Un ensayo de electroquimioluminiscencia 7-plex de alto rendimiento que detecta simultáneamente la diabetes tipo 1 y múltiples enfermedades autoinmunes

Resumen

Modelamos un ensayo ECL multiplexado simple que combina 7 ensayos de autoanticuerpos. El ensayo es capaz de detectar DT1 y muchas otras enfermedades autoinmunes, simultáneamente, incluida la enfermedad celíaca, la enfermedad tiroidea autoinmune y el síndrome poliglandular autoinmune 1.

Resumen

Los autoanticuerpos de los islotes (IAbs) se usan ampliamente en el diagnóstico y la predicción de la diabetes tipo 1 (DT1). Cuatro BAI principales a la insulina (IAA), glutamato descarboxilasa-65 (GADA), antígeno de insulinoma-2 (IA-2A) y transportador de zinc-8 (ZnT8A) son igualmente importantes en la predicción de la enfermedad. Actualmente, hasta el 40% de los pacientes diagnosticados con DT1 desarrollan otros trastornos autoinmunes. Desafortunadamente, los métodos de detección actuales que utilizan un solo autoanticuerpo para la medición son laboriosos e ineficientes para los estudios de detección a gran escala. Recientemente desarrollamos un ensayo simple de electroquimioluminiscencia multiplexada (ECL) para abordar estos problemas actuales. El ensayo combina las 7 pruebas de autoanticuerpos en un solo pocillo. Cada pocillo incluye tres IAbs (IAA, GADA e IA-2A), autoanticuerpos contra la peroxidasa tiroidea (TPOA) y globulina tiroidea (ThGA) para detectar la enfermedad tiroidea autoinmune, autoanticuerpos contra la transglutaminasa tisular (TGA) para la enfermedad celíaca y autoanticuerpos contra el interferón alfa (IFNαA) para el síndrome poliglandular-1 autoinmune (APS-1); todos los cuales detectan la DT1 y otras enfermedades autoinmunes relevantes, simultáneamente. El ensayo ECL multiplex se basa en la plataforma de ensayo ECL única, pero en su lugar utiliza la placa multiplex que combina múltiples ensayos de autoanticuerpos, hasta 10, en un solo pocillo. La principal diferencia con el ensayo ECL único es que cada complejo anticuerpo-antígeno formado en la fase fluida se restringe en un punto específico en cada pocillo a través de un sistema de enlace en la placa múltiplex. El ensayo 7-Plex ECL, en el presente estudio, se valida contra ensayos estándar de unión radioeléctrica (RBA) y ensayos ECL únicos, utilizando una gran cohorte de pacientes con DT1 recién diagnosticados y controles sanos de la misma edad, lo que resulta en una excelente sensibilidad y especificidad del ensayo.

Introducción

La diabetes tipo 1 (DT1) es una enfermedad crónica grave que es más común en la infancia. Actualmente, alrededor de 1.4 millones de personas tienen la DT1 en los Estados Unidos; Sorprendentemente, la incidencia de DT1 está aumentando constantemente en un 3-5% cada año en todo el mundo y se ha duplicado en las últimas dos décadas, especialmente en niños pequeños ^1,2. Los autoanticuerpos de los islotes (IAbs) en la circulación sanguínea son el biomarcador más fiable en la actualidad. El IAbs puede aparecer años antes de que se desarrolle la DT1 clínica³. Actualmente, cuatro BAI principales se utilizan ampliamente en el diagnóstico de DT1 y la detección de riesgos, incluidos los autoanticuerpos contra la insulina (IAA), la glutamato descarboxilasa-65 (GADA), el antígeno 2 del insulinoma (IA-2A) y el transportador de zinc-8 (ZnT8A). Estos cuatro IAb son igualmente importantes en la predicción del desarrollo de DT1. La clasificación de la DT1 se ha redefinido recientemente como la presencia de ≥2 de 4 BAI con un metabolismo normal de la glucosa como la etapa 1 a⁴ de la enfermedad.

En el Estudio de Autoinmunidad de la Diabetes en los Jóvenes (DAISY), se reveló que uno de cada cuatro niños en riesgo de DT1 tenía probabilidades de progresar a autoinmunidad de islotes, celíacos, tiroides o reumatoide y, lo que es más sorprendente, aproximadamente el 40% de los pacientes que han sido diagnosticados con DT1 eventualmente desarrollan una condición autoinmune adicional ^5,6,7 . La identificación de autoanticuerpos es esencial para la predicción y el diagnóstico de estas enfermedades autoinmunes y debe proporcionar una mejor atención clínica para los pacientes. No existe una manera fácil y económica en la actualidad para detectar estas múltiples afecciones autoinmunes. Los métodos de detección actuales que utilizan el ensayo de unión radiactiva (RBA) estándar, con una sola medición de autoanticuerpos, son laboriosos e ineficientes para un cribado a gran escala.

Aquí, describiremos el ensayo ECL multiplexado simple recientemente desarrollado, que hemos autenticado utilizando una sola plataforma de ensayo ECL 8,9,10,11. El ensayo ECL multiplex combina 7 pruebas de autoanticuerpos en un solo pocillo, utilizando solo 15 μL de suero, y es capaz de detectar DT1 y múltiples enfermedades autoinmunes relevantes simultáneamente, incluida la enfermedad celíaca, la enfermedad tiroidea autoinmune y APS-1. Un ensayo ZnT8A ECL no se había desarrollado en ese momento y no se incluyó en el ensayo multiplexado. El ensayo ECL multiplex proporciona una excelente herramienta para el alto rendimiento en la detección de DT1 y múltiples enfermedades autoinmunes en la población general.

Protocolo

El protocolo de investigación fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional Múltiple de Colorado.

