IA-2A Bilgisayar | 104 | 107 | 125 | 68 | 78 | 87 | 5770 |
F | 3-4 | IA-2A Düşük PC | 126 | 98 | 117 | 95 | 86 | 98 | 361 |
G | 3-4 | NC | 84 | 77 | 119 | 71 | 81 | 86 | 87 |
H | 3-4 | NC | 84 | 71 | 127 | 82 | 78 | 77 | 79 |
A | 5-6 | örnek1 | 132 | 3851 | 119 | 2217 | 82 | 77 | 106 |
B | 5-6 | örnek2 | 5396 | 80 | 69 | 950 | 94 | 80 | 4844 |
C | 5-6 | örnek3 | 2240 | 90 | 3305 | 130 | 66 | 87 | 119 |
D | 5-6 | örnek4 | 132 | 561 | 134 | 848 | 93 | 2520 | 128 |
E | 5-6 | örnek5 | 540 | 679 | 100 | 233 | 495 | 61 | 256 |
F | 5-6 | örnek6 | 104 | 89 | 1114 | 61 | 72 | 77 | 89 |
G | 5-6 | örnek7 | 106 | 1212 | 110 | 81 | 101 | 74 | 1957 |
H | 5-6 | örnek8 | 297 | 4322 | 519 | 93 | 79 | 77 | 2361 |
Tablo 2: 7-plex ECL testinin analizi: 7 bağlayıcı olarak işaretlenmiş Tablo 1 verilerinin düzenlenmesi. Tablo 1'deki veriler yeniden düzenlendi, 4 ile 6 arasındaki bağlayıcılar (kullanılmadı) silindi ve Tablo 1'deki her yinelenen okumadan ortalama değerler hesaplandı. Belirli bir bağlayıcı tarafından kısıtlanan her otoantikor testine karşılık gelen dahili standart yüksek ve düşük pozitif kontrollerin değerleri koyu renklidir. PC, pozitif kontrol. NC, normal kontrol.
GAD-İndeks | TPOA-İndeks | TGA-İndeks | ThGA-İndeksi | IAA-Endeksi | IFNaA-Endeksi | IA-2A-İndeksi | |
GADA PC | 1.000 | 0.005 | 0.000 | 0.003 | -0.006 | 0.003 | 0.004 |
GADA Düşük PC | 0.045 | 0.005 | -0.001 | 0.006 | 0.002 | 0.000 | -0.001 |
IAA Bilgisayar | 0.005 | 1.000 | 0.001 | 0.002 | -0.001 | -0.001 | 0.004 |
IAA Düşük PC | 0.002 | 0.039 | -0.002 | 0.003 | -0.005 | -0.003 | 0.001 |
IA-2A Bilgisayar | 0.004 | 0.004 | 1.000 | 0.004 | -0.004 | 0.000 | 0.004 |
IA-2A Düşük PC | 0.007 | 0.004 | 0.048 | 0.006 | -0.002 | -0.002 | 0.008 |
TGA Bilgisayar | 0.002 | 0.003 | 0.000 | 1.000 | 0.000 | 0.002 | 0.002 |
TG Düşük PC | 0.006 | 0.004 | 0.000 | 0.052 | -0.001 | -0.002 | 0.005 |
TPOA Bilgisayar | 0.005 | 0.005 | -0.001 | 0.002 | 1.000 | -0.002 | 0.001 |
TPOA Düşük PC | 0.012 | 0.003 | 0.000 | 0.006 | 0.076 | -0.003 | 0.001 |
ThGA Bilgisayar | 0.000 | 0.000 | -0.008 | 0.001 | 0.000 | 1.000 | -0.001 |
ThGA Düşük PC | 0.001 | 0.002 | -0.008 | 0.002 | -0.009 | 0.050 | -0.002 |
IFNaA Bilgisayar | 0.004 | 0.006 | 0.001 | 0.000 | -0.002 | 0.000 | 1.000 |
IFNaA Düşük PC | 0.008 | 0.004 | 0.000 | 0.005 | 0.004 | 0.002 | 0.048 |
NC | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
NC | 0.000 | -0.001 | 0.001 | 0.002 | -0.002 | -0.002 | -0.001 |
örnek1 | 0.009 | 0.683 | 0.000 | 0.419 | 0.001 | -0.002 | 0.003 |
örnek2 | 0.958 | 0.001 | -0.008 | 0.172 | 0.009 | -0.001 | 0.837 |
örnek3 | 0.389 | 0.002 | 0.542 | 0.012 | -0.009 | 0.000 | 0.006 |
örnek4 | 0.009 | 0.088 | 0.003 | 0.152 | 0.008 | 0.496 | 0.007 |
