Method Article
* Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen
Wir modellieren einen einfachen Multiplex-ECL-Assay, der 7 Autoantikörper-Assays miteinander kombiniert. Der Test ist in der Lage, gleichzeitig auf T1D und mehrere andere Autoimmunerkrankungen zu untersuchen, einschließlich Zöliakie, Autoimmunerkrankungen der Schilddrüse und autoimmunes polyglanduläres Syndrom 1.
Inselautoantikörper (IAbs) werden häufig bei der Diagnose und Vorhersage von Typ-1-Diabetes (T1D) eingesetzt. Vier wichtige IAbs zu Insulin (IAA), Glutamat-Decarboxylase-65 (GADA), Insulinom-Antigen-2 (IA-2A) und Zinktransporter-8 (ZnT8A) sind bei der Krankheitsvorhersage gleichermaßen wichtig. Derzeit entwickeln bis zu 40% der Patienten, bei denen T1D diagnostiziert wurde, andere Autoimmunerkrankungen. Leider sind aktuelle Screening-Methoden, die einen einzigen Autoantikörper zur Messung verwenden, für groß angelegte Screening-Studien mühsam und ineffizient. Wir haben kürzlich einen einfachen Multiplex-Elektrochemilumineszenz-Assay (ECL) entwickelt, um diese aktuellen Probleme anzugehen. Der Assay kombiniert alle 7 Autoantikörpertests in einer Vertiefung. Jede Vertiefung enthält drei IAbs (IAA, GADA und IA-2A), Autoantikörper gegen Schilddrüsenperoxidase (TPOA) und Schilddrüsenglobulin (ThGA) zum Nachweis von Autoimmunerkrankungen der Schilddrüse, Autoantikörper gegen Gewebetransglutaminase (TGA) für Zöliakie und Autoantikörper gegen Interferon alpha (IFNαA) für autoimmunes polyglanduläres Syndrom-1 (APS-1); alle suchen gleichzeitig nach T1D und anderen relevanten Autoimmunerkrankungen. Der Multiplex-ECL-Assay basiert auf der Single-ECL-Assay-Plattform, verwendet jedoch stattdessen die Multiplex-Platte, die mehrere Autoantikörper-Assays bis zu 10 in einer einzigen Vertiefung kombiniert. Der Hauptunterschied zum einzelnen ECL-Assay besteht darin, dass jeder in der Fluidphase gebildete Antikörper-Antigen-Komplex durch ein Linkersystem auf der Multiplexplatte an eine bestimmte Stelle in jeder Vertiefung zurückgehalten wird. Der 7-Plex-ECL-Assay in der vorliegenden Studie wurde gegen Standard-Radiobindungstests (RBA) und einzelne ECL-Assays validiert, wobei eine große Kohorte neu diagnostizierter T1D-Patienten und altersentsprechende gesunde Kontrollen verwendet wurde, was zu einer ausgezeichneten Assay-Sensitivität und -Spezifität führt.
Typ-1-Diabetes (T1D) ist eine schwere chronische Erkrankung, die am häufigsten in der Kindheit auftritt. Derzeit haben rund 1,4 Millionen Menschen den T1D in den Vereinigten Staaten; Auffallend ist, dass die Inzidenz von T1D weltweit jedes Jahr stetig um 3-5% zunimmt und sich in den letzten zwei Jahrzehnten verdoppelt hat, insbesondere bei Kleinkindern 1,2. Inselautoantikörper (IAbs) im Blutkreislauf sind derzeit der zuverlässigste Biomarker. Das IAbs kann Jahre vor der Entwicklung des klinischen T1D auftreten3. Derzeit werden vier wichtige IAbs häufig in der T1D-Diagnose und im Risikoscreening eingesetzt, darunter Autoantikörper gegen Insulin (IAA), Glutamatdecarboxylase-65 (GADA), Insulinom-Antigen-2 (IA-2A) und Zinktransporter-8 (ZnT8A). Diese vier IAbs sind gleichermaßen wichtig für die Vorhersage der T1D-Entwicklung. Die Klassifizierung von T1D wurde kürzlich neu definiert als das Vorhandensein von ≥2 von 4 beliebigen IAbs mit einem normalen Glukosestoffwechsel als Krankheitsstadium 14.
In der Diabetes Autoimmunity Study in the Young (DAISY) wurde festgestellt, dass eines von vier Kindern mit einem Risiko für T1D wahrscheinlich zu Insel-, Zöliakie-, Schilddrüsen- oder rheumatoider Autoimmunität fortschreitet, und auffälliger ist, dass etwa 40% der Patienten, bei denen T1D diagnostiziert wurde, schließlich eine zusätzliche Autoimmunerkrankung entwickeln 5,6,7 . Die Identifizierung von Autoantikörpern ist für die Vorhersage und Diagnose dieser Autoimmunerkrankungen unerlässlich und sollte eine bessere klinische Versorgung der Patienten ermöglichen. Es gibt derzeit keine einfache und kostengünstige Möglichkeit, nach diesen multiplen Autoimmunerkrankungen zu suchen. Aktuelle Screening-Methoden mit Standard-Radiobindungsassay (RBA) mit einer einzigen Autoantikörpermessung sind mühsam und ineffizient für ein groß angelegtes Screening.
Hier werden wir den neu entwickelten einfachen Multiplex-ECL-Assay beschreiben, den wir mit einer einzigen ECL-Assay-Plattform 8,9,10,11 authentifiziert haben. Der Multiplex-ECL-Assay kombiniert 7 Autoantikörpertests in einer einzigen Vertiefung mit nur 15 μL Serum und ist in der Lage, gleichzeitig auf T1D und mehrere relevante Autoimmunerkrankungen zu untersuchen, einschließlich Zöliakie, Autoimmunerkrankungen der Schilddrüse und APS-1. Ein ZnT8A ECL-Assay war zu diesem Zeitpunkt noch nicht entwickelt worden und wurde nicht in den Multiplex-Assay aufgenommen. Der Multiplex-ECL-Assay bietet ein hervorragendes Werkzeug für den Hochdurchsatz beim allgemeinen Screening auf T1D und multiple Autoimmunerkrankungen.