1. Preparación del tampón

1. Haga el tampón de etiquetado (2x PBS, pH 7.9). Usando 400 ml de agua destilada desionizada (DD), agregue 100 ml de 10x PBS. Para ajustar el pH de la solución, añadir NaOH hasta que alcance 7,9.
2. Crear 3 mM de biotina disolviendo 1 mg de biotina en 588 μL de tampón de etiquetado creado previamente. Haga 3 mM Ru Sulfo-NHS disolviendo 150 nmol de Ru Sulfo-NHS en 50 μL de tampón de etiquetado.
3. Haga el tampón antígeno (BSA al 1%) tomando 500 ml de 1x PBS y agregando 5 g de albúmina sérica bovina (BSA) a la solución. Preparar 0,5 M de solución de ácido acético. Prepare 1 M de tampón Tris-HCl utilizando Trizma Base y ajustando el pH a 9.0.
4. Para el tampón de recubrimiento (3% Bloqueador A), tome 500 ml de 1x PBS y agregue 15 g de Bloqueador A. Prepare el tampón de lavado (0.05 % Tween 20, PBST) mezclando 5000 ml de 1x PBS con 2.5 ml de Tween 20. Cree un tampón de lectura (2x Read Buffer T con surfactante) agregando 500 ml de agua DD y 500 mL de 4x Read Buffer T con surfactante.
   NOTA: Para mantener la coherencia entre los ensayos, es importante que tanto la biotina como las soluciones Ru Sulfo-NHS se creen justo antes del procedimiento de etiquetado y no se creen y almacenen para su uso futuro.

2. Etiquetar cada proteína antígeno con biotina y Ru Sulfo-NHS por separado

NOTA: Para tener una reacción de etiquetado más efectiva, use una concentración de proteína de antígeno de ≥0.5 mg / ml.

1. Calcular el número molar de cada proteína antígeno y los números molares de la biotina y Ru Sulfo-NHS. Agregue una cantidad adecuada de biotina o Ru Sulfo-NHS a la proteína antígeno para la reacción de etiquetado de acuerdo con la proporción molar de proteína de antígeno a biotina o Ru Sulfo-NHS.
   1. Para el antígeno que tiene el peso molecular más pequeño (≤10 kDa), como la proteína proinsulina, use una relación molar de 1: 5 (antígeno: biotina y Ru Sulfo-NHS). Para el antígeno que tiene el mayor peso molecular (>50 kDa), como la proteína GAD, use una relación molar de 1:20. Para el antígeno que tiene un peso molecular medio (10-50 kDa), use una relación molar ajustada entre 1:5-1:20.
2. Tanto para la biotina como para el Ru Sulfo-NHS, divida el peso de cada antígeno por sus pesos moleculares correspondientes para obtener el número molar del antígeno para cada uno. Divida el número molar por la concentración para obtener el volumen de biotina. Repita esto para Ru Sulfo-NHS.
3. Mezclar la proteína antígeno con biotina utilizando la proporción molar adecuada, determinada en el paso 2.2. Luego haga lo mismo para Ru Sulfo-NHS.
   NOTA: Para la eficiencia de la reacción de etiquetado, cualquier producto químico reductor como Tris o glicina en el sistema tampón debe cambiarse a 2x tampón PBS, pH 7.9 por la columna de centrifugado de tamaño. Los protocolos de etiquetado para biotina y Ru Sulfo-NHS son idénticos.
4. Cubrir los tubos de reacción con papel de aluminio e incubarlos a temperatura ambiente (RT) durante 1 h. La razón por la que cubre los tubos de reacción con papel de aluminio es porque tanto la biotina como los reactivos Ru Sulfo-NHS son sensibles a la luz.
5. Prepare la columna de espín de 2 ml o 5 ml mientras los tubos de reacción se están incubando (el tamaño de la columna de espín está determinado por el volumen cargado en la columna). Llene la columna de centrifugado con 2x PBS buffer y luego centrifugarla a 1,000 x g durante 2 min cada vez, para un total de tres veces.
6. Detenga la reacción de etiquetado después de que los tubos de reacción hayan terminado de incubar. Para detener la reacción, purifique la proteína antígeno marcada pasándola a través de la columna de espín una vez. Luego centrifugar la columna a 1.000 x g durante 2 min.
7. Calcule la concentración total de antígeno marcado dividiendo la cantidad de proteína de antígeno presente por el volumen final. Alícuota 50 μL de la proteína antígeno marcada purificada por tubo y conservar las alícuotas a -80 °C para uso prolongado.
   NOTA: Es importante tener en cuenta que por cada vez que la columna de espín pasa a través de la proteína antígeno, habrá una tasa de retención de aproximadamente 90-95%.

3. Definir la mejor concentración y proporciones para los dos antígenos marcados para el ensayo (ensayo de tablero de ajedrez)

NOTA: Dado que el ensayo ECL-IAA en este ensayo 7-Plex requiere el tratamiento ácido de muestras de suero, el ensayo de tablero de ajedrez para cada antígeno tiene que pasar por este paso antes de incubar con la mezcla de antígenos marcados.