örnek5 | 0.082 | 0.109 | -0.003 | 0.032 | 0.271 | -0.005 | 0.030 |
örnek6 | 0.004 | 0.002 | 0.169 | -0.002 | -0.006 | -0.002 | 0.000 |
örnek7 | 0.004 | 0.205 | -0.002 | 0.002 | 0.013 | -0.002 | 0.329 |
örnek8 | 0.039 | 0.768 | 0.068 | 0.004 | -0.001 | -0.002 | 0.400 |
Tablo 3: 7-plex ECL testinin analizi: indeks değerlerinin sonuçları. 7 otoantikor testinin tümü için her numunenin indeks değerleri, tahlil protokolünde açıklandığı gibi karşılık gelen iç pozitif ve negatif kontrollere karşı hesaplanmıştır. Kesme değerinden daha büyük olan herhangi bir endeks değeri, koyu kalın olarak gösterilen pozitif bir sonuç olarak tanımlanmıştır. Örnek6'nın TGA dizini değeri, Tablo 1'deki satır F-bağlayıcı 3-sütun 5 ve 6'da gösterilen hatalı yinelemelerin neden olduğu bir hata olduğu için gri renkle vurgulanmıştır.
cesaret | IA-2A | IAA | .TGA | TPOA | ThGA | IFNαA* | ||||||||
Şili | Spec | Şili | Spec | Şili | Spec | Şili | Spec | Şili | Spec | Şili | Spec | Şili | Spec | |
RBA (Mali İşler T | 73.4% | 98.5% | 75.2% | 99.0% | 47.7% | 99.1% | 12.9% | 99.0% | 23.9% | 95.2% | 19.3% | 94.7% | 1.0% | 99.6% |
Tek ECL | 71.6% | 99.1% | 73.6% | 99.3% | 48.3% | 99.7% | 16.0% | 98.9% | 26.3% | 94.9% | 20.6% | 95.1% | 0.8% | 99.2% |
7-Plex ECL | 71.2% | 98.9% | 77.3% | 98.9% | 49.5% | 98.9% | 16.5% | 98.7% | 26.1% | 94.7% | 21.1% | 94.7% | 1.7% | 99.1% |
Tablo 4: 1026 T1D hastası ve 1022 kontrol arasında, 7 pleks ECL testinde, karşılık gelen tek EKL testi ve RBA veya ELISA* ile karşılaştırıldığında, hem yaş hem de cinsiyet için eşleştirilen tahlil duyarlılığı ve özgüllüğü. Her otoantikoriçin farklı tahliller (RBA, tek ECL ve 7-Plex ECL), 1022 yaş ve cinsiyet uyumlu sağlıklı kontroller kullanılarak benzer özgüllüklere ayarlandı. İncelenen kontrol kohortunun özgüllük sonucu, TPOA ve ThGA için% 95 civarında ve diğer 5 tahlil için% 99 olarak belirlenmiştir. *Yıldız işareti, ELISA için IFNαA testini işaretlerken, diğerleri RBA'dır.
Tip 1 diyabet için çok sayıda ulusal ve uluslararası klinik çalışmada, çölyak hastalığı için adacık otoantikorlarını ve transglutaminaza (TGA) otoantikorlarını tespit etmek için tek ECL testinin performansı 8,9,10,11 olarak kanıtlanmıştır. Bu izler boyunca, bu tahlil, mevcut 'altın' standart RBA'ya göre değerlendirildiğinde otoantijen tespiti için duyarlılığı ve özgüllüğü arttırmıştır. Geliştirilmiş hastalık özgüllüğü, tek ECL testi ile RBA14,15,16,17 arasında, düşük riskli, düşük afiniteli sinyallerden yüksek afiniteli ve yüksek riskli adacık otoantikorları ayırt edildiğinde görülebilir. Tek ECL testine dayanarak, T1D'nin yanı sıra aynı anda uygulanabilir birkaç otoimmün hastalığı taramamızı sağlamak için yeni bir yüksek verimli çoklanmış ECL otoantikor testi sunuyoruz.