Das Forschungsprotokoll wurde vom Colorado Multiple Institutional Review Board genehmigt.
1. Puffervorbereitung
2. Markierung jedes Antigenproteins mit Biotin und Ru Sulfo-NHS separat
HINWEIS: Um eine effektivere Markierungsreaktion zu erzielen, verwenden Sie eine Antigenproteinkonzentration von ≥0,5 mg / ml.
3. Definieren Sie die beste Konzentration und das beste Verhältnis für die beiden markierten Antigene für den Assay (Schachbrett-Assay)
HINWEIS: Da der ECL-IAA-Assay in diesem 7-Plex-Assay eine saure Behandlung von Serumproben erfordert, muss der Schachbretttest für jedes Antigen diesen Schritt durchlaufen, bevor er mit der markierten Antigenmischung inkubiert wird.
4. Erstellen Sie die gemischte Linker-gekoppelte Antigenlösung
5. Serumproben mit dem markierten Antigen inkubieren
HINWEIS: Da der ECL-IAA-Assay in diesem 7-Plex-Assay eine saure Behandlung von Serumproben erfordert, erfordert jedes Serum den Säurebehandlungsschritt, bevor es mit einer markierten Antigenmischung für diesen 7-Plex-Assay inkubiert wird.
6. Bereiten Sie die Multiplexplatte vor
7. Serum/Antigen in die Multiplexplatte überführen
8. Waschen Sie die Platte und fügen Sie Lesepuffer hinzu
9. Lesen Sie die Platte und analysieren Sie die Daten
Die Analyse der Untersuchungsergebnisse wurde in Tabelle 1, Tabelle 2 und Tabelle 3 gezeigt. Die Messwerte stammen aus den Daten der 10 Punkte innerhalb desselben Bohrlochs. Die Indexwerte für jede Probe wurden anhand der entsprechenden internen Positiv- und Negativkontrollen berechnet, wie im Assay-Protokoll beschrieben. Beispiele für fehlerhafte Duplikate sind in Tabelle 1 aufgeführt und verursachten den endgültigen Indexberechnungsfehler in Tabelle 3. Alle Rohzählwerte müssen überprüft werden, um falsch positive oder falsch negative Ergebnisse zu vermeiden.
Der 7-multiplexte ECL-Test wurde anhand einer großen Kohorte von Proben von 1026 neu diagnostizierten Patienten mit T1D und 1022 mit Alter und Geschlecht übereinstimmenden gesunden Kontrollpersonen validiert. Die Konzentrationen von Autoantikörpern aus dem 7-Plex-ECL-Assay für 1026 T1D-Patienten wurden mit den Konzentrationen aus jedem unserer entsprechenden etablierten Einzel-ECL-Assays verglichen, wie in Abbildung 2 gezeigt, und aus jedem entsprechenden einzelnen Standard-RBA und ELISA, wie in Abbildung 3 gezeigt. Die Assay-Spezifitäten wurden bei 99. Perzentilen für alle Autoantikörper-Assays mit Ausnahme von Schilddrüsen-Autoantikörpern (wo das 95. Perzentil verwendet wurde) von 1022 gesunden Kontrollen für alle drei Assay-Methoden (7-Plex-ECL, Single ECL, RBA oder ELISA) identisch aufgestellt, wie in Tabelle 4 aufgeführt. Die Inter-Assay-CVs von GADA, IA-2A, IAA, TPOA, ThGA, TGA und IFNαA betragen 6,4%, 4,5%, 9,1%, 4,9%, 5,7%, 11,3% bzw. 5,9%.
Eine kleine Anzahl von diskordanten Proben für jeden der 7 Autoantikörper wurde um die Grenze der Cut-offs für jeden Assay gefunden (Abbildung 2 und Abbildung 3). Elf Kontrollproben (11/1022, 1,1%) wurden nur im 7-Plex-Assay als multiple Autoantikörper positiv und in jedem entsprechenden Einzelassay negativ befunden. In ähnlicher Weise geschah es in 9 Proben der T1D-Patienten (9/1026, 0,9%). Darüber hinaus wurden 10 hoch positive TPOA und eine ThGA in der Patientenkohorte, die sowohl im einzelnen ECL-Assay als auch in der RBA beobachtet wurden, im 7-Plex-Assay übersehen. Diese Proben wurden im 7-Plex-Assay positiv umgewandelt, wenn sie weiter verdünnt wurden. Im Allgemeinen wurden 100 % der Positivität im einzelnen ECL-Assay oder RBA im 7-Plex-ECL-Assay abgedeckt, mit der gleichen Assay-Spezifität wie in Tabelle 4 dargestellt.
Abbildung 1: Illustration des Mutiplex ECL-Assays.
Autoantikörper im Serum überbrücken das Ru-Sulfo-NHSged-Antigen zum biotinylierten Antigen. Dies wird mit einem spezifischen Linker gekoppelt, um einen Komplex von Antigen-Antikörper-Antigen-Linkern zu bilden. Die Komplexe werden auf der Platte erfasst und durch jeden spezifischen Linker an ihren spezifischen Stellen festgehalten. Die spezifisch gekoppelten Linkernummern für die 7 verschiedenen Antigenproteine sind dargestellt. Der Nachweis von Antikörpersignalen erfolgt unter Verwendung von Ru Sulfo-NHS-markierten Antigenen mit Elektrochemilumineszenz. Die Abbildung stammt aus Gu, Y. et al.13. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Vergleich von 7 Autoantikörperspiegeln bei 1026 neu auftretenden Patienten mit T1D zwischen dem einzelnen ECL-Assay und dem 7-Plex-ECL-Assay.