1. Aplique el ensayo de tablero de ajedrez para cada antígeno por separado antes de ejecutar el ensayo multiplex. Los pasos 3.2-3.6 usarán GAD65 como ejemplo.
2. Calcular la dilución de la proteína GAD65 marcada. La concentración objetivo recomendada de la primera solución de mezcla de GAD65 biotinilada es de 2000 ng / ml y Ru Sulfo-NHS marcado GAD65 es de 1000 ng / ml. Si la concentración de GAD65 biotinilada y marcada con Ru Sulfo-NHS en solución madre es de 1.0 μg / μL, el volumen necesario para GAD65 biotinilado en 560 μL de solución de trabajo será de 1.12 μL, y el volumen necesario para Ru Sulfo-NHS marcado GAD65 en 700 μL de solución de trabajo será de 0.7 μL.
3. Mezclar 1,12 μL de proteína GAD65 biotinilada con 240 μL de enlazador conjugado con estreptavidina 1 en un tubo y 160 μL de BSA al 1%. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 30 min. Añadir 160 μL de solución de parada al tubo e incubar la mezcla a temperatura ambiente durante otros 30 minutos.
4. Haga una dilución en serie. Tome 280 μL de la mezcla a un tubo nuevo y agregue 280 μL de solución de parada para hacer una dilución 1:2. Prepare varios tubos nuevos. Repita este paso para ejecutar una dilución en serie horizontal para el antígeno GAD65 marcado con biotina (consulte la publicación anterior¹²).
5. Mezcle 0,7 μL de proteína GAD65 (1 μg/μL) marcada con Ru Sulfo-NHS con 700 μL de solución de parada. Luego tome 350 μL de la mezcla a un tubo nuevo y agregue 350 μL de solución de parada para hacer una dilución 1: 2. Prepare varios tubos nuevos, repita este paso para ejecutar una dilución en serie vertical para el antígeno GAD65 etiquetado con Ru Sulfo-NHS.
6. Preparar dos muestras de suero, una muestra altamente positiva para GADA y una muestra negativa para GADA, cada una con un volumen de 0,75 ml. Alícuota 15 μL de suero positivo en cada pocillo de la mitad izquierda de la placa de PCR de 96 pocillos. Alícuota 15 μL de suero negativo en cada pocillo de la mitad derecha de la placa de PCR de 96 pocillos.
7. Añadir 18 μL de ácido acético 0,5 M en cada pocillo y mezclar. Incubar durante 45 minutos en RT. Prepare una nueva placa de PCR de 96 pocillos. Agregue 17.5 μL del antígeno marcado con biotina y 17.5 μL del antígeno marcado con Ru Sulfo-NHS en cada pocillo de acuerdo con las diluciones seriadas (consulte la publicación anterior¹²).
8. Continúe el resto de los pasos del ensayo descritos en los pasos 5.2 a 9.1.
9. Determine la relación de señal de las muestras positivas altas contra las señales de muestra negativas correspondientes. Seleccione la mejor concentración para el antígeno marcado con biotina y el antígeno marcado con Ru Sulfo-NHS identificando el punto que tiene la proporción más alta o cercana a la más alta de señal positiva a negativa. En este cálculo de la relación, considere la señal de fondo baja obtenida de las muestras negativas.
   NOTA: Las concentraciones óptimas de proteínas de antígeno marcadas con Ru Sulfo-NHS y biotina de los ensayos de tablero de ajedrez se muestran a continuación: 30 ng / ml y 200 ng / ml para GAD65, 120 ng / ml y 120 ng / ml para proinsulina, 10 ng / ml y 42 ng / ml para IA-2, 80 ng / ml y 80 ng / ml para TG, 8 ng / ml y 16 ng / ml para TPO, 31 ng/mL y 31 ng/mL para ThG, y 12 ng/mL y 12 ng/mL para IFNα.

4. Crear la solución de antígeno acoplado a enlazador mixto

1. Seleccione la concentración óptima para cada antígeno en función del ensayo de tablero de ajedrez. Diluir la biotina y el antígeno marcado con Ru Sulfo-NHS a la concentración de trabajo racional.
2. Se unen diferentes enlazadores a cada una de las proteínas de antígeno biotiniladas únicas. Para un ensayo en placa de 96 pocillos, mezclar 4 μL de GAD65 biotinilada, TPO, tTG, ThG, proinsulina, IFN-α y proteína IA-2 con 240 μL de enlazador 1, 2, 3, 4, 8, 9 y 10 conjugado con estreptavidina en un tubo separado (Figura 1). Luego agregue 156 μL de PBS / 1% BSA por tubo. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 30 min.
3. Añadir 160 μL de solución de parada en cada tubo e incubarlos a temperatura ambiente durante otros 30 minutos. Tome 400 μL de antígeno acoplado al enlazador de cada tubo y combine los 7 antígenos juntos. Agregue 1.2 ml de solución de parada y luego agregue 4 μL de Ru Sulfo-NHS marcado con GAD65, TPO, tTG, ThG, proinsulina, IFN-α y antígeno IA-2 a la mezcla. Ahora la solución de antígeno está lista para ser utilizada en el ensayo.

5. Incubar muestras de suero con el antígeno marcado

NOTA: Dado que el ensayo ECL-IAA en este ensayo 7-Plex requiere el tratamiento ácido de muestras de suero, cada suero requiere el paso de tratamiento ácido antes de incubar con una mezcla de antígenos marcada para este ensayo 7-Plex.

1. Alícuota 15 μL de suero por pocillo para una placa de PCR de 96 pocillos. Añadir 18 μL de ácido acético 0,5 M en cada pocillo y mezclar. Incubar durante 45 min a RT. Preparar una nueva placa de PCR de 96 pocillos y alícuota 35 μL de solución de antígeno en cada pocillo.
2. Mientras la placa aún se está incubando, agregue 13 μL de tampón Tris pH 9.0 de 1 M a cada pocillo en la placa de antígeno. Agregue tampón al lado de cada pocillo para limitar la mezcla de tampón Tris y antígeno. Una vez completada la incubación, tome 25 μL del suero tratado con ácido e inmediatamente pipetearlo en cada pocillo de la placa de antígeno. Agite la solución y cubra la placa con una lámina de sellado de PCR para evitar la exposición a la luz.
3. En RT, coloque el plato en una coctelera, ajustado a baja velocidad, durante 1 h. Después, conservar el plato a 4 ºC y dejar incubar el plato durante 18-24 h.

6. Preparar la placa multiplex

1. Tome una placa múltiplex del refrigerador a 4 °C y permita que la placa llegue a RT. Una vez que la placa múltiplex esté en RT, agregue 150 μL de bloqueador A al 3% a cada pocillo. Cubra la placa multiplex con una lámina de sellado. Incubar el plato en un refrigerador a 4 °C durante la noche.
   NOTA: El día 1 del ensayo incluye los pasos 4 a 6.

7. Transfiera suero/antígeno incubado en la placa múltiplex

1. Al día siguiente, coloque toallas de papel sobre la mesa y saque la placa multiplex de incubación del refrigerador. Vacíe todo el búfer de la placa. Para hacer esto, voltee el plato boca abajo y déjelo sobre las toallas de papel preparadas hasta que no haya ningún amortiguador presente en ninguno de los pozos.
2. Lave la placa múltiple agregando 150 μL de PBST en cada pocillo. Deseche el búfer, como se mencionó en el paso 7.1., y repita este paso tres veces. Añadir 30 μL de suero/antígeno incubado en cada pocillo de la placa múltiplex. Cubra la placa con papel de aluminio para limitar su exposición a la luz. Coloque la placa en un agitador de placas, ajustado a baja velocidad, a RT durante 1 h.

8. Lave la placa y agregue el búfer de lectura

1. Retire las incubaciones de suero/antígeno de la placa múltiplex sosteniendo la placa boca abajo y sacando la solución. Agregue 150 μL de PBST en todos los pocillos y retire el tampón de la placa sosteniendo nuevamente la placa boca abajo y sacando la solución. Repita este paso tres veces. Después de completar el tercer lavado, agregue 150 μL de tampón de lectura en cada pocillo.
   NOTA: Las burbujas de aire interfieren con la capacidad de la máquina lectora de placas para analizar con precisión los resultados de la placa y deben evitarse a toda costa.

9. Lee la placa y analiza los datos

1. Cuente la placa preparada en la máquina lectora de placas, leyendo todos los valores en recuentos por segundo (CPS).
2. Calcule el índice relativo para el ensayo, utilizando los niveles de anticuerpos obtenidos de la máquina lectora de placas, con la siguiente ecuación:
   Valor del índice = [CPS (muestra) - CPS (estándar negativo)] / [CPS (estándar positivo) - CPS (estándar negativo)].
3. Determine qué resultados de anticuerpos son negativos o positivos utilizando los puntos de corte que se han establecido.
   NOTA: El día 2 del ensayo incluye los pasos 7 a 9.

Resultados

El análisis de los resultados del ensayo se mostró en la Tabla 1, Tabla 2 y Tabla 3. Los valores de lectura provienen de los datos de los 10 puntos dentro del mismo pozo. Los valores índice para cada muestra se calcularon contra sus correspondientes controles internos positivos y negativos como se describe en el protocolo de ensayo. En la Tabla 1 se muestran ejemplos de duplicados incorrectos y causaron el error de cálculo del índice final en la Tabla 3. Todos los valores de recuento bruto deben verificarse para evitar resultados falsos positivos o falsos negativos.

El ensayo ECL 7-multiplexado se validó utilizando una gran cohorte de muestras de 1026 pacientes recién diagnosticados con DT1 y 1022 sujetos de control sanos de edad y sexo. Los niveles de autoanticuerpos del ensayo ECL 7-Plex para 1026 pacientes con DT1 se compararon con los niveles de cada uno de nuestros correspondientes ensayos ECL únicos establecidos, como se muestra en la Figura 2 , y de cada RBA y ELISA estándar únicos correspondientes, como se muestra en la Figura 3. Las especificidades del ensayo se establecieron idénticas en los percentiles 99 para todos los ensayos de autoanticuerpos, excepto para los autoanticuerpos tiroideos (donde se utilizó^{el percentil} 95), de 1022 controles sanos para los tres métodos de ensayo (7-Plex ECL, ECL simple, RBA o ELISA) como se indica en la Tabla 4. Los CV entre ensayos de GADA, IA-2A, IAA, TPOA, ThGA, TGA e IFNαA son 6,4%, 4,5%, 9,1%, 4,9%, 5,7%, 11,3% y 5,9%, respectivamente.

Se encontró un pequeño número de muestras discordantes para cada uno de los 7 autoanticuerpos alrededor del límite de los puntos de corte para cada ensayo (Figura 2 y Figura 3). Once muestras de control (11/1022, 1,1%) se encontraron múltiples autoanticuerpos positivos solo en el ensayo 7-Plex y negativos en cada ensayo único correspondiente. Del mismo modo, ocurrió en 9 muestras de los pacientes con DT1 (9/1026, 0,9%). Además, 10 TPOA positivos altos y un ThGA en la cohorte de pacientes que se observaron tanto en el ensayo ECL único como en el RBA se omitieron en el ensayo 7-Plex. Estas muestras se convirtieron en positivas en el ensayo 7-Plex cuando se diluyeron aún más. En general, el 100% de la positividad en el ensayo ECL único o RBA se cubrió en el ensayo ECL 7-Plex, con la misma especificidad de ensayo que se ilustra en la Tabla 4.

Figura 1: Ilustración del ensayo Mutiplex ECL.
Los autoanticuerpos en suero unirán el antígeno Ru Sulfo-NHSged al antígeno biotinilado. Esto se combina con un enlazador específico para formar un complejo de antígeno-anticuerpo-antigeno-enlazador. Los complejos se capturan en la placa y se restringen a sus puntos específicos a través de cada enlazador específico. Se ilustran los números de enlazadores específicamente acoplados, para las 7 proteínas antígenos diferentes. La detección de señales de anticuerpos se logra utilizando antígenos marcados con Ru Sulfo-NHS con electroquimioluminiscencia. La figura es de Gu, Y. et ^al.13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Comparación de 7 niveles de autoanticuerpos en 1026 pacientes de nueva aparición con DT1 entre el ensayo ECL único y el ensayo ECL 7-Plex.
Los paneles a, b, c, d, e, f y g muestran comparaciones de los niveles de autoanticuerpos para GADA, IA-2A, IAA, TGA, TPOA, ThGA e IFNαA, respectivamente. Las líneas punteadas representan los puntos de corte del ensayo para cada ensayo de autoanticuerpos. Los puntos de corte se establecieron en el percentil 99 de 1022 controles sanos emparejados por edad para cada ensayo (excepto TPOA y ThGA que se establecieron en^{el percentil} 95), como se muestra en la Tabla 4, de 1022 controles sanos emparejados por edad para ensayos ECL simples y múltiples. Los diamantes rojos cerrados se marcan como "falsos" positivos en el ensayo 7-Plex ECL, el <1% de la cohorte estudiada, y se validaron como negativos tanto en ECL único como en RBA. Los cuadrados cerrados rojos se marcan como "falsos" negativos en el ensayo 7-Plex ECL causado por el fenómeno "prozona", que ocurre principalmente en el ensayo TPOA en el <1% de la cohorte estudiada. Ambos resultados falsos positivos y falsos negativos se discuten en la sección de discusión. La figura es de Gu, Y. et ^al.13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Comparación de 7 niveles de autoanticuerpos en 1026 pacientes de nueva aparición con DT1 entre el RBA (ELISA para IFNαA) y el ensayo 7-Plex ECL.
Los paneles a, b, c, d, e, f y g presentan comparaciones de los niveles de autoanticuerpos para GADA, IA-2A, IAA, TGA, TPOA, ThGA e IFNαA, respectivamente. Las líneas punteadas representan los puntos de corte del ensayo para cada ensayo de autoanticuerpos, el mismo conjunto de especificidad tanto para RBA como para el ensayo ECL 7-Plex, como se muestra en la Tabla 4, de 1022 controles sanos emparejados por edad. Los diamantes y cuadrados cerrados rojos representan "falsos" positivos y "falsos" negativos que aparecen en el ensayo 7-Plex ECL, lo mismo se muestra en la Figura 2. La figura es de Gu, Y. et ^al.13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

	1	2	3	4	5	6
Un	5580	5674	105	117	125	139	enlazador-1
	100	108	102	102	3956	3745	enlazador-2
	115	124	107	116	113	124	enlazador-3
	67	64	68	61	65	69	enlazador-4
	89	87	98	92	90	80	enlazador-5
	87	71	89	87	61	72	enlazador-6
	94	82	79	85	2154	2280	enlazador-7
	75	66	1628	1594	81	83	enlazador-8
	98	103	71	84	69	85	enlazador-9
	102	118	93	98	113	99	enlazador-10
B	324	337	147	148	5426	5366	enlazador-1
	101	102	93	88	86	74	enlazador-2
	111	119	119	123	66	72	enlazador-3
	72	65	59	68	74	67	enlazador-4
	81	98	83	92	79	72	enlazador-5
	90	84	93	86	70	76	enlazador-6
	101	105	101	97	956	944	enlazador-7
	82	83	189	204	97	90	enlazador-8
	92	83	78	64	82	78	enlazador-9
	83	79	88	93	4722	4965	enlazador-10
C	110	110	87	81	2114	2365	enlazador-1
	5526	5680	88	70	86	93	enlazador-2
	114	132	67	71	3326	3284	enlazador-3
	64	62	88	74	64	80	enlazador-4
	94	82	86	75	89	76	enlazador-5
	77	87	75	63	70	86	enlazador-6
	77	86	71	84	138	121	enlazador-7
	73	86	80	79	59	73	enlazador-8
	86	74	5064	4923	88	86	enlazador-9
	105	113	85	80	124	114	enlazador-10
D	98	88	92	84	136	127	enlazador-1
	288	291	86	86	558	564	enlazador-2
	109	101	74	73	141	127	enlazador-3
	78	66	66	55	74	66	enlazador-4
	79	83	79	86	96	91	enlazador-5
	83	86	96	89	86	73	enlazador-6
	87	89	77	87	841	855	enlazador-7
	74	72	60	72	90	95	enlazador-8
	68	75	331	328	2460	2580	enlazador-9
	86	98	80	75	123	133	enlazador-10
E	101	114	101	106	532	548	enlazador-1
	101	96	110	104	682	675	enlazador-2
	6015	5988	124	126	101	98	enlazador-3
	66	71	82	71	80	62	enlazador-4
	102	97	99	80	83	110	enlazador-5
	82	67	81	80	60	85	enlazador-6
	85	95	52	84	245	221	enlazador-7
	72	78	82	74	486	503	enlazador-8
	77	97	97	77	56	66	enlazador-9
	114	104	5726	5814	259	253	enlazador-10
F	119	120	133	118	112	96	enlazador-1
	101	91	100	95	96	82	enlazador-2
	406	395	111	123	2127	101	enlazador-3
	72	60	86	72	79	83	enlazador-4
	76	85	96	99	89	103	enlazador-5
	88	78	91	83	89	95	enlazador-6
	104	97	87	102	56	66	enlazador-7
	76	77	79	93	69	75	enlazador-8
	85	71	95	100	83	71	enlazador-9
	131	131	358	364	92	86	enlazador-10
G	90	95	85	82	105	107	enlazador-1
	99	86	77	76	1250	1174	enlazador-2
	119	123	120	118	112	108	enlazador-3
	76	83	77	80	86	76	enlazador-4
	88	86	86	93	107	92	enlazador-5
	73	73	71	82	84	75	enlazador-6
	5210	5173	72	69	76	85	enlazador-7
	80	81	79	82	100	101	enlazador-8
	96	97	89	83	65	83	enlazador-9
	98	103	86	88	1933	1979	enlazador-10
H	114	124	81	86	299	295	enlazador-1
	107	92	69	72	4256	4388	enlazador-2
	114	123	125	129	501	536	enlazador-3
	77	70	67	64	74	62	enlazador-4
	92	110	81	84	77	71	enlazador-5
	87	79	72	76	83	81	enlazador-6
	328	341	84	80	88	97	enlazador-7
	75	84	75	90	74	83	enlazador-8
	73	79	78	76	84	70	enlazador-9
	113	120	81	76	2372	2350	enlazador-10

Tabla 1: Análisis del ensayo ECL 7-plex: recuentos brutos de CPS (mitad izquierda de la placa). Los recuentos de CPS brutos se adquieren de una placa de ensayo (la mitad izquierda de la placa) y cada muestra se realiza por duplicado. Debajo de cada fila de la placa (A-H), hay 10 líneas de valores de lectura que representan los datos de los 10 puntos dentro del mismo pozo, correspondientes a cada número de enlazador marcado. Los ejemplos de duplicados incorrectos se resaltan en gris, como se ve en la fila F-linker 3-columnas 5 y 6.

Fila del cuadro 1A	Columna del cuadro 1A		Enlazador 1	Enlazador 2	Enlazador 3	Enlazador 7	Enlazador 8	Enlazador 9	Enlazador 10
Un	1-2	GADA PC	5627	104	120	88	71	101	110
B	1-2	GADA Low PC	331	102	115	103	83	88	81
C	1-2	TPOA PC	110	5603	123	82	80	80	109
D	1-2	TPOA PC bajo	93	290	105	88	73	72	92
E	1-2	TGA PC	108	99	6002	90	75	87	109
F	1-2	TG PC bajo	120	96	401	101	77	78	131
G	1-2	ThGA PC	93	93	121	5192	81	97	101
H	1-2	ThGA Low PC	119	100	119	335	80	76	117
Un	3-4	IAA PC	111	102	112	82	1611	78	96
B	3-4	IAA Low PC	148	91	121	99	197	71	91
C	3-4	IFNaA PC	84	79	69	78	80	4994	83
D	3-4	IFNaA PC bajo	88	86	74	82	66	330	78
E	3-4	IA-2A PC	104	107	125	68	78	87	5770
F	3-4	IA-2A PC bajo	126	98	117	95	86	98	361
G	3-4	NC	84	77	119	71	81	86	87
H	3-4	NC	84	71	127	82	78	77	79
Un	5-6	Muestra1	132	3851	119	2217	82	77	106
B	5-6	Muestra2	5396	80	69	950	94	80	4844
C	5-6	Muestra3	2240	90	3305	130	66	87	119
D	5-6	Muestra4	132	561	134	848	93	2520	128
E	5-6	Muestra5	540	679	100	233	495	61	256
F	5-6	Ejemplo6	104	89	1114	61	72	77	89
G	5-6	Ejemplo7	106	1212	110	81	101	74	1957
H	5-6	Muestra8	297	4322	519	93	79	77	2361

Tabla 2: Análisis del ensayo ECL de 7 plex: disposición de los datos de la Tabla 1, marcados como 7 enlazadores. Los datos de la Tabla 1 se reorganizaron, con los enlazadores 4 a 6 (no utilizados) eliminados, y los valores medios se calcularon a partir de cada lectura duplicada de la Tabla 1. Los valores de los controles positivos estándar internos altos y bajos, correspondientes a cada ensayo de autoanticuerpos, restringidos por un enlazador particular, están en negrita oscura. PC, control positivo. NC: control normal.

	Índice GAD	Índice TPOA	Índice TGA	Índice ThGA	Índice IAA	Índice IFNaA	Índice IA-2A
GADA PC	1.000	0.005	0.000	0.003	-0.006	0.003	0.004
GADA Low PC	0.045	0.005	-0.001	0.006	0.002	0.000	-0.001
IAA PC	0.005	1.000	0.001	0.002	-0.001	-0.001	0.004
IAA Low PC	0.002	0.039	-0.002	0.003	-0.005	-0.003	0.001
IA-2A PC	0.004	0.004	1.000	0.004	-0.004	0.000	0.004
IA-2A PC bajo	0.007	0.004	0.048	0.006	-0.002	-0.002	0.008
TGA PC	0.002	0.003	0.000	1.000	0.000	0.002	0.002
TG PC bajo	0.006	0.004	0.000	0.052	-0.001	-0.002	0.005
TPOA PC	0.005	0.005	-0.001	0.002	1.000	-0.002	0.001
TPOA PC bajo	0.012	0.003	0.000	0.006	0.076	-0.003	0.001
ThGA PC	0.000	0.000	-0.008	0.001	0.000	1.000	-0.001
ThGA Low PC	0.001	0.002	-0.008	0.002	-0.009	0.050	-0.002
IFNaA PC	0.004	0.006	0.001	0.000	-0.002	0.000	1.000
IFNaA PC bajo	0.008	0.004	0.000	0.005	0.004	0.002	0.048
NC	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
NC	0.000	-0.001	0.001	0.002	-0.002	-0.002	-0.001
Muestra1	0.009	0.683	0.000	0.419	0.001	-0.002	0.003
Muestra2	0.958	0.001	-0.008	0.172	0.009	-0.001	0.837
Muestra3	0.389	0.002	0.542	0.012	-0.009	0.000	0.006
Muestra4	0.009	0.088	0.003	0.152	0.008	0.496	0.007
Muestra5	0.082	0.109	-0.003	0.032	0.271	-0.005	0.030
Ejemplo6	0.004	0.002	0.169	-0.002	-0.006	-0.002	0.000
Ejemplo7	0.004	0.205	-0.002	0.002	0.013	-0.002	0.329
Muestra8	0.039	0.768	0.068	0.004	-0.001	-0.002	0.400

Tabla 3: Análisis del ensayo ECL 7-plex: resultados de los valores del índice. Los valores índice para cada muestra para los 7 ensayos de autoanticuerpos se calcularon contra sus correspondientes controles internos positivos y negativos como se describe en el protocolo de ensayo. Cualquier valor de índice que fuera mayor que el valor de corte se definió como un resultado positivo, mostrado en negrita oscura. El valor del índice TGA de la muestra6 se resaltó en gris, ya que es un error causado por duplicados incorrectos que se muestran en las columnas 5 y 6 del enlazador F de la fila F-linker en la Tabla 1.

	GADA		IA-2A		IAA		.TGA		TPOA		ThGA		IFNαA*
	Sens	Especificaciones	Sens	Especificaciones	Sens	Especificaciones	Sens	Especificaciones	Sens	Especificaciones	Sens	Especificaciones	Sens	Especificaciones
RBA	73.4%	98.5%	75.2%	99.0%	47.7%	99.1%	12.9%	99.0%	23.9%	95.2%	19.3%	94.7%	1.0%	99.6%
ECL simple	71.6%	99.1%	73.6%	99.3%	48.3%	99.7%	16.0%	98.9%	26.3%	94.9%	20.6%	95.1%	0.8%	99.2%
7-Plex ECL	71.2%	98.9%	77.3%	98.9%	49.5%	98.9%	16.5%	98.7%	26.1%	94.7%	21.1%	94.7%	1.7%	99.1%

Tabla 4: Sensibilidad y especificidad del ensayo entre 1026 pacientes con DT1 y 1022 controles, emparejados por edad y sexo, en un ensayo ECL 7-plex, en comparación con el ensayo ECL único correspondiente y RBA o ELISA*. Seestablecieron diferentes ensayos (RBA, ECL simple y ECL 7-Plex) para cada autoanticuerpo con especificidades similares utilizando los controles sanos 1022 emparejados por edad y sexo. El resultado de especificidad de la cohorte de control estudiada se estableció alrededor del 95% para TPOA y ThGA y en 99% para los otros 5 ensayos. *Asterisk marca el ensayo IFNαA para ELISA, mientras que otros son RBA.

Discusión

En numerosos ensayos clínicos nacionales e internacionales para la diabetes tipo 1, la realización del ensayo ECL único para detectar autoanticuerpos de los islotes y autoanticuerpos contra la transglutaminasa (TGA) para la enfermedad celíaca, ha sido corroborada 8,9,10,11. A lo largo de estos ensayos, este ensayo ha aumentado la sensibilidad y la especificidad para la detección de autoantígenos cuando se evalúa contra el RBA estándar de "oro" existente. La especificidad mejorada de la enfermedad se puede observar cuando se discriminan autoanticuerpos de islotes de alta afinidad y alto riesgo de señales de bajo riesgo y baja afinidad, entre el único ensayo ECL y el RBA^14,15,16,17. Sobre la base del ensayo ECL único, planteamos un nuevo ensayo de autoanticuerpos ECL multiplexado de alto rendimiento, para permitirnos detectar DT1, así como varias enfermedades autoinmunes aplicables al mismo tiempo.

El ensayo ECL multiplex utiliza la placa multiplex, que puede combinar hasta 10 ensayos de autoanticuerpos en un solo pocillo. Para el presente estudio, se combinan 7 ensayos de autoanticuerpos. Los autoanticuerpos comprenden 3 IAbs (IAA, GADA e IA-2A), 2 autoanticuerpos autoinmunes para la enfermedad tiroidea (TPOA y ThGA), autoanticuerpos para la enfermedad celíaca (TGA) y APS-1 autoanticuerpos contra el interferón alfa (IFNαA). El mecanismo de ensayo se basa, en general, en un único ensayo ECL como se publicó anteriormente 9,10,12,18 con algunas modificaciones. La principal diferencia de un ensayo ECL multiplex de un solo ensayo ECL es que cada complejo anticuerpo-antígeno formado en la fase fluida está restringido a un enlazador específico (Figura 1). El antígeno marcado con biotina se incuba con el conjugado Streptavidin, un enlazador utilizado para formar un complejo específico de enlace antígeno. El complejo inmune anticuerpo-antígeno se forma después de la incubación con suero del paciente y se captura en un punto específico a través del sistema de enlace específico en cada pocillo de la placa múltiplex. El antígeno marcado Ru Sulfo-NHS capturado por anticuerpos al mismo tiempo proporciona la señal con electroquimioluminiscencia. La máquina lectora de placas puede detectar hasta 10 señales diferentes de las fuentes puntuales ubicadas en cada pozo. Para mantener los ensayos de autoanticuerpos consistentes entre las placas y mientras se realizan estudios a largo plazo, sugerimos que se use el mismo enlazador.

Antes de configurar un ensayo ECL multiplex, los ensayos ECL individuales para cada autoanticuerpo deben optimizarse en una placa múltiplex, respectivamente, y validarse contra ensayos RBA y ECL únicos en una placa ECL regular. Para mejorar el ensayo de tablero de ajedrez, para el ensayo de autoanticuerpos relacionado en la placa múltiple, se utilizó una muestra de paciente altamente positiva y una muestra de paciente negativa. Después de realizar el ensayo de tablero de ajedrez, se calcularon las concentraciones más ideales para Ru Sulfo-NHS y antígeno marcado con biotina para cada uno de los 7 ensayos de autoanticuerpos. Lo siguiente muestra estas concentraciones: 30 ng/mL y 200 ng/mL para GAD65, 120 ng/mL y 120 ng/mL para proinsulina, 10 ng/mL y 42 ng/mL para IA-2, 80 ng/mL y 80 ng/mL para TG, 8 ng/mL y 16 ng/mL para TPO, 31 ng/mL y 31 ng/mL para ThG, y 12 ng/mL y 12 ng/mL respectivamente para IFNα¹³. Las concentraciones de algunos de los antígenos del ensayo de tablero de ajedrez pueden necesitar ser ajustadas aún más de acuerdo con los resultados en el ensayo múltiplex real después de combinar todos los ensayos.

Como la AIA está incluida en el presente ensayo ECL múltiple, el tratamiento ácido de las muestras de suero es obligatorio antes de incubar el suero con antígeno, como se informó en el estudio anterior¹². Generalmente, cuando se agrega un autoanticuerpo adicional a un ensayo múltiple, el fondo del ensayo se ve afectado y una señal extremadamente alta de un punto, en el pozo, puede obstruir los resultados de los puntos cercanos a través de la diafonía. Por lo tanto, el CPS máximo debe limitarse a 20,000 recuentos para cada autoanticuerpo, o inferior, para las muestras positivas más altas. Según nuestro conocimiento, para reducir la cantidad de diafonía involucrada, los autoanticuerpos que tienen un fondo más bajo deben separarse, al diseñar el mapa puntual, lejos de los puntos con una mayor frecuencia de conteos.

Los controles positivos y negativos altos se utilizaron internamente en cada ensayo para calcular un índice preciso para las muestras desconocidas que se estaban analizando. Para evaluar y monitorear con precisión la sensibilidad del ensayo, se utilizaron controles positivos bajos, establecidos cerca del límite superior del ensayo. Estos controles positivos y negativos estándar se crearon a granel y alícuotas para uso a largo plazo y se almacenaron a -20 °C o menos, para mantener la coherencia entre los ensayos. Para fines de garantía de calidad, las muestras se realizaron dos veces en cada ensayo y cada resultado positivo se repitió y confirmó mediante la ejecución de la muestra en un nuevo ensayo ECL al día siguiente. Si había algún desacuerdo con el primer y segundo ensayo confirmatorio, era necesario un tercer ensayo. De los tres ensayos realizados, los resultados de los dos ensayos que concuerdan (por ejemplo, +, + o -,-), determinaron el resultado final (positivo o negativo) de la muestra.

En la última década, muchos grupos de estudio están buscando un ensayo de alto rendimiento utilizando el método multiplex para combinar múltiples ensayos de autoanticuerpos juntos en un pocillo para detectar grandes poblaciones. Hay algunos estudios que utilizan diferentes tipos de tecnologías para realizar ensayos de autoanticuerpos multiplex 19,20,21,22^, pero no hay comparación para ninguno de estos ensayos en sensibilidad y especificidad contra el actual RBA estándar de "oro", cuando se estudia la ^DT1. Estos diferentes tipos de plataformas utilizadas no se validan a través del taller internacional del Programa de Estandarización de Autoanticuerpos de los Islotes (IASP) o mediante pruebas de grandes cohortes en ensayos clínicos. En un reciente cribado poblacional general en Alemania, se está utilizando un ensayo combinado de alto rendimiento, 3 Screen ICATM ELISA distribuido por Kronus, como herramienta para el cribado de primera línea para detectar tres IAbs, GADA, IA-2A y ZnT8A, para lograr el diagnóstico precoz de la DT1 infantil²³. El ensayo ELISA de 3 pantallas mide 3 autoanticuerpos en 3 pocillos separados, consumiendo un gran volumen de suero, o en un solo pocillo con los 3 ensayos mezclados. Si un pozo en el ensayo ELISA de 3 pantallas es positivo, no se puede distinguir cuál de los tres autoanticuerpos están presentes. La mayor desventaja de este ensayo es su incapacidad para incluir la medición de IAA. Todos los resultados de IAA realizados por ELISA, como se demostró en los talleres de IASP, no tienen una sensibilidad y especificidad aceptables²⁴. La AIA suele ser la primera BAI que aparece y tiene una alta prevalencia entre los niños pequeños. La evaluación IAb, con IAA, es necesaria para los niños y no se considera aceptable realizar esta detección sin IAA para evaluar el riesgo de DT1 en la comunidad. Además, no hay estudios o datos publicados que demuestren que el ensayo del kit Kronus IAb sea más específico de la enfermedad T1 y capaz de discriminar el alto riesgo de los BAI de bajo riesgo. El ensayo 7-Plex ECL, en el presente estudio, se validó utilizando una gran cohorte de pacientes recién diagnosticados con DT13. En comparación con el RBA estándar actual y el ensayo ECL único bien establecido, el ensayo 7-Plex puede retener el 100% de positividad con la misma especificidad de ensayo (Tabla 4). Actualmente, el ensayo ECL 4-Plex, paralelo con el RBA estándar, se está aplicando a un gran ensayo clínico en curso: Autoimmunity Screening for Kids (ASK). Este ensayo examina a niños en la población general, del área metropolitana de Denver, para detectar DT1 y enfermedad celíaca. En comparación con el RBA estándar utilizado en el estudio ASK, el ensayo ECL multiplex muestra una excelente sensibilidad y una mayor especificidad de la enfermedad, idéntica a nuestros informes anteriores utilizando el único estudio ECL²⁵. Además, nuestro ensayo ECL 4-Plex demostró una reducción pronunciada en mano de obra, costo y volumen sérico en un 70%, en comparación con los 4 ensayos únicos correspondientes para ECL y RBA. Usando el ensayo ECL multiplexado, podemos personalizar cada pocillo con diferentes números, que representan diferentes autoanticuerpos (hasta 10), para detectar diferentes enfermedades autoinmunes que son específicas para las necesidades de una ubicación clínica en particular.

Hay algunas limitaciones observadas, mostradas en el presente estudio, para un ensayo ECL multiplexado utilizando la placa múltiplex. La dilución final del suero, incubado con antígeno, no se puede ajustar para producir las condiciones más óptimas para cada ensayo de autoanticuerpos que se combina en un solo pocillo. Se observó que nueve muestras (9/1026), de pacientes con DT1, tenían un resultado falso negativo para autoanticuerpos particulares. 7 de los falsos negativos fueron para TPOA y 2 fueron para ThGA, en el ensayo 7-Plex ECL, pero se exhibieron resultados positivos altos tanto en el ensayo ECL único como en el RBA (Figura 2 y 3). Después de una dilución adicional de las 9 muestras, se volvieron positivas en la placa múltiplex. Este resultado es causado por lo que describimos como el fenómeno 'prozona'. Este fenómeno hace que la muestra muestre un resultado falso negativo porque los títulos altos de anticuerpos están afectando la formación de redes antígeno-anticuerpo. Al configurar un ensayo múltiple, se recomienda que las muestras con títulos muy altos, para cada uno de los autoanticuerpos combinados, se realicen pruebas previas para identificar la dilución opcional del suero para la incubación de antígenos. Alternativamente, se deben seleccionar ensayos de autoanticuerpos con condiciones optimizadas similares para formar un ensayo combinado a partir del cual se logre la mejor sensibilidad y especificidad del ensayo para cada autoanticuerpo. En el presente estudio, 7 muestras (7/1022), de controles normales sanos, dieron lugar a falsos positivos para múltiples autoanticuerpos en el ensayo 7-Plex, pero después de ejecutar un solo ensayo ECL y RBA (Figura 2 y 3) se encontró que estos autoanticuerpos eran negativos en ambos ensayos. Las razones detrás de estos resultados falsos positivos que ocurren en la placa múltiplex, para este pequeño subconjunto de muestras, son actualmente desconocidas. Para la aplicación actual del ensayo ECL múltiple, todas las muestras positivas se repiten con su correspondiente ensayo ECL único para confirmar la positividad, lo que elimina este error falso positivo del ensayo ECL múltiple.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4 °C refrigerator
–80 °C and -20 °C freezers
96-well Plate Shaker	Wallac - Delfi
96-well round bottom plate	Fisher	8408220
Acetic acid solution	Fisher
Aluminum foil
Antigen proteins
Human GAD65 full length protein	Diamyd
Human ThG full length protein	BioMart
Human TPO full length protein	BioMart
IA-2 intracellular domain protein	BioMart
IFN-α protein	Abcam
Proinsulin protein	AmideBio
tTG protein	DiaRect
Biotin	Sigma
Bottle-Top 500 mL , Filter Units	Fisher	0974064A or B
Bovine Serum Albumin	Sigma	A-7906
Distilled deionized (DD) water
HCl	Fisher
Ice maker
Ice trays
MSD Sector	Perkin-Elmer
Multi-channel pipette
NaOH
Paper tower
PBS
pH meter
Pipette-Aid
Pipettes/tips
Ru Sulfo-NHS	MSD (R91AN)
Trizma Base	Fisher	BP152-5
Tween 20	Sigma	P-1379
Uplex Development Kit	MSD
96-well UPlex plate	MSD
Blocker A	MSD	R93AA
Linker-Streptavidin	MSD
Read buffer	MSD	R92TC
Stop Solution	MSD
Vortex mixer
ZeBa Column	Pierce	89892