Multipleks ECL testi, 10 adede kadar otoantikor testini tek bir kuyucukta birleştirebilen multipleks plakayı kullanır. Bu çalışmada 7 otoantikor testi bir araya getirilmiştir. Otoantikorlar 3 IAbs (IAA, GADA ve IA-2A), 2 otoimmün tiroid hastalığı otoantikorları (TPOA ve ThGA), çölyak hastalığı otoantikorları (TGA) ve interferon alfaya (IFNαA) karşı APS-1 otoantikorlarından oluşur. Tahlil mekanizması, genel olarak, daha önce yayınlanmışolan 9,10,12,18 gibi bazı değişikliklerle tek bir ECL testine dayanmaktadır. Multipleks ECL testinin tek bir ECL tahlilinden temel farkı, sıvı fazında oluşan her bir antikor-antijen kompleksinin spesifik bir bağlayıcıya kısıtlanmasıdır (Şekil 1). Biyotin etiketli antijen, spesifik bir antijen-bağlayıcı kompleksi oluşturmak için kullanılan bir bağlayıcı olan Streptavidin konjuge ile inkübe edilir. Antikor-antijen immün kompleksi, hasta serumu ile inkübasyondan sonra oluşur ve multipleks plakanın her bir kuyucuğundaki spesifik bağlayıcı sistem aracılığıyla belirli bir noktaya yakalanır. Aynı zamanda antikorlar tarafından yakalanan Ru Sulfo-NHS etiketli antijen, elektrokemilüminesans ile sinyal sağlar. Plaka okuyucu makinesi, her bir kuyuda bulunan nokta kaynaklarından 10 adede kadar farklı sinyal algılayabilir. Otoantikor tahlillerini plakalar arasında tutarlı tutmak için ve uzun süreli çalışmalar yürütürken, aynı bağlayıcının kullanılmasını öneriyoruz.
Bir multipleks ECL testi yapmadan önce, her otoantikor için tek ECL tahlillerinin sırasıyla bir multipleks plaka üzerinde optimize edilmesi ve normal bir ECL plakasında hem RBA hem de tek ECL tahlillerine karşı doğrulanması gerekir. Dama tahtası testini arttırmak için, multipleks plaka üzerindeki ilgili otoantikor tahliline, yüksek pozitif hasta ve negatif hasta örneği kullanıldı. Dama tahtası testi yapıldıktan sonra, Ru Sulfo-NHS için en ideal konsantrasyonlar ve 7 otoantikor testinin her biri için hesaplanan biyotin etiketli antijen. Aşağıdaki konsantrasyonlar bu konsantrasyonları göstermektedir: GAD65 için 30 ng/mL ve 200 ng/mL, proinsülin için 120 ng/mL ve 120 ng/mL, IA-2 için 10 ng/mL ve 42 ng/mL, TG için 80 ng/mL ve 80 ng/mL, TPO için 8 ng/mL ve 16 ng/mL, ThG için 31 ng/mL ve 31 ng/mL, ve IFNα 13 için sırasıyla 12 ng / mL ve12 ng / mL. Dama tahtası tahlilinden bazı antijenlerin konsantrasyonlarının, tüm tahlilleri bir araya getirdikten sonra gerçek multipleks testindeki sonuçlara göre daha da ayarlanması gerekebilir.
IAA mevcut multipleks ECL testine dahil edildiğinden, önceki çalışmada bildirildiği gibi serum antijen ile inkübe edilmeden önce serum örneklerinin asit tedavisi zorunludur12. Genel olarak, bir multipleks testine ekstra bir otoantikor eklendiğinde, tahlil arka planı etkilenir ve kuyudaki bir noktadan gelen son derece yüksek bir sinyal, çapraz konuşma yoluyla yakındaki noktaların sonuçlarını engelleyebilir. Bu nedenle, maksimum CPS'nin her bir otoantikor için 20.000 sayımla veya en yüksek pozitif numuneler için daha düşük sayımla sınırlandırılması gerekir. Bildiğimiz kadarıyla, ilgili çapraz konuşma miktarını azaltmak için, nokta haritasını tasarlarken, daha yüksek sayım sıklığına sahip noktalardan uzak, daha düşük bir arka plana sahip otoantikorlar ayrılmalıdır.