Die Panels a, b, c, d, e, f und g zeigen Vergleiche der Autoantikörperspiegel für GADA, IA-2A, IAA, TGA, TPOA, ThGA bzw. IFNαA. Die gestrichelten Linien stellen die Assay-Cut-offs für jeden Autoantikörper-Assay dar. Die Cut-offs wurden auf das 99. Perzentil von 1022 altersangepassten gesunden Kontrollen für jeden Assay festgelegt (mit Ausnahme von TPOA und ThGA, die auf das 95. Perzentil festgelegt wurden), wie in Tabelle 4 gezeigt, von 1022 altersentsprechenden gesunden Kontrollen für Einzel- und Multiplex-ECL-Assays. Rote geschlossene Diamanten werden im 7-Plex-ECL-Assay als "falsch" positiv markiert, <1% der untersuchten Kohorte, und sie wurden sowohl in der einzelnen ECL als auch in der RBA als negativ validiert. Rote geschlossene Quadrate werden im 7-Plex-ECL-Assay als "falsche" Negative markiert, die durch das "Prozone"-Phänomen verursacht werden und hauptsächlich im TPOA-Assay bei <1% der untersuchten Kohorte auftreten. Sowohl diese falsch positiven als auch diese falsch negativen Ergebnisse werden im Diskussionsabschnitt diskutiert. Die Abbildung stammt aus Gu, Y. et al.13. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Vergleich von 7 Autoantikörperspiegeln bei 1026 neu auftretenden Patienten mit T1D zwischen dem RBA (ELISA für IFNαA) und dem 7-Plex ECL-Assay.
Die Panels a, b, c, d, e, f und g zeigen Vergleiche der Autoantikörperspiegel für GADA, IA-2A, IAA, TGA, TPOA, ThGA bzw. IFNαA. Die gestrichelten Linien stellen die Assay-Cut-offs für jeden Autoantikörper-Assay dar, die gleiche Spezifität, die sowohl für RBA als auch für den 7-Plex-ECL-Assay festgelegt wurde, wie in Tabelle 4 gezeigt, von 1022 altersgerechten gesunden Kontrollen. Rote geschlossene Diamanten und Quadrate stellen "falsche" Positive und "falsche" Negative dar, die im 7-Plex-ECL-Test erscheinen, dasselbe ist in Abbildung 2 dargestellt. Die Abbildung stammt aus Gu, Y. et al.13. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | ||
Ein | 5580 | 5674 | 105 | 117 | 125 | 139 | Linker-1 |
100 | 108 | 102 | 102 | 3956 | 3745 | Linker-2 | |
115 | 124 | 107 | 116 | 113 | 124 | Linker-3 | |
67 | 64 | 68 | 61 | 65 | 69 | Linker-4 | |
89 | 87 | 98 | 92 | 90 | 80 | Linker-5 | |
87 | 71 | 89 | 87 | 61 | 72 | Linker-6 | |
94 | 82 | 79 | 85 | 2154 | 2280 | Linker-7 | |
75 | 66 | 1628 | 1594 | 81 | 83 | Linker-8 | |
98 | 103 | 71 | 84 | 69 | 85 | Linker-9 | |
102 | 118 | 93 | 98 | 113 | 99 | Linker-10 | |
B | 324 | 337 | 147 | 148 | 5426 | 5366 | Linker-1 |
101 | 102 | 93 | 88 | 86 | 74 | Linker-2 | |
111 | 119 | 119 | 123 | 66 | 72 | Linker-3 | |
72 | 65 | 59 | 68 | 74 | 67 | Linker-4 | |
81 | 98 | 83 | 92 | 79 | 72 | Linker-5 | |
90 | 84 | 93 | 86 | 70 | 76 | Linker-6 | |
101 | 105 | 101 | 97 | 956 | 944 | Linker-7 | |
82 | 83 | 189 | 204 | 97 | 90 | Linker-8 | |
92 | 83 | 78 | 64 | 82 | 78 | Linker-9 | |
83 | 79 | 88 | 93 | 4722 | 4965 | Linker-10 | |
C | 110 | 110 | 87 | 81 | 2114 | 2365 | Linker-1 |
5526 | 5680 | 88 | 70 | 86 | 93 | Linker-2 | |
114 | 132 | 67 | 71 | 3326 | 3284 | Linker-3 | |
64 | 62 | 88 | 74 | 64 | 80 | Linker-4 | |
94 | 82 | 86 | 75 | 89 | 76 | Linker-5 | |
77 | 87 | 75 | 63 | 70 | 86 | Linker-6 | |
77 | 86 | 71 | 84 | 138 | 121 | Linker-7 | |
73 | 86 | 80 | 79 | 59 | 73 | Linker-8 | |
86 | 74 | 5064 | 4923 | 88 | 86 | Linker-9 | |
105 | 113 | 85 | 80 | 124 | 114 | Linker-10 | |
D | 98 | 88 | 92 | 84 | 136 | 127 | Linker-1 |
288 | 291 | 86 | 86 | 558 | 564 | Linker-2 | |
109 | 101 | 74 | 73 | 141 | 127 | Linker-3 | |
78 | 66 | 66 | 55 | 74 | 66 | Linker-4 | |
79 | 83 | 79 | 86 | 96 | 91 | Linker-5 | |
83 | 86 | 96 | 89 | 86 | 73 | Linker-6 | |
87 | 89 | 77 | 87 | 841 | 855 | Linker-7 | |
74 | 72 | 60 | 72 | 90 | 95 | Linker-8 | |
68 | 75 | 331 | 328 | 2460 | 2580 | Linker-9 | |
86 | 98 | 80 | 75 | 123 | 133 | Linker-10 | |
E | 101 | 114 | 101 | 106 | 532 | 548 | Linker-1 |
101 | 96 | 110 | 104 | 682 | 675 | Linker-2 | |
6015 | 5988 | 124 | 126 | 101 | 98 | Linker-3 | |
66 | 71 | 82 | 71 | 80 | 62 | Linker-4 | |
102 | 97 | 99 | 80 | 83 | 110 | Linker-5 | |
82 | 67 | 81 | 80 | 60 | 85 | Linker-6 | |
85 | 95 | 52 | 84 | 245 | 221 | Linker-7 | |
72 | 78 | 82 | 74 | 486 | 503 | Linker-8 | |
77 | 97 | 97 | 77 | 56 | 66 | Linker-9 | |
114 | 104 | 5726 | 5814 | 259 | 253 | Linker-10 | |
F | 119 | 120 | 133 | 118 | 112 | 96 | Linker-1 |
101 | 91 | 100 | 95 | 96 | 82 | Linker-2 | |
406 | 395 | 111 | 123 | 2127 | 101 | Linker-3 | |
72 | 60 | 86 | 72 | 79 | 83 | Linker-4 | |
76 | 85 | 96 | 99 | 89 | 103 | Linker-5 | |
88 | 78 | 91 | 83 | 89 | 95 | Linker-6 | |
104 | 97 | 87 | 102 | 56 | 66 | Linker-7 | |
76 | 77 | 79 | 93 | 69 | 75 | Linker-8 | |
85 | 71 | 95 | 100 | 83 | 71 | Linker-9 | |
131 | 131 | 358 | 364 | 92 | 86 | Linker-10 | |
G | 90 | 95 | 85 | 82 | 105 | 107 | Linker-1 |
99 | 86 | 77 | 76 | 1250 | 1174 | Linker-2 | |
119 | 123 | 120 | 118 | 112 | 108 | Linker-3 | |
76 | 83 | 77 | 80 | 86 | 76 | Linker-4 | |
88 | 86 | 86 | 93 | 107 | 92 | Linker-5 | |
73 | 73 | 71 | 82 | 84 | 75 | Linker-6 | |
5210 | 5173 | 72 | 69 | 76 | 85 | Linker-7 | |
80 | 81 | 79 | 82 | 100 | 101 | Linker-8 | |
96 | 97 | 89 | 83 | 65 | 83 | Linker-9 | |
98 | 103 | 86 | 88 | 1933 | 1979 | Linker-10 | |
H | 114 | 124 | 81 | 86 | 299 | 295 | Linker-1 |
107 | 92 | 69 | 72 | 4256 | 4388 | Linker-2 | |
114 | 123 | 125 | 129 | 501 | 536 | Linker-3 | |
77 | 70 | 67 | 64 | 74 | 62 | Linker-4 | |
92 | 110 | 81 | 84 | 77 | 71 | Linker-5 | |
87 | 79 | 72 | 76 | 83 | 81 | Linker-6 | |
328 | 341 | 84 | 80 | 88 | 97 | Linker-7 | |
75 | 84 | 75 | 90 | 74 | 83 | Linker-8 | |
73 | 79 | 78 | 76 | 84 | 70 | Linker-9 | |
113 | 120 | 81 | 76 | 2372 | 2350 | Linker-10 |
Tabelle 1: Analyse des 7-Plex-ECL-Assays: rohe CPS-Zahlen (linke Hälfte der Platte). Die CPS-Rohzählungen werden von einer Assay-Platte (der linken Hälfte der Platte) erfasst und jede Probe wird in doppelter Ausführung durchgeführt. Unter jeder Zeile der Platte (A-H) befinden sich 10 Zeilen mit Lesewerten, die die Daten der 10 Punkte innerhalb desselben Brunnens darstellen und jeder markierten Linkernummer entsprechen. Beispiele für fehlerhafte Duplikate sind grau hervorgehoben, wie in Zeile F-Linker 3-Spalten 5 und 6 zu sehen ist.
Zeile der Tabelle 1A | Spalte der Tabelle 1A | Linker 1 | Linker 2 | Linker 3 | Linker 7 | Linker 8 | Linker 9 | Linker 10 | |
Ein | 1-2 | GADA PC | 5627 | 104 | 120 | 88 | 71 | 101 | 110 |
B | 1-2 | GADA Low PC | 331 | 102 | 115 | 103 | 83 | 88 | 81 |
C | 1-2 | TPOA PC | 110 | 5603 | 123 | 82 | 80 | 80 | 109 |
D | 1-2 | TPOA Low PC | 93 | 290 | 105 | 88 | 73 | 72 | 92 |
E | 1-2 | TGA PC | 108 | 99 | 6002 | 90 | 75 | 87 | 109 |
F | 1-2 | TG Low PC | 120 | 96 | 401 | 101 | 77 | 78 | 131 |
G | 1-2 | ThGA PC | 93 | 93 | 121 | 5192 | 81 | 97 | 101 |
H | 1-2 | ThGA Low PC | 119 | 100 | 119 | 335 | 80 | 76 | 117 |
Ein | 3-4 | IAA PC | 111 | 102 | 112 | 82 | 1611 | 78 | 96 |
B | 3-4 | IAA Low PC | 148 | 91 | 121 | 99 | 197 | 71 | 91 |
C | 3-4 | IFNaA PC | 84 | 79 | 69 | 78 | 80 | 4994 | 83 |
D | 3-4 | IFNaA Low PC | 88 | 86 | 74 | 82 | 66 | 330 | 78 |
E | 3-4 | IA-2A PC | 104 | 107 | 125 | 68 | 78 | 87 | 5770 |
F | 3-4 | IA-2A Niedriger PC | 126 | 98 | 117 | 95 | 86 | 98 | 361 |
G | 3-4 | NC | 84 | 77 | 119 | 71 | 81 | 86 | 87 |
H | 3-4 | NC | 84 | 71 | 127 | 82 | 78 | 77 | 79 |
Ein | 5-6 | Beispiel1 | 132 | 3851 | 119 | 2217 | 82 | 77 | 106 |
B | 5-6 | Beispiel2 | 5396 | 80 | 69 | 950 | 94 | 80 | 4844 |
C | 5-6 | Beispiel3 | 2240 | 90 | 3305 | 130 | 66 | 87 | 119 |
D | 5-6 | Beispiel4 | 132 | 561 | 134 | 848 | 93 | 2520 | 128 |
E | 5-6 | Beispiel5 | 540 | 679 | 100 | 233 | 495 | 61 | 256 |
F | 5-6 | Beispiel6 | 104 | 89 | 1114 | 61 | 72 | 77 | 89 |
G | 5-6 | Beispiel7 | 106 | 1212 | 110 | 81 | 101 | 74 | 1957 |
H | 5-6 | Beispiel8 | 297 | 4322 | 519 | 93 | 79 | 77 | 2361 |
Tabelle 2: Analyse des 7-Plex-ECL-Assays: Anordnung der Daten der Tabelle 1, markiert als 7 Linker. Die Daten aus Tabelle 1 wurden neu angeordnet, wobei die Linker 4 bis 6 (nicht verwendet) gestrichen wurden, und Mittelwerte wurden aus jedem Duplikat aus Tabelle 1 berechnet. Die Werte der internen Standard-High- und Low-Positivkontrollen, die jedem Autoantikörpertest entsprechen, die durch einen bestimmten Linker zurückgehalten werden, sind dunkel fett gedruckt. PC, Positivkontrolle. NC, normale Steuerung.
GAD-Index | TPOA-Index | TGA-Index | ThGA-Index | IAA-Index | IFNaA-Index | IA-2A-Index | |
GADA PC | 1.000 | 0.005 | 0.000 | 0.003 | -0.006 | 0.003 | 0.004 |
GADA Low PC | 0.045 | 0.005 | -0.001 | 0.006 | 0.002 | 0.000 | -0.001 |
IAA PC | 0.005 | 1.000 | 0.001 | 0.002 | -0.001 | -0.001 | 0.004 |
IAA Low PC | 0.002 | 0.039 | -0.002 | 0.003 | -0.005 | -0.003 | 0.001 |
IA-2A PC | 0.004 | 0.004 | 1.000 | 0.004 | -0.004 | 0.000 | 0.004 |
IA-2A Niedriger PC | 0.007 | 0.004 | 0.048 | 0.006 | -0.002 | -0.002 | 0.008 |
TGA PC | 0.002 | 0.003 | 0.000 | 1.000 | 0.000 | 0.002 | 0.002 |
TG Low PC | 0.006 | 0.004 | 0.000 | 0.052 | -0.001 | -0.002 | 0.005 |
TPOA PC | 0.005 | 0.005 | -0.001 | 0.002 | 1.000 | -0.002 | 0.001 |
TPOA Low PC | 0.012 | 0.003 | 0.000 | 0.006 | 0.076 | -0.003 | 0.001 |
ThGA PC | 0.000 | 0.000 | -0.008 | 0.001 | 0.000 | 1.000 | -0.001 |
ThGA Low PC | 0.001 | 0.002 | -0.008 | 0.002 | -0.009 | 0.050 | -0.002 |
IFNaA PC | 0.004 | 0.006 | 0.001 | 0.000 | -0.002 | 0.000 | 1.000 |
IFNaA Low PC | 0.008 | 0.004 | 0.000 | 0.005 | 0.004 | 0.002 | 0.048 |
NC | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
NC | 0.000 | -0.001 | 0.001 | 0.002 | -0.002 | -0.002 | -0.001 |
Beispiel1 | 0.009 | 0.683 | 0.000 | 0.419 | 0.001 | -0.002 | 0.003 |
Beispiel2 | 0.958 | 0.001 | -0.008 | 0.172 | 0.009 | -0.001 | 0.837 |
Beispiel3 | 0.389 | 0.002 | 0.542 | 0.012 | -0.009 | 0.000 | 0.006 |
Beispiel4 | 0.009 | 0.088 | 0.003 | 0.152 | 0.008 | 0.496 | 0.007 |
Beispiel5 | 0.082 | 0.109 | -0.003 | 0.032 | 0.271 | -0.005 | 0.030 |
Beispiel6 | 0.004 | 0.002 | 0.169 | -0.002 | -0.006 | -0.002 | 0.000 |
Beispiel7 | 0.004 | 0.205 | -0.002 | 0.002 | 0.013 | -0.002 | 0.329 |
Beispiel8 | 0.039 | 0.768 | 0.068 | 0.004 | -0.001 | -0.002 | 0.400 |
Tabelle 3: Analyse des 7-plex-ECL-Assays: Ergebnisse der Indexwerte. Die Indexwerte für jede Probe für alle 7 Autoantikörper-Assays wurden gegen die entsprechenden internen Positiv- und Negativkontrollen berechnet, wie im Assay-Protokoll beschrieben. Jeder Indexwert, der größer als der Cut-off-Wert war, wurde als positives Ergebnis definiert und dunkel fett dargestellt. Der TGA-Indexwert von Beispiel6 wurde grau hervorgehoben, da es sich um einen Fehler handelt, der durch fehlerhafte Duplikate verursacht wird, die in Zeile F-Linker 3-Spalten 5 und 6 in Tabelle 1 angezeigt werden.
GADA | IA-2A | IAA | .TGA | TPOA | ThGA | IFNαA* | ||||||||
Sens | Spekulation | Sens | Spekulation | Sens | Spekulation | Sens | Spekulation | Sens | Spekulation | Sens | Spekulation | Sens | Spekulation | |
RBA | 73.4% | 98.5% | 75.2% | 99.0% | 47.7% | 99.1% | 12.9% | 99.0% | 23.9% | 95.2% | 19.3% | 94.7% | 1.0% | 99.6% |
Einzelne ECL | 71.6% | 99.1% | 73.6% | 99.3% | 48.3% | 99.7% | 16.0% | 98.9% | 26.3% | 94.9% | 20.6% | 95.1% | 0.8% | 99.2% |
7-Plex ECL | 71.2% | 98.9% | 77.3% | 98.9% | 49.5% | 98.9% | 16.5% | 98.7% | 26.1% | 94.7% | 21.1% | 94.7% | 1.7% | 99.1% |
Tabelle 4: Assay-Sensitivität und -Spezifität bei 1026 T1D-Patienten und 1022 Kontrollen, abgestimmt nach Alter und Geschlecht, in einem 7-Plex-ECL-Assay im Vergleich zum entsprechenden einzelnen ECL-Assay und RBA oder ELISA*. Die verschiedenen Assays (RBA, Single ECL und 7-Plex ECL) für jeden Autoantikörper wurden unter Verwendung der 1022 alters- und geschlechtsangepassten gesunden Kontrollen auf ähnliche Besonderheiten eingestellt. Das Spezifitätsergebnis der untersuchten Kontrollkohorte lag bei 95% für TPOA und ThGA und bei 99% für die 5 anderen Assays. *Sternchen markiert den IFNαA-Assay für ELISA, während andere RBA sind.
In zahlreichen nationalen und internationalen klinischen Studien für Typ-1-Diabetes wurde die Leistung des einzelnen ECL-Assays zum Nachweis von Inselautoantikörpern und Autoantikörpern gegen Transglutaminase (TGA) bei Zöliakie untermauert 8,9,10,11. Während dieser Trails hat dieser Assay die Sensitivität und Spezifität für den Autoantigennachweis erhöht, wenn er mit dem bestehenden "Gold"-Standard RBA bewertet wird. Die erhöhte Krankheitsspezifität kann beobachtet werden, wenn zwischen dem einzelnen ECL-Assay und dem RBA14,15,16,17 Inselautoantikörper mit hoher Affinität und Signalen mit niedrigem Risiko und niedrigem Risiko unterschieden werden. Aufbauend auf dem einzelnen ECL-Assay entwickeln wir einen neuen Multiplex-ECL-Autoantikörper-Assay mit hohem Durchsatz, der es uns ermöglicht, gleichzeitig nach T1D sowie mehreren anwendbaren Autoimmunerkrankungen zu suchen.
Der Multiplex-ECL-Assay verwendet die Multiplexplatte, die bis zu 10 Autoantikörper-Assays in einer einzigen Vertiefung kombinieren kann. Für die vorliegende Studie werden 7 Autoantikörper-Assays miteinander kombiniert. Die Autoantikörper bestehen aus 3 IAbs (IAA, GADA und IA-2A), 2 Autoimmun-Autoantikörpern für Schilddrüsenerkrankungen (TPOA und ThGA), Zöliakie-Autoantikörpern (TGA) und APS-1-Autoantikörpern gegen Interferon alpha (IFNαA). Der Assay-Mechanismus basiert im Allgemeinen auf einem einzigen ECL-Assay, wie zuvor veröffentlicht 9,10,12,18 mit einigen Modifikationen. Der Hauptunterschied eines Multiplex-ECL-Assays zu einem einzelnen ECL-Assay besteht darin, dass jeder in der Fluidphase gebildete Antikörper-Antigen-Komplex auf einen bestimmten Linker beschränkt ist (Abbildung 1). Das Biotin-markierte Antigen wird mit dem konjugierten Streptavidin inkubiert, einem Linker, der zur Bildung eines spezifischen Antigen-Linker-Komplexes verwendet wird. Antikörper-Antigen-Immunkomplex bildet sich nach Inkubation mit Patientenserum und wird durch das spezifische Linkersystem auf jeder Vertiefung der Multiplexplatte an einer bestimmten Stelle eingefangen. Ru Sulfo-NHS markiertes Antigen, das gleichzeitig von Antikörpern eingefangen wird, liefert das Signal mit Elektrochemilumineszenz. Die Plattenlesmaschine kann bis zu 10 verschiedene Signale von den Punktquellen in jedem Bohrloch erkennen. Um Autoantikörper-Assays zwischen den Platten und bei der Durchführung von Langzeitstudien konsistent zu halten, empfehlen wir, dass derselbe Linker verwendet wird.
Vor der Einrichtung eines Multiplex-ECL-Assays müssen einzelne ECL-Assays für jeden Autoantikörper auf einer Multiplexplatte optimiert und sowohl gegen RBA- als auch gegen einzelne ECL-Assays auf einer regulären ECL-Platte validiert werden. Zur Verbesserung des Schachbrett-Assays wurden zum zugehörigen Autoantikörper-Assay auf der Multiplexplatte eine hochpositive Patienten- und eine negative Patientenprobe verwendet. Nachdem der Schachbretttest durchgeführt wurde, wurden die idealsten Konzentrationen für Ru Sulfo-NHS und Biotin-markiertes Antigen für jeden der 7 Autoantikörper-Assays berechnet. Im Folgenden sind diese Konzentrationen dargestellt: 30 ng/ml und 200 ng/ml für GAD65, 120 ng/ml und 120 ng/ml für Proinsulin, 10 ng/ml und 42 ng/ml für IA-2, 80 ng/ml und 80 ng/ml für TG, 8 ng/ml und 16 ng/ml für TPO, 31 ng/ml und 31 ng/ml für ThG, und 12 ng/ml bzw. 12 ng/ml für IFNα13. Die Konzentrationen einiger Antigene aus dem Schachbretttest müssen möglicherweise entsprechend den Ergebnissen des tatsächlichen Multiplex-Assays weiter angepasst werden, nachdem alle Assays kombiniert wurden.
Da IAA im vorliegenden Multiplex-ECL-Assay enthalten ist, ist eine saure Behandlung von Serumproben obligatorisch, bevor das Serum mit Antigen inkubiert wird, wie in der vorherigen Studieberichtet 12. Wenn einem Multiplex-Assay ein zusätzlicher Autoantikörper hinzugefügt wird, wird im Allgemeinen der Assay-Hintergrund beeinflusst, und ein extrem hohes Signal von einem Punkt im Bohrloch kann die Ergebnisse nahegelegener Spots durch Übersprechen behindern. Daher muss das maximale CPS auf 20.000 Zählungen für jeden Autoantikörper oder niedriger für die höchsten positiven Proben begrenzt werden. Um das Übersprechen zu reduzieren, sollten unseres Wissens Autoantikörper mit niedrigerem Hintergrund beim Entwurf der Spotkarte weit entfernt von Spots mit einer höheren Häufigkeit von Zählungen getrennt werden.
Hohe Positiv- und Negativkontrollen wurden intern in jedem Assay verwendet, um einen genauen Index für die unbekannten getesteten Proben zu berechnen. Um die Empfindlichkeit des Assays genau zu beurteilen und zu überwachen, wurden niedrige Positivkontrollen verwendet, die nahe der oberen Grenze des Assays lagen. Diese Standard-Positiv- und Negativkontrollen wurden in loser Schüttung und aliquot für den Langzeitgebrauch erstellt und bei -20 °C oder darunter gelagert, um die Konsistenz zwischen den Assays zu gewährleisten. Zur Qualitätssicherung wurden die Proben zweimal in jedem Assay durchgeführt, und jedes positive Ergebnis wurde wiederholt und bestätigt, indem die Probe am nächsten Tag in einem neuen ECL-Assay durchgeführt wurde. Wenn es Unstimmigkeiten mit dem ersten und zweiten Bestätigungstest gab, war ein dritter Assay erforderlich. Von den drei durchgeführten Assays bestimmten die Ergebnisse der beiden übereinstimmenden Assays (z. B. +, + oder -,-) das Endergebnis (positiv oder negativ) der Probe.
In den letzten zehn Jahren suchen viele Studiengruppen nach einem Hochdurchsatz-Assay, der die Multiplex-Methode verwendet, um mehrere Autoantikörper-Assays zu einem Bohrloch zu kombinieren, um große Populationen zu screenen. Es gibt einige Studien, die verschiedene Arten von Technologien verwenden, um Multiplex-Autoantikörper-Assays 19,20,21,22 durchzuführen, aber es gibt keinen Vergleich für einen dieser Assays in Sensitivität und Spezifität mit dem aktuellen "Gold"-Standard RBA, wenn T1D untersucht wird. Diese verschiedenen Arten von Plattformen werden nicht durch den internationalen Workshop des Islet Autoantibody Standardization Program (IASP) oder durch das Testen großer Kohorten in klinischen Studien validiert. In einem kürzlich in Deutschland durchgeführten allgemeinbevölkerungsbasierten Screening wird ein kombinierter Hochdurchsatz-Assay, der von Kronus vertriebene 3 Screen ICATM ELISA, als Werkzeug für das Erstlinien-Screening zum Nachweis von drei IAbs, GADA, IA-2A und ZnT8A verwendet, um eine Frühdiagnose von T1D23 im Kindesalter zu erreichen. Der 3-Screen-ELISA-Assay misst 3 Autoantikörper entweder in 3 getrennten Vertiefungen, wobei ein großes Serumvolumen verbraucht wird, oder in einer einzigen Vertiefung, wobei alle 3 Assays gemischt sind. Wenn eine Vertiefung im 3-Screen-ELISA-Assay positiv ist, kann man nicht unterscheiden, welche von drei Autoantikörpern vorhanden sind. Der größte Nachteil dieses Assays ist seine Unfähigkeit, IAA-Messungen einzubeziehen. Alle mit ELISA durchgeführten IAA-Ergebnisse, wie in IASP-Workshops nachgewiesen, weisen keine akzeptable Sensitivität und Spezifität auf24. IAA ist in der Regel die erste IAb, die erscheint und hat eine hohe Prävalenz bei kleinen Kindern. IAb-Screening mit IAA ist für Kinder notwendig und es wird nicht als akzeptabel angesehen, dieses Screening ohne IAA durchzuführen, um das T1D-Risiko in der Gemeinschaft zu bewerten. Darüber hinaus gibt es keine veröffentlichten Studien oder Daten, die zeigen, dass der Kronus IAb-Kit-Assay eher T1D-krankheitsspezifisch ist und in der Lage ist, ein hohes Risiko von einem IAbs mit niedrigem Risiko zu unterscheiden. Der 7-Plex ECL-Assay in der vorliegenden Studie wurde anhand einer großen Kohorte neu diagnostizierter Patienten mit T1D13 validiert. Im Vergleich zum aktuellen Standard-RBA- und etablierten Einzel-ECL-Assay ist der 7-Plex-Assay in der Lage, eine 100%ige Positivität bei gleicher Assay-Spezifität beizubehalten (Tabelle 4). Derzeit wird der 4-Plex ECL-Assay parallel zum Standard-RBA in einer laufenden großen klinischen Studie angewendet: Autoimmunity Screening for Kids (ASK) Studie. Diese Studie untersucht Kinder in der allgemeinen Bevölkerung der Metropolregion Denver auf T1D und Zöliakie. Im Vergleich zur Standard-RBA, die in der ASK-Studie verwendet wurde, zeigt der Multiplex-ECL-Test eine ausgezeichnete Sensitivität und eine höhere Krankheitsspezifität, identisch mit unseren früheren Berichten mit der einzelnen ECL-Studie25. Darüber hinaus zeigte unser 4-Plex ECL-Assay eine deutliche Reduzierung der Arbeit, der Kosten und des Serumvolumens um 70% im Vergleich zu den entsprechenden 4 Einzeltests für ECL und RBA. Mit dem gemultiplexten ECL-Assay können wir jede Vertiefung mit unterschiedlichen Zahlen anpassen, die verschiedene Autoantikörper (bis zu 10) repräsentieren, um auf verschiedene Autoimmunerkrankungen zu testen, die spezifisch für die Bedürfnisse eines bestimmten klinischen Ortes sind.
Es wurden einige Einschränkungen beobachtet, die in der vorliegenden Studie für einen gemultiplexten ECL-Assay unter Verwendung der Multiplexplatte gezeigt wurden. Die endgültige Verdünnung des mit Antigen inkubierten Serums kann nicht so eingestellt werden, dass sie die optimalsten Bedingungen für jeden einzelnen Autoantikörpertest liefert, der in einer einzigen Vertiefung kombiniert wird. Bei neun Proben (9/1026) von T1D-Patienten wurde ein falsch negatives Ergebnis für bestimmte Autoantikörper beobachtet. 7 der falsch negativen Ergebnisse waren für TPOA und 2 für ThGA im 7-Plex-ECL-Assay, aber sowohl im einzelnen ECL-Assay als auch im RBA wurden hohe positive Ergebnisse gezeigt (Abbildung 2 & 3). Nach weiterer Verdünnung aller 9 Proben wurden sie auf der Multiplexplatte positiv. Dieses Ergebnis wird durch das verursacht, was wir als "Prozone" -Phänomen bezeichnen. Dieses Phänomen führt dazu, dass die Probe ein falsch negatives Ergebnis zeigt, da die hohen Antikörpertiter die Bildung von Antigen-Antikörper-Gittern beeinflussen. Bei der Einrichtung eines Multiplex-Assays wird empfohlen, Proben mit sehr hohen Titern für jeden der kombinierten Autoantikörper Vortests durchführen zu lassen, um die optionale Verdünnung des Serums für die Antigeninkubation zu identifizieren. Alternativ sollten Autoantikörper-Assays mit ähnlich optimierten Bedingungen ausgewählt werden, um einen kombinierten Assay zu bilden, aus dem die beste Assay-Sensitivität und Spezifität für jeden Autoantikörper erreicht wird. In der vorliegenden Studie führten 7 Proben (7/1022) von gesunden Normalkontrollen zu falsch positiven Ergebnissen für mehrere Autoantikörper im 7-Plex-Assay, aber nach Durchführung eines einzigen ECL-Assays und RBA (Abbildung 2 & 3) wurden diese Autoantikörper in beiden Assays als negativ befunden. Die Gründe für diese falsch positiven Ergebnisse, die auf der Multiplexplatte für diese kleine Untergruppe von Proben auftreten, sind derzeit unbekannt. Für die aktuelle Anwendung des Multiplex-ECL-Assays werden alle positiven Proben mit ihrem entsprechenden einzelnen ECL-Assay wiederholt, um die Positivität zu bestätigen, wodurch dieser falsch positive Fehler aus dem Multiplex-ECL-Assay entfernt wird.
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Diese Arbeit wurde durch NIH Grant DK32083, JDRF Grants 2-SRA-2015-51-Q-R und 2-SRA-2018-533-S-B unterstützt.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
4 °C refrigerator | |||
–80 °C and -20 °C freezers | |||
96-well Plate Shaker | Wallac - Delfi | ||
96-well round bottom plate | Fisher | 8408220 | |
Acetic acid solution | Fisher | ||
Aluminum foil | |||
Antigen proteins | |||
Human GAD65 full length protein | Diamyd | ||
Human ThG full length protein | BioMart | ||
Human TPO full length protein | BioMart | ||
IA-2 intracellular domain protein | BioMart | ||
IFN-α protein | Abcam | ||
Proinsulin protein | AmideBio | ||
tTG protein | DiaRect | ||
Biotin | Sigma | ||
Bottle-Top 500 mL , Filter Units | Fisher | 0974064A or B | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A-7906 | |
Distilled deionized (DD) water | |||
HCl | Fisher | ||
Ice maker | |||
Ice trays | |||
MSD Sector | Perkin-Elmer | ||
Multi-channel pipette | |||
NaOH | |||
Paper tower | |||
PBS | |||
pH meter | |||
Pipette-Aid | |||
Pipettes/tips | |||
Ru Sulfo-NHS | MSD (R91AN) | ||
Trizma Base | Fisher | BP152-5 | |
Tween 20 | Sigma | P-1379 | |
Uplex Development Kit | MSD | ||
96-well UPlex plate | MSD | ||
Blocker A | MSD | R93AA | |
Linker-Streptavidin | MSD | ||
Read buffer | MSD | R92TC | |
Stop Solution | MSD | ||
Vortex mixer | |||
ZeBa Column | Pierce | 89892 |
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