Test edilen bilinmeyen numuneler için doğru bir indeks hesaplamak için her tahlilde dahili olarak yüksek pozitifler ve negatif kontroller kullanılmıştır. Tahlilin duyarlılığını doğru bir şekilde değerlendirmek ve izlemek için, tahlilin üst sınırına yakın ayarlanmış düşük pozitif kontroller kullanılmıştır. Bu standart pozitif ve negatif kontroller, uzun süreli kullanım için toplu ve aliquot olarak oluşturulmuş ve tahliller arasındaki tutarlılık için -20 °C veya altında saklanmıştır. Kalite güvencesi amacıyla, numuneler her tahlilde iki kez çalıştırıldı ve her olumlu sonuç tekrar çalıştırıldı ve numune ertesi gün yeni bir ECL tahlilinde çalıştırılarak doğrulandı. Birinci ve ikinci doğrulayıcı tahlil ile herhangi bir anlaşmazlık varsa, üçüncü bir tahlil gerekliydi. Yapılan üç tahlilden, aynı fikirde olan iki tahlilin sonuçları (örneğin, +, + veya -,-), numunenin nihai sonucunu (pozitif veya negatif) belirledi.
Son on yılda, birçok çalışma grubu, büyük popülasyonları taramak için çoklu otoantikor tahlillerini tek bir kuyuda birleştirmek için multipleks yöntemini kullanarak yüksek verimli bir tahlil aramaktadır. Multipleks otoantikor tahlilleri 19,20,21,22 yapmak için farklı teknolojiler kullanan birkaç çalışma vardır, ancak T1D'yi incelerken mevcut 'altın' standart RBA'ya karşı duyarlılık ve özgüllük açısından bu testlerin hiçbiri için bir karşılaştırma yoktur. Kullanılan bu farklı platform türleri, uluslararası Islet Autoantibody Standardizasyon Programı (IASP) çalıştayı veya klinik çalışmalarda büyük kohortların test edilmesi yoluyla doğrulanmamıştır. Almanya'da yakın zamanda yapılan genel popülasyon tabanlı bir taramada, Kronus tarafından dağıtılan yüksek verimli kombine bir tahlil, 3 Ekran ICATM ELISA, çocukluk T1D23'ün erken teşhisini sağlamak için üç IAb, GADA, IA-2A ve ZnT8A'yı tespit etmek için birinci basamak tarama aracı olarak kullanılmaktadır. 3 Ekranlı ELISA testi, 3 ayrı kuyuda, büyük miktarda serum tüketen veya 3 tahlilin hepsinin karıştırıldığı tek bir kuyucukta 3 otoantikoru ölçer. 3 Ekranlı ELISA testinde bir kuyu pozitifse, üç otoantikordan hangisinin mevcut olduğunu ayırt edemez. Bu tahlilin en büyük dezavantajı IAA ölçümünü dahil edememesidir. ELISA tarafından gerçekleştirilen tüm IAA sonuçları, IASP atölyelerinde kanıtlandığı gibi, kabul edilebilir bir duyarlılığa ve özgüllüğe sahip değildir24. IAA genellikle ortaya çıkan ilk IAb'dir ve küçük çocuklar arasında yüksek prevalansı vardır. IAA ile IAb taraması çocuklar için gereklidir ve toplumdaki T1D riskini değerlendirmek için IAA olmadan bu taramanın yapılması kabul edilemez. Ek olarak, Kronus IAb kit testinin daha T1D hastalığına özgü olduğunu ve yüksek riski düşük riskli IAb'lerden ayırt edebildiğini gösteren yayınlanmış bir çalışma veya veri yoktur. Bu çalışmada 7-Plex ECL testi, T1D13'lü yeni tanı konmuş hastaların büyük bir kohortu kullanılarak doğrulandı. Mevcut standart RBA ve köklü tek ECL testi ile karşılaştırıldığında, 7-Plex testi aynı tahlil özgüllüğü ile% 100 pozitifliği koruyabilir (Tablo 4). Şu anda, standart RBA'ya paralel olarak 4-Plex ECL testi, devam eden büyük bir klinik araştırmaya uygulanmaktadır: Çocuklar için Otoimmünite Taraması (ASK) çalışması. Bu çalışma, Denver metropol bölgesinin genel popülasyonundaki çocukları T1D ve çölyak hastalığı açısından taramaktadır. ASK çalışmasında kullanılan standart RBA ile karşılaştırıldığında, multipleks ECL testi, tek ECL çalışması25'i kullanan önceki raporlarımızla aynı olan mükemmel duyarlılık ve daha yüksek bir hastalık özgüllüğü göstermektedir. Ayrıca, 4-Plex ECL tahlilimiz, ECL ve RBA için karşılık gelen 4 tek tahlille karşılaştırıldığında, işçilik, maliyet ve serum hacminde% 70 oranında belirgin bir azalma olduğunu göstermiştir. Çoklanmış ECL testini kullanarak, belirli bir klinik konumun ihtiyaçlarına özgü farklı otoimmün hastalıkları test etmek için her bir kuyuyu farklı otoantikorları (10'a kadar) temsil eden farklı sayılarla özelleştirebiliriz.
Bu çalışmada, multipleks plakayı kullanan çoklanmış bir ECL testi için gözlemlenen bazı sınırlamalar vardır. Antijenle inkübe edilen serumun son seyreltilmesi, tek bir kuyuda birleştirilen her bir otoantikor testi için en uygun koşulları sağlayacak şekilde ayarlanamaz. T1D hastalarından alınan dokuz numunenin (9/1026), belirli otoantikorlar için yanlış negatif bir sonuca sahip olduğu gözlendi. Yanlış negatiflerin 7'si TPOA ve 2'si 7-Plex ECL testinde ThGA içindi, ancak hem tek ECL testinde hem de RBA'da yüksek pozitif sonuçlar sergilendi (Şekil 2 ve 3). 9 numunenin tümünün daha fazla seyreltilmesinden sonra, multipleks plakada pozitif hale geldiler. Bu sonuç, 'prozon' fenomeni olarak tanımladığımız şeyden kaynaklanır. Bu fenomen, numunenin yanlış bir negatif sonuç göstermesine neden olur, çünkü yüksek antikor titreleri antijen-antikor kafeslerinin oluşumunu etkiler. Multipleks bir test hazırlarken, kombine otoantikorların her biri için çok yüksek titrelere sahip numunelerin, antijen inkübasyonu için serumun isteğe bağlı seyreltilmesini tanımlamak için ön testlerin yapılması önerilir. Alternatif olarak, benzer optimize edilmiş koşullara sahip otoantikor testleri, her otoantikor için en iyi tahlil duyarlılığının ve özgüllüğünün elde edildiği kombine bir tahlil oluşturmak üzere seçilmelidir. Bu çalışmada, sağlıklı normal kontrollerden 7 örnek (7/1022), 7-Plex testinde çoklu otoantikorlar için yanlış pozitiflerle sonuçlandı, ancak tek bir ECL testi ve RBA (Şekil 2 ve 3) çalıştırıldıktan sonra bu otoantikorların her iki tahlilde de negatif olduğu bulundu. Bu küçük numune alt kümesi için multipleks plakada meydana gelen bu yanlış pozitif sonuçların arkasındaki nedenler şu anda bilinmemektedir. Multipleks ECL testinin mevcut uygulaması için, pozitifliği doğrulamak için tüm pozitif numuneler, bu yanlış pozitif hatayı multipleks ECL testinden kaldıran karşılık gelen tek ECL testi ile tekrarlanır.
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Bu çalışma NIH hibe DK32083, JDRF Hibeleri 2-SRA-2015-51-Q-R ve 2-SRA-2018-533-S-B tarafından desteklenmiştir.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
4 °C refrigerator | |||
–80 °C and -20 °C freezers | |||
96-well Plate Shaker | Wallac - Delfi | ||
96-well round bottom plate | Fisher | 8408220 | |
Acetic acid solution | Fisher | ||
Aluminum foil | |||
Antigen proteins | |||
Human GAD65 full length protein | Diamyd | ||
Human ThG full length protein | BioMart | ||
Human TPO full length protein | BioMart | ||
IA-2 intracellular domain protein | BioMart | ||
IFN-α protein | Abcam | ||
Proinsulin protein | AmideBio | ||
tTG protein | DiaRect | ||
Biotin | Sigma | ||
Bottle-Top 500 mL , Filter Units | Fisher | 0974064A or B | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A-7906 | |
Distilled deionized (DD) water | |||
HCl | Fisher | ||
Ice maker | |||
Ice trays | |||
MSD Sector | Perkin-Elmer | ||
Multi-channel pipette | |||
NaOH | |||
Paper tower | |||
PBS | |||
pH meter | |||
Pipette-Aid | |||
Pipettes/tips | |||
Ru Sulfo-NHS | MSD (R91AN) | ||
Trizma Base | Fisher | BP152-5 | |
Tween 20 | Sigma | P-1379 | |
Uplex Development Kit | MSD | ||
96-well UPlex plate | MSD | ||
Blocker A | MSD | R93AA | |
Linker-Streptavidin | MSD | ||
Read buffer | MSD | R92TC | |
Stop Solution | MSD | ||
Vortex mixer | |||
ZeBa Column | Pierce | 89892 |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır