Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تقدم هذه الورقة بروتوكولين محسنين لفحص الخلايا المناعية المقيمة والمشتقة من المحيط داخل الجهاز العصبي المركزي ، بما في ذلك الدماغ والحبل الشوكي والسحايا. يساعد كل من هذه البروتوكولات على التأكد من وظيفة وتكوين الخلايا التي تشغل هذه المقصورات في ظل حالة مستقرة وظروف التهابية.

Abstract

يتكون الجهاز العصبي المركزي (CNS) من الدماغ والحبل الشوكي وتحيط به السحايا ، وهي طبقات غشائية تعمل كحاجز بين المحيط والجهاز العصبي المركزي. الجهاز العصبي المركزي هو موقع متخصص في المناعة ، وفي ظروف الحالة المستقرة ، يكون الامتياز المناعي أكثر وضوحا في حمة الجهاز العصبي المركزي. في المقابل ، تؤوي السحايا مجموعة متنوعة من الخلايا المقيمة ، بما في ذلك الخلايا المناعية الفطرية والتكيفية. أثناء الحالات الالتهابية الناجمة عن إصابة الجهاز العصبي المركزي ، أو المناعة الذاتية ، أو العدوى ، أو حتى التنكس العصبي ، قد تدخل الخلايا المناعية المشتقة من المحيط إلى الحمة وتستقر داخل السحايا. يعتقد أن هذه الخلايا تؤدي إجراءات مفيدة وضارة أثناء التسبب في مرض الجهاز العصبي المركزي. على الرغم من هذه المعرفة ، غالبا ما يتم تجاهل السحايا عند تحليل حجرة الجهاز العصبي المركزي ، لأن طرق استخراج أنسجة الجهاز العصبي المركزي التقليدية تحذف الطبقات السحائية. يقدم هذا البروتوكول طريقتين متميزتين للعزل السريع لأنسجة الجهاز العصبي المركزي للفئران (أي الدماغ والحبل الشوكي والسحايا) المناسبة للتحليل النهائي عبر تقنيات الخلية الواحدة والكيمياء الهيستولوجية المناعية وطرق التهجين في الموقع. توفر الطرق الموصوفة تحليلا شاملا لأنسجة الجهاز العصبي المركزي ، وهي مثالية لتقييم النمط الظاهري والوظيفة وتوطين الخلايا التي تشغل حجرة الجهاز العصبي المركزي في ظل ظروف الاستتباب وأثناء التسبب في المرض.

Introduction

الجهاز العصبي المركزي (CNS) هو موقع متخصص في المناعة. يعتبر النسيج البرنشيمي للجهاز العصبي المركزي ، باستثناء مساحة السائل الدماغي الشوكي والسحايا والأوعية الدموية ، تقليديا على أنه موقع متميز مناعيا1،2،3،4،5 وهو خال نسبيا من الخلايا المناعية خلال ظروف الاستتباب 2،6،7. في المقابل ، فإن السحايا ، التي تتكون من طبقات الجافية والعنكبوتية والحنون ، هي مكونات حاسمة في حجرة الجهاز العصبي المركزي ، وتشارك بنشاط في المراقبة المناعية التماثلية والعمليات الالتهابية أثناء التسبب في المرض3،6،7،8. خلال ظروف الحالة المستقرة ، تدعم السحايا العديد من الخلايا الخافرة المناعية ، بما في ذلك الخلايا اللمفاوية الفطرية (ILC) ، والبلاعم ، والخلايا المتغصنة (DC) ، والخلايا البدينة ، والخلايا التائية ، وبدرجة أقل ، الخلايا البائية9،10،11.

السحايا عبارة عن هياكل شديدة الأوعية الدموية وتحتوي على أوعية لمفاوية توفر اتصالا لمفائيا بين الجهاز العصبي المركزي ومحيطه8،12،13،14. في الحالات الالتهابية الناجمة عن إصابة الجهاز العصبي المركزي ، أو الالتهابات ، أو المناعة الذاتية ، أو حتى التنكس العصبي ، تتسلل الخلايا المناعية المشتقة من المحيط إلى الحمة وتغير المشهد المناعي داخل السحايا. بعد تسلل الخلايا ، قد تمثل السحايا مكانا وظيفيا للخلايا المناعية المشتقة من المحيط ، مما يعزز تراكم الخلايا المناعية ، وتنشيط الخلايا المناعية المحلية ، والبقاء على قيد الحياة على المدى الطويل في حجرة الجهاز العصبي المركزي. لوحظ التهاب سحائي بارز في أمراض متعددة تؤثر على الجهاز العصبي المركزي ، بما في ذلك التصلب المتعدد (MS) 15،16،17،18،19 ، السكتة الدماغية 20،21 ، إصابة معقمة 22،23 (أي إصابة الحبل الشوكي وإصابات الدماغ الرضحية) ، الصداع النصفي 24 ، والعدوى الميكروبية 25،26 ،27,28,29. وبالتالي ، فإن توصيف الخلايا المقيمة والخلايا المناعية المشتقة محيطيا في المقصورة السحائية أمر ضروري لفهم دور هذه الخلايا أثناء ظروف الحالة المستقرة والتسبب في المرض.

يعد استخراج الدماغ والحبل الشوكي والسحايا من الجمجمة والأجسام الفقرية أمرا صعبا من الناحية الفنية ويستغرق وقتا طويلا. لا توجد حاليا تقنيات متاحة للاستخراج السريع للدماغ مع سلامة جميع طبقات السحايا الثلاث. في حين أن استئصال الصفيحة الفقرية ينتج مورفولوجيا ممتازة لأنسجة الحبل الشوكي ويحافظ على الطبقات السحائية ، إلا أنه يستغرق وقتا طويلا للغاية ومعقدا30,31. على العكس من ذلك ، فإن طرق الاستخراج التقليدية مثل إزالة الدماغ من الجمجمة والبثق الهيدروليكي للحبل الشوكي تسهل الاستخراج السريع لأنسجة الجهاز العصبي المركزي ، ولكن يتم فقدان كل من السحايا العنكبوتية والجافية بهذه التقنيات30,31. يؤدي إغفال طبقات الجافية والعنكبوتية أثناء العزل التقليدي لأنسجة الدماغ والحبل الشوكي إلى تحليل غير مكتمل للخلايا داخل حجرة الجهاز العصبي المركزي. وبالتالي ، فإن تحديد التقنيات الجديدة التي تركز على الاستخراج السريع لأنسجة الجهاز العصبي المركزي مع السحايا السليمة أمر بالغ الأهمية للتحليل الأمثل لحجرة الجهاز العصبي المركزي.

تقدم هذه المخطوطة طريقتين للاستخراج السريع للدماغ والحبل الشوكي والسحايا من الفئران، مما يسهل التحليل النهائي للخلايا المقيمة والخلايا المناعية المشتقة من الأطراف في حمة الجهاز العصبي المركزي والسحايا. تركز هذه البروتوكولات المحسنة على 1) عزل معلقات الخلية الواحدة للتحليل النهائي و 2) تحضير الأنسجة للمعالجة النسيجية. يسمح الحصول على معلقات أحادية الخلية من الدماغ وأنسجة الحبل الشوكي والسحايا الجافية والعنكبوتية32 بالتحليل المتزامن للخلايا الموجودة في كل من المقصورات المتنية والسحائية. يمكن استخدام معلقات الخلية الواحدة في تطبيقات مختلفة ، بما في ذلك مقايسات زراعة الخلايا لأداء التحفيز في المختبر 33 ، والبقعة المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISpot) 28،34،35 ، وقياس التدفق الخلوي36،33 ، والخلية الواحدة 37 أو النسخ السائب. بالإضافة إلى ذلك ، فإن البروتوكول الأمثل لإزالة الكلس من الأدمغة الكاملة والحبل الشوكي مع الجماجم السليمة أو الأعمدة الفقرية ، على التوالي ، يسمح بإزالة الكلس بلطف من العظام المحيطة ، وترك السحايا سليمة والحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة. تسمح هذه الطريقة بالتحديد الانتقائي للبروتينات أو الحمض النووي الريبي باستخدام الكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC) أو تقنيات التهجين في الموقع (ISH) داخل كل من المساحات المتنية والسحائية. قد يوفر توصيف النمط الظاهري وحالة التنشيط وتوطين الخلايا المقيمة والخلايا المناعية المشتقة طرفيا داخل الجهاز العصبي المركزي معلومات أساسية لفهم كيفية مساهمة أنواع الخلايا الفردية في حجرة الجهاز العصبي المركزي في الاتزان الداخلي والتسبب في المرض.

Protocol

تستخدم جميع الأعمال الحيوانية البروتوكولات التي تمت مراجعتها والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان (IACUC) في كلية جيزل للطب في دارتموث.

1. معالجة عينات الدماغ والحبل الشوكي لإزالة الكلس

  1. عزل عينات الدماغ والحبل الشوكي
    1. القتل الرحيم للفأر عن طريق استنشاق CO2 . تأكد من أن معدل تدفق CO2 يحل محل 10٪ -30٪ من حجم القفص في الدقيقة.
    2. باستخدام الملقط ، ارفع عملية الخنجري ، واقطع جدار البطن بشكل جانبي أسفل القفص الصدري بالمقص مباشرة ، واسحب لأعلى لتجنب قطع الأوعية الدموية أو الأعضاء الكامنة. قطع من خلال الحجاب الحاجز بشكل جانبي.
    3. قطع القفص الصدري على طول الحواف الجانبية الموازية للرئتين حتى الترقوة. باستخدام ملقط ، ارفع القص وثبت القص بمرقئ. ضع المرقئ فوق الرأس لرفع القفص الصدري بعيدا وكشف القلب.
    4. باستخدام الملقط ، أمسك القلب بالقرب من قمته وقم بعمل شق في الأذين الأيمن للقلب لتوفير منفذ. أدخل إبرة 25 جم مع حقنة سعة 10 مل متصلة لإدارة 10 مل ببطء من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بالثلج البارد 1x في البطين الأيسر لاختراق الفأر عبر القلب.
      ملاحظة: يجب أن يحدث التروية أكثر من 4-5 دقائق حتى يتم تطهير الكبد من الدم. عادة ما يكون إجمالي 10 مل من 1x PBS كافيا للتروية ، ولكن يمكن استخدام المزيد إذا لزم الأمر. عادة ما يشير الكبد الصافي إلى التروية الكافية.
    5. باستخدام مقص حاد ، قم بإزالة الرأس عن طريق قطع الرأس (الشكل 1 ؛ 1). قم بعمل شق في خط الوسط في الجلد (الشكل 1 ؛ 2) واقلب الجلد فوق العينين لتحرير الجمجمة.
    6. قطع عظم الأنف لتحرير الفك السفلي من الجمجمة (الشكل 1 ؛ 3). قم بإزالة الفك السفلي واللسان والعينين. قطع على طول الجوانب الجانبية للجمجمة لتحرير الأنسجة على طول الصماخ السمعي الخارجي (الشكل 1 ؛ 4). تقليم لإزالة جميع الجلد الزائد والعضلات والأنسجة التي تراكب الجمجمة.
    7. افصل القفص الصدري عن العمود الفقري عن طريق القطع بالتوازي مع العمود الفقري بمقص حاد (الشكل 1 ؛ 5 و 6). قم بعمل قطع صغير في منطقة أسفل الظهر لعزل العمود الفقري (الشكل 1 ؛ 7). قم بقص وإزالة أي عضلات متبقية على طول العمود الفقري لكشف الفقرات (الشكل 1 ؛ 8).
      ملاحظة: تعد إزالة الأنسجة الزائدة من العمود الفقري والجمجمة ضرورية للحصول على اختراق كاف لمحلول إزالة الكلس المثبت بارافورمالدهيد (PFA) وحمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA).
  2. ما بعد التثبيت وإزالة الكلس والحفظ بالتبريد
    1. باستخدام الملقط ، ضع الدماغ مع الجمجمة السليمة أو العمود الفقري في أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 10 مل من 4٪ PFA. ضع الأنابيب على حرارة 4 درجات مئوية لمدة 48 ساعة على الأقل للتثبيت الكافي.
      ملاحظة: لتجنب التثبيت الزائد للأنسجة ، لا تتجاوز 72 ساعة من التثبيت. يتم تمديد أوقات التثبيت لعينات العظام قبل إزالة الكلس. التثبيت الكافي سيحمي الأنسجة من آثار إزالة الكلس ويضمن مورفولوجيا الأنسجة بشكل أفضل.
    2. شطف الدماغ أو الحبل الشوكي عن طريق إزالة الأنسجة من 4 ٪ PFA مع ملقط ووضع الأنسجة في أنبوب 14 مل يمكن التخلص منه مع 10 مل من 1x PBS لمدة 5 دقائق. نقل الدماغ أو الحبل الشوكي إلى أنبوب مخروطي 50 مل مع 10 مل من 10٪ EDTA (درجة الحموضة = 7.2-7.4).
      ملاحظة: إن استخدام أنبوب أكبر يحتوي على 10 مل من EDTA يمنح EDTA مساحة تلامس أكبر مع الأنسجة ويسرع عملية إزالة الكلس.
    3. تحقق يوميا مما إذا كان العظم ناعما ومرنا: قم بإزالة الأنسجة من محلول EDTA بالملقط ، وضعها على طبق بتري ، واختبر نعومة العظام برفق بإبرة 25 جرام. إذا اخترقت الإبرة العظم بسهولة ، تكتمل عملية إزالة الكلس.
    4. قم بإزالة الأنسجة من محلول EDTA وانقل الدماغ أو الحبل الشوكي إلى أنبوب سعة 14 مل يمكن التخلص منه يحتوي على 10 مل من 1x PBS واغسله لمدة 10 دقائق. كرر الغسيل.
      ملاحظة: عادة ما يستغرق إزالة الكلس 2-3 أيام. يجب تغيير المحلول كل 2-3 أيام إذا لم يتم إزالة الكلس من العظم بشكل كاف. ومع ذلك ، فإن الحضانة المطولة في EDTA بعد إزالة الكلس من العظم يمكن أن تلحق الضرر بمورفولوجيا الأنسجة.
    5. تحضير 10٪ و 20٪ و 30٪ محاليل السكروز عن طريق إضافة السكروز إلى 1x PBS. على سبيل المثال ، بالنسبة إلى 10٪ سكروز ، أضف 10 جم من السكروز وارفع الحجم إلى 100 مل باستخدام 1x PBS معقم. قم بتخزين المحلول في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر.
      ملاحظة: محاليل السكروز عرضة لنمو الكائنات الحية الدقيقة ، لذلك لا ينبغي تخزين العينات لفترات طويلة من الزمن في هذه المحاليل.
    6. قم بإزالة المنديل من 1x PBS ، ضعه في 10 مل من محلول السكروز 10٪ وقم بتخزينه في 4 درجات مئوية. دع المنديل يجلس لمدة 24 ساعة أو حتى يغرق في قاع الأنبوب.
    7. كرر هذه العملية ، وانقل الأنسجة إلى محلول السكروز بنسبة 20٪ أولا وأخيرا إلى محلول السكروز بنسبة 30٪. اترك الأنسجة تغرق في 30٪ سكروز (24 ساعة على الأقل) وانتقل إلى تضمين الأنسجة.
  3. تضمين الأنسجة وتجميدها
    1. باستخدام الملقط ، قم بإزالة الأنسجة من السكروز بنسبة 30٪ ، وضعها على طبق بتري ، وقم بإمالة الطبق للتخلص من أي محلول سكروز زائد على الأنسجة. باستخدام مشرط ، وقطع الأنسجة إلى شرائح المطلوبة.
    2. قم بإنشاء طبقة رقيقة من مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) في الجزء السفلي من cryomold وضع قطعة (قطع) الأنسجة في القالب. قم بتغطية الأنسجة بالكامل بمركب OCT ، مع ضمان عدم وجود فقاعات.
    3. قم بتجميد الكتل بسرعة عن طريق التمرير فوق النيتروجين السائل38 أو وضع الكتل على ملاط الأيزوبروبانول / الثلج الجاف بنسبة 100٪39 حتى تصبح الكتلة معتمة. لف قوالب التبريد بورق الألمنيوم وقم بتخزين الكتل عند -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل. انقل الكتل إلى -20 درجة مئوية قبل التقسيم.
      ملاحظة: يجب توخي الحذر عند تقسيم وتنفيذ بروتوكولات الأنسجة على الأدمغة منزوعة الكلس حيث قد تفقد طبقات الجمجمة والسحائية إذا تم التعامل مع الأقسام تقريبا.

2. تحضير أنسجة السحايا والجهاز العصبي المركزي لتلطيخ التدفق الخلوي

  1. استخراج غطاء الجمجمة والدماغ
    1. باستخدام مقص حاد ، قم بإزالة الرأس عن طريق قطع الرأس (الشكل 2 أ ؛ 1). باستخدام المقص ، قم بعمل شق في خط الوسط في الجلد (الشكل 2 أ ؛ 2) واقلب الجلد فوق العينين لتحرير الجمجمة.
    2. ضع المقص داخل الثقبة الكبرى وابدأ في قطع الجمجمة بشكل جانبي على طول القشرة باتجاه البصلة الشمية ، مع إبقاء الشقوق فوق الصماخ السمعي الخارجي والفك السفلي (الشكل 2 أ ؛ 3). قم بإجراء نفس الجروح على الجانب الآخر ، مع التقاء الجروح في البصلة الشمية لتحرير غطاء الجمجمة من الدماغ (الشكل 2 أ ؛ 3).
    3. باستخدام الملقط ، قشر غطاء الجمجمة للخلف وضع غطاء الجمجمة في أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 5 مل من وسط RPMI البارد المكمل ب 25 mM HEPES. الحفاظ على الأنبوب على الجليد.
    4. باستخدام ملقط منحني ، ضع الملقط أسفل قاعدة الدماغ ، وارفعه لتحرير الدماغ من غطاء الجمجمة. ضع الدماغ في أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 5 مل من RPMI البارد المكمل ب 25 مللي متر HEPES. احتفظ بالأنبوب على الثلج حتى المعالجة.
  2. استخراج العمود الفقري وأنسجة الحبل الشوكي
    1. باستخدام ملقط ومقص حاد ، افصل القفص الصدري عن العمود الفقري عن طريق القطع بالتوازي مع العمود الفقري (الشكل 2 أ ؛ 4 و 5). قم بعمل قطع صغير في منطقة أسفل الظهر لعزل العمود الفقري (الشكل 2 أ ؛ 6). تقليم وإزالة أي عضلات متبقية على طول العمود الفقري لكشف الفقرات (الشكل 2 أ ؛ 7).
    2. ضع المقص الجراحي الدقيق الإضافي داخل العمود الفقري واقطعه على طول الحافة الجانبية للعمود (الشكل 2 ج). اقطع الحافة الجانبية المقابلة تماما لتقسيم العمود الفقري إلى جزء أمامي وخلفي.
      ملاحظة: سيبقى الحبل الشوكي متصلا بالعمود الفقري.
    3. باستخدام الملقط ، قم بتقشير الحبل الشوكي ببطء وبعناية من العمود الفقري وضع الأنسجة في أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 5 مل من RPMI البارد مع 25 mM HEPES. انقل الأجزاء الأمامية والخلفية من العمود الفقري إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 5 مل من RPMI البارد مع 25 مللي متر HEPES.
  3. إزالة السحايا لإعداد معلقات أحادية الخلية
    1. باستخدام الملقط ، قم بإزالة غطاء الجمجمة من وسائط RPMI. باستخدام ملقط حاد (# 7 ملقط ؛ جدول المواد) ، سجل حول الحافة الخارجية لغطاء الجمجمة (الشكل 2 ب) وقشر السحايا بعيدا عن حافة غطاء الجمجمة ، وكشط لإزالة السحايا الجافية والعنكبوتية. ضع السحايا على طبق بتري.
      ملاحظة: إزالة السحايا من كل من الدماغ والحبل الشوكي يتطلب الممارسة. إذا واجه المستخدم صعوبة في استخراج السحايا ، فاستخدم مجهر تشريح للمساعدة في الإزالة.
    2. قم بإزالة العمود الفقري من الأنبوب. باستخدام ملقط حاد ، سجل حول حواف العمود الفقري لتحرير السحايا وتقشير السحايا من حافة الفقرة باستخدام ملقط منحني. ضع السحايا على طبق بتري.
    3. ضع مصفاة شبكية من النايلون في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. حرك السحايا إلى المصفاة وأضف 3 مل من RPMI مع 25 mM HEPES. باستخدام المكبس من حقنة 5 مل ، قم بطحن الأنسجة والوسائط من خلال المصفاة.
    4. باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل ، اغسل المصفاة ب 2 إلى 3 مل إضافية من وسائط RPMI / HEPES حتى تمر جميع الأنسجة المرئية عبر المصفاة.
      ملاحظة: للحصول على أرقام خلايا كافية لتحليل التدفق الخلوي ، قد يلزم تجميع السحايا من متعددة معا. في هذه التجربة (الشكل 3 والشكل 4) ، تم تجميع سحايا الدماغ والحبل الشوكي من 4-5 فئران معا. إذا تم تجميع العينات ، فستكون هناك حاجة إلى وسائط إضافية لطحن الأنسجة من خلال مصفاة شبكة النايلون لمنع ارتفاع درجة حرارة الأنسجة.
    5. باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل ، انقل الخلايا والوسائط إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل. باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل ، اغسل الأنبوب المخروطي سعة 50 مل ب 5 مل من الوسائط لجمع أي خلايا متبقية. أجهزة الطرد المركزي عند 450 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لتكوير الخلايا.
    6. باستخدام ماصة باستور مع فراغ ، قم بنضح المادة الطافية مع الحرص على تجنب حبيبات الخلية وإعادة تعليق الخلايا في حجم ومخزن مؤقت مناسبين.
    7. لحساب التعليق أحادي الخلية ، قم بتخفيف حجم صغير من الخلايا (أي 5-10 ميكرولتر) باستخدام صبغة استبعاد التريبان الزرقاء (تخفيف 1:10) و RPMI. أضف 10 ميكرولتر من التخفيف إلى مقياس الدم.
    8. عد الخلايا كما هو موضح سابقا40,41 ، بمتوسط شبكتين مربعتين على الأقل من 16 للتأكد من دقتها.
      ملاحظة: في الشكل 3 ، على سبيل المثال ، تم إعادة تعليق الخلايا المجمعة والحبيبية من السحايا في 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) (1x PBS مع 1٪ FBS) لتلطيخ سطح المصب. تم تخفيف الخلايا 1:10 للعد (5 خلايا ميكرولتر ، 5 ميكرولتر تريبان أزرق ، 40 ميكرولتر RPMI). نتج عن هذا التخفيف ما بين 50-100 خلية لكل 16 شبكة مربعة ، مما يضمن عد خلايا أكثر دقة لأن الخلايا ليست كثيفة جدا ومتداخلة ولا متناثرة جدا. كان عدد الخلايا النواة من سحايا الدماغ والحبل الشوكي المجمعة لكل فأر على النحو التالي: بالنسبة للسحايا من الفئران المعالجة الوهمية = 100000-150000 خلية وللسحايا من الفئران التي يسببها فيروس التهاب الدماغ والنخاع الناجم عن فيروس ثيلر (TMEV-IDD) الفئران = 300000-350000 خلية. يختلف عدد الخلايا اعتمادا على دقة الجمع والمعالجة وما إذا كان الالتهاب السحائي موجودا.
    9. انتقل إلى تقنية الخلية الواحدة المطلوبة مثل سطح FACS (الشكل 3)14،36،42،43،44 ، بروتوكولات التلوين داخل الخلايا 33،45 ، التحفيز في المختبر ، مقايسات زراعة الخلايا 33،46،47 ، مقايسة ELISPOT28،34،35 ، والسائبة أو الخلية المفردة علم النسخ37,48.
      ملاحظة: احتفظ بجميع الأنابيب على الثلج بين خطوات المعالجة.
  4. تحضير معلقات أحادية الخلية لأنسجة الدماغ والحبل الشوكي
    1. انقل أنسجة الدماغ أو الحبل الشوكي مع الوسائط إلى الجزء العلوي من طبق بتري 100 مم عن طريق سكب الأنسجة والوسائط من الأنبوب. باستخدام ملقط ، انقل الأنسجة إلى أسفل طبق بتري. فرم الدماغ أو الحبل الشوكي ناعما بشفرة حلاقة معقمة. باستخدام شفرة الحلاقة ، انقل المنديل المفروم إلى أسفل اللوحة عن طريق الكشط لجمع الأنسجة.
      ملاحظة: بالنسبة لبروتوكول الهضم الأنزيمي أدناه ، يمكن تجميع ما يصل إلى حبلين نخاعيين معا للمعالجة. يجب معالجة العقول بشكل فردي.
    2. باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل ، أضف 3 مل من RPMI المكمل بمصل عجل الجنين بنسبة 10٪ (FCS) إلى طبق بتري. باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل ، ماصة لأعلى ولأسفل لإعادة تعليق الأنسجة في الوسائط ونقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
      ملاحظة: إذا كان تطبيق المصب هو تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية أو السائبة أو زراعة الخلايا ، فيجب اختبار الكثير من FCS لضمان عدم تنشيط الخلايا قبل التحليل. بدلا من ذلك ، يمكن معالجة الخلايا باستخدام 1x PBS مع 0.04٪ BSA بدلا من RPMI مع 10٪ FCS.
    3. باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل ، اغسل طبق بتري ب 2 مل إضافية من الوسائط لجمع أي أنسجة متبقية ونقلها إلى أنبوب مخروطي الحجم الإجمالي 5 مل. احتفظ بالأنابيب على الثلج بين خطوات المعالجة.
    4. باستخدام ماصة ، أعد تعليق مسحوق كولاجيناز I في وسائط Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) للحصول على التركيز المطلوب (أي 100 مجم / مل). أضف كولاجيناز من النوع الأول إلى الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على عينة الأنسجة المفرومة للحصول على التركيز النهائي المطلوب (أي 50 ميكرولتر لكل 1 مجم / مل).
      ملاحظة: ستزيد التركيزات العالية من الكولاجيناز من غلة الخلايا ولكنها يمكن أن تشق علامات سطح الخلية. لذلك ، يجب معايرة كميات كولاجيناز I لتحديد التركيز الأمثل اللازم للحصول على أكبر عدد من الخلايا القابلة للحياة مع جميع علامات سطح الخلية المطلوبة سليمة. على سبيل المثال ، تم اختبار كولاجيناز I بتركيزات نهائية تبلغ 0.5 مجم / مل ، و 1 مجم / مل ، و 2 مجم / مل على عينات واحدة من الدماغ أو الحبل الشوكي. تم تحديد صلاحية الخلية باستخدام طريقة استبعاد التريبان الأزرق وتم تقييم علامات سطح الخلية CD45 و CD19 و CD4 بواسطة قياس التدفق الخلوي. أسفر تركيز 1 مجم / مل من كولاجيناز I عن أعلى عدد من الخلايا الحية مع الاحتفاظ بجميع علامات سطح الخلية ذات الأهمية. وبالتالي ، تم استخدام هذا التركيز لمزيد من التجارب التي تفحص هذه الأنواع من الخلايا.
    5. أعد تعليق مسحوق DNase I برفق باستخدام 0.15 M كلوريد الصوديوم إلى تركيز المخزون المطلوب. أضف DNase I المعاد تعليقه إلى الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على عينة الأنسجة المفرومة للحصول على تركيز نهائي قدره 20 وحدة / مل.
      ملاحظة: تختلف عقود DNase I حسب وحدات النشاط لكل مل. سيتغير التركيز الذي سيتم إضافته إلى عينة الأنسجة بناء على وحدات نشاط قارورة المخزون لكل ملليلتر. التركيز النهائي المطلوب لكل عينة هو 20 وحدة / مل.
    6. ضع الأنابيب في رف أنبوبي في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية واحتضانها لمدة 40 دقيقة. اقلب الأنابيب كل 15 دقيقة لخلط الأنسجة جيدا مع الإنزيمات. بعد الحضانة ، أضف 500 ميكرولتر من 0.1 M EDTA (الرقم الهيدروجيني = 7.2) إلى كل أنبوب للحصول على تركيز نهائي قدره 0.01 M EDTA واحتضان لمدة 5 دقائق إضافية لتعطيل الكولاجيناز.
    7. باستخدام ماصة مصلية 10 مل ، أضف 9 مل من RPMI المكمل ب 10٪ FCS لكل أنبوب ليصل حجم كل أنبوب إلى ~ 14.5 مل. جهاز طرد مركزي عند 450 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. باستخدام ماصة باستور مع فراغ ، نضح الطافي مع الحرص على عدم لمس بيليه الخلية.
    8. باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل ، أضف 3 مل من محلول تدرج الكثافة متساوي التوتر بنسبة 100٪ إلى الأنبوب الذي يحتوي على حبيبات الخلية. باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل ، أضف وسائط RPMI 10٪ FCS إضافية لرفع الحجم النهائي إلى 10 مل وإعادة تعليق حبيبات الخلية لإنشاء طبقة محلول متدرجة الكثافة متساوية التوتر بنسبة 30٪.
      ملاحظة: قم بإعداد وسط تدرج الكثافة متساوي التوتر بنسبة 100٪ مسبقا ، والقسمة ، وتخزينها عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر. لتحضير محلول تدرج الكثافة متساوي التوتر بنسبة 100٪ ، قم بتخفيف وسائط تدرج الكثافة (جدول المواد) باستخدام المخزن المؤقت لتخفيف وسائط تدرج الكثافة. قم بإعداد المخزن المؤقت لتخفيف وسائط تدرج الكثافة (80.0 جم / لتر كلوريد الصوديوم ، 3.0 جم / لتر KCl ؛ 0.73 جم / لتر Na 2 HP0 4 ، 0.20 جم / لتر KH2HP04 ؛ 20.0جم / لتر جلوكوز) وقم بتعقيم المرشح باستخدام نظام مرشح فراغ. اصنع محلول تدرج الكثافة متساوي التوتر بنسبة 100٪ عن طريق خلط جزء واحد من المخزن المؤقت لتخفيف تدرج الكثافة ووسائط تدرج الكثافة المكونة من 9 أجزاء. تخلط جيدا.
    9. اقلب واخلط كل أنبوب جيدا قبل إضافة محلول التدرج متساوي التوتر بنسبة 70٪ من المخزون. أدخل ماصة مصلية سعة 1 مل تحتوي على 1 مل من محلول تدرج الكثافة متساوي التوتر بنسبة 70٪ في قاع الأنبوب. ببطء تحت 1 مل من الحل ، مع الحرص على عدم صنع فقاعات. قم بإزالة الماصة المصلية ببطء من الأنبوب ، مع الحرص على عدم إزعاج التدرج.
      ملاحظة: بالنسبة للطبقة السفلية بنسبة 70٪ ، يجب تخفيف محلول تدرج الكثافة متساوي التوتر بنسبة 100٪ إلى 70٪ باستخدام وسائط RPMI (على سبيل المثال ، 7 مل من محلول تدرج الكثافة متساوي التوتر بنسبة 100٪ و 3 مل من وسائط RPMI مختلطة جيدا). بالإضافة إلى ذلك ، يعد إنشاء طبقة أساسية نظيفة وغير مضطربة بنسبة 70٪ أمرا ضروريا لإزالة حطام المايلين وللحصول على معلقات نقية أحادية الخلية عند واجهة التدرج بعد الطرد المركزي.
    10. جهاز طرد مركزي عند 800 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية بدون فرامل. نضح المادة الطافية ، بما في ذلك طبقة حطام المايلين حتى يبقى 2-3 مل في الأنبوب ، مع الحرص على عدم إزعاج طبقة الخلية. احصد طبقة الخلية بين تدرج الكثافة 30/70٪ باستخدام ماصة 1 مل وانقلها إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل.
    11. باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل ، أضف وسائط RPMI 10٪ FCS لرفع الحجم النهائي إلى 15 مل. جهاز طرد مركزي 450 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: خلال هذه الخطوة ، يمكن تجميع طبقات الخلايا من أنبوبين إذا لزم الأمر. لا تجمع أكثر من أنبوبين وإلا فلن تتراكم الخلايا بسبب تركيز وسائط التدرج عالي الكثافة.
    12. نضح الطافع بعناية حتى لا يزعج بيليه الخلية. إعادة تعليق الخلايا في حجم / مخزن مؤقت مناسب لحساب الخلايا باستخدام مقياس الدم (على سبيل المثال ، إعادة تعليق الحبل الشوكي الفردي في 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS لتلطيخ سطح المصب) (الشكل 3).
    13. باستخدام ماصة سعة 1 مل ، انقل معلقات الخلية إلى أعلى أنبوب أعلى المرشح (جدول المواد) واسمح للخلايا بالتصفية إلى أسفل الأنبوب لإزالة أي حطام مايلين متبقي.
    14. باستخدام صبغة استبعاد التريبان الزرقاء ، قم بتخفيف الخلايا وحسابها على مقياس الدم عن طريق متوسط شبكتين مربعتين على الأقل من 16 دقة40,41.
    15. تابع تقنية تحليل الخلية الواحدة المطلوبة.
      ملاحظة: باستخدام أشكال مختلفة من الكولاجين (أي D ، النوع الأول ، النوع الثاني ، النوع الرابع) ، الخلايا المناعية ، الخلايا الدبقية الصغيرة (الشكل 3) ، الخلايا النجمية ، الخلايا المحيطة ، الخلايا البطانية49 ، والخلايا العصبية50 يمكن عزلها بكفاءة. كان عدد الخلايا النواة التي تم الحصول عليها للنتائج على النحو التالي باستخدام إنزيم كولاجيناز I المعاير: الدماغ الكامل المعالج بالوهمية = 500000-600000 خلية. دماغ TMEV-IDD الكامل = 800000-1000000 خلية ؛ الحبل الشوكي الكامل المعالج بالوهمية = 150,000-200,000 خلية ؛ الحبل الشوكي الكامل TMEV-IDD = 300,000-400,000. سيختلف عدد الخلايا اعتمادا على دقة الجمع والمعالجة وما إذا كان التهاب الجهاز العصبي المركزي موجودا.

النتائج

هدفت هذه التجربة التمثيلية إلى تحديد كمية الخلايا البائية والتائية ووصف توطين الخلايا البائية والتائية في مقصورات الجهاز العصبي المركزي السحائية والمتني في ظروف الاستتباب وكذلك في نموذج MS التدريجي للفئران (أي TMEV-IDD). تم تحفيز TMEV-IDD في إناث الفئران SJL البالغة من العمر 5 أسابيع عن طريق العدوى...

Discussion

تعد طرق تقييم التركيب الخلوي في حجرة الجهاز العصبي المركزي أثناء التوازن والمرض ضرورية لفهم الحالات الفسيولوجية والمرضية للجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك ، على الرغم من أنها تعمل كحاجز مهم في الجهاز العصبي المركزي وتضم مجموعة متنوعة من الخلايا المناعية ، غالبا ما يتم حذف السحايا من التحلي?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون موظفي مركز الطب المقارن والبحوث (CCMR) في دارتموث على رعايتهم الخبيرة للفئران المستخدمة في هذه الدراسات. قام صندوق بورنشتاين للأبحاث بتمويل هذا البحث.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Aluminum foilanyN/A
Bovine Serum AlbuminThermoFisher Scientific37002D
CentrifugeBeckman CoulterAllegra X-12R centrifuge
Collagenase IWorthingtonLS004196
Conical tube, 15 mLVWR525-1069
Conical tube, 50 mLVWR89039-658
Cover glassHauser Scientific5000
CryomoldVWR18000-128
Curved forcepsFine Science Tools11003-14
Disposable polystyrene tube, 14 mLFisher Scientific14-959-1B
Disposable ScalpelFisher ScientificNC0595256
DNAse IWorthingtonLS002139
Dry iceAirgasN/A
Durmont #7ForcepsFine Science Tools11271-30
EDTA disodium salt dihydrateAmresco0105-500g
Ethanol, 100%anyN/A
Fetal Bovine Serum (FBS)HycloneSH30910.03
Filter top tube, 5 mLVWR352235
Fixable viability stain 780Becton Dickinson565388
Flow cytometerBeckman CoulterGallios
GlucoseFisher ChemicalD16-500
Goat anti-mouse IgG (488 conjugate)Jackson immunoresearch115-546-146
Goat anti-mouse IgG (594 conjugate)Jackson immunoresearch115-586-146
Goat anti-rabbit 488Jackson immunoresearch111-545-144
Goat anti-rat 594Jackson immunoresearch112-585-167
Goat anti-rat 650Jackson immunoresearch112-605-167
Hank's Balnced Salt Solution (HBSS)Corning21-020-CV
HemacytometerAndwin Scientific02-671-51B
HemostatFine Science Tools13004-14
HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid)ThermoFisher Scientific15630080
KClFisher chemicalBP366-500
KH2PO4 (anhydrous)Sigma AldrichP5655-100G
Liquid NitrogenAirgasN/A
Mouse FC block (CD16/32)Becton Dickinson553141
Na2HP04 (anhydrous)Fisher ChemicalS374-500
NaClFisher chemicalS671-500
Needle, 25 gaugeBecton Dickinson305122
Normal mouse serumThermoFisher Scientific31881
Nylon mesh strainerVWR352350
OCTSakura4583
Paraformaldehyde, 20%Electron Microscopy Sciences15713-SDiluted to 4% using 1 x PBS
Pasteur pipette, 9 inch, unpluggedFisher Scientific13-678-20C
PBS (1x)Corning21-040-CV
PE Rat Anti-Mouse CD4Becton Dickinson553730
PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19Becton Dickinson562329
Percoll density gradient mediaGE healthcare17-0891-01
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45Becton Dickinson550994
Petri dish, 100 mmVWR353003
pH meterFisher Scientific13-636-AB150
Pipet-AidDrummond Scientific Corporation4-000-101
Pipette 200 µlGilsonFA10005M
Pipette tips, 1 mLUSA Scientific1111-2831
Pipette tips, 200 µlUSA Scientific1111-1816
Pipette, 1 mLGilsonFA10006M
Prolong Diamond mountant with DAPIThermoFisher ScientificP36962
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32Becton Dickinson553141
Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone)Abcamab16669
Rabbit anti-mouse lamininAbcamab11575
Rat anti-mouse ERT-R7Abcamab51824
RPMI 1640Corning10-040-CV
Serological pipet, 1 mLVWR357521
Serological pipet, 10 mLVWR357551
Serological pipet, 5 mLVWR357543
Sodium hydroxideFisher ScientificS318-100
SucroseFisher chemicalS5-500
Surgical scissorsFine Science Tools14001-16
Surgical scissors, extra fineRobozRS-5882
Syringe, 10 mLBecton Dickinson302995
Syringe, 5 mLBecton Dickinson309646
Trypan blueGibco15250-061
Vacuum filter systemMillipore20207749
Vacuum flaskThomas Scientific5340-2L
Vacuum in-line filterPall Corporation4402
Vacuum lineCole PalmerEW-06414-20
Water bathThermoFisher ScientificVersa bath

References

  1. Mastorakos, P., McGavern, D. The anatomy and immunology of vasculature in the central nervous system. Science Immunology. 4 (37), 0492 (2019).
  2. Carson, M. J., Doose, J. M., Melchior, B., Schmid, C. D., Ploix, C. C. CNS immune privilege: hiding in plain sight. Immunological Reviews. 213, 48-65 (2006).
  3. Rua, R., McGavern, D. B. Advances in Meningeal Immunity. Trends in Molecular Medicine. 24 (6), 542-559 (2018).
  4. Greene, H. S. The transplantation of tumors to the brains of heterologous species. Cancer Research. 11 (7), 529-534 (1951).
  5. Murphy, J. B., Sturm, E. Conditions determining the transplantability of tissues in the brain. Journal of Experimental Medicine. 38 (2), 183-197 (1923).
  6. Louveau, A., Harris, T. H., Kipnis, J. Revisiting the Mechanisms of CNS Immune Privilege. Trends in Immunology. 36 (10), 569-577 (2015).
  7. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the CNS in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  8. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  9. Korin, B., et al. High-dimensional, single-cell characterization of the brain's immune compartment. Nature Neuroscience. 20 (9), 1300-1309 (2017).
  10. Walker-Caulfield, M. E., Hatfield, J. K., Brown, M. A. Dynamic changes in meningeal inflammation correspond to clinical exacerbations in a murine model of relapsing-remitting multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology. 278, 112-122 (2015).
  11. Gadani, S. P., Smirnov, I., Smith, A. T., Overall, C. C., Kipnis, J. Characterization of meningeal type 2 innate lymphocytes and their response to CNS injury. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 285-296 (2017).
  12. Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. Journal of Experimental Medicine. 212 (7), 991-999 (2015).
  13. Li, J., Zhou, J., Shi, Y. Scanning electron microscopy of human cerebral meningeal stomata. Annals of Anatomy. 178 (3), 259-261 (1996).
  14. Louveau, A., et al. CNS lymphatic drainage and neuroinflammation are regulated by meningeal lymphatic vasculature. Nature Neuroscience. 21 (10), 1380-1391 (2018).
  15. Choi, S. R., et al. Meningeal inflammation plays a role in the pathology of primary progressive multiple sclerosis. Brain. 135, 2925-2937 (2012).
  16. Howell, O. W., et al. Meningeal inflammation is widespread and linked to cortical pathology in multiple sclerosis. Brain. 134, 2755-2771 (2011).
  17. Kooi, E. J., Geurts, J. J., van Horssen, J., Bo, L., van der Valk, P. Meningeal inflammation is not associated with cortical demyelination in chronic multiple sclerosis. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 68 (9), 1021-1028 (2009).
  18. Lucchinetti, C. F., et al. Inflammatory cortical demyelination in early multiple sclerosis. New England Journal of Medicine. 365 (23), 2188-2197 (2011).
  19. Magliozzi, R., et al. A Gradient of neuronal loss and meningeal inflammation in multiple sclerosis. Annals of Neurology. 68 (4), 477-493 (2010).
  20. Arac, A., et al. Evidence that meningeal mast cells can worsen stroke pathology in mice. American Journal of Pathology. 184 (9), 2493-2504 (2014).
  21. Benakis, C., et al. Commensal microbiota affects ischemic stroke outcome by regulating intestinal gammadelta T cells. Nature Medicine. 22 (5), 516-523 (2016).
  22. Roth, T. L., et al. Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury. Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).
  23. Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
  24. Schain, A. J., et al. Activation of pial and dural macrophages and dendritic cells by cortical spreading depression. Annals of Neurology. 83 (3), 508-521 (2018).
  25. Azevedo, R. S. S., et al. In situ immune response and mechanisms of cell damage in central nervous system of fatal cases microcephaly by Zika virus. Scientific Reports. 8 (1), 1 (2018).
  26. Coles, J. A., et al. Intravital imaging of a massive lymphocyte response in the cortical dura of mice after peripheral infection by trypanosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (4), 0003714 (2015).
  27. Kang, S. S., McGavern, D. B. Lymphocytic choriomeningitis infection of the central nervous system. Frontiers in Bioscience. 13, 4529-4543 (2008).
  28. DiSano, K. D., Stohlman, S. A., Bergmann, C. C. Activated GL7(+) B cells are maintained within the inflamed CNS in the absence of follicle formation during viral encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 60, 71-83 (2017).
  29. DiSano, K. D., R, D. B., Gilli, F., Pachner, A. R. Central Nervous System Inflammatory Aggregates in the Theiler's Virus Model of Progressive Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
  30. Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. Journal of Histotechnology. 36 (3), 86-91 (2013).
  31. Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (119), e55226 (2017).
  32. Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis. Current Protocols in Immunology. 121 (1), 44 (2018).
  33. Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension. Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).
  34. Cao, Y., et al. An optimized assay for the enumeration of antigen-specific memory B cells in different compartments of the human body. Journal of Immunological Methods. 358 (1-2), 56-65 (2010).
  35. Wykes, M. N., Renia, L. ELISPOT Assay to Measure Peptide-specific IFN-γ Production. Bio-Protocol. 7 (11), (2017).
  36. Gjurich, B. N., Taghavie-Moghadam, P. L., Galkina, E. V. Flow Cytometric Analysis of Immune Cells Within Murine Aorta. Methods in Molecular Biology. 1339, 161-175 (2015).
  37. Laboissonniere, L. A., Sonoda, T., Lee, S. K., Trimarchi, J. M., Schmidt, T. M. Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells. Journal of Visualized Experiments. (123), e55229 (2017).
  38. Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. Journal of Visualized Experiments. (4), 198 (2007).
  39. McGowan, J. W., Bidwell, G. L. The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules. Journal of Visualized Experiments. (118), e54987 (2016).
  40. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count cells. Journal of Visualized Experiments Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2019)
  41. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. , e752 (2008).
  42. Hatfield, J. K., Brown, M. A. Group 3 innate lymphoid cells accumulate and exhibit disease-induced activation in the meninges in EAE. Cellular Immunology. 297 (2), 69-79 (2015).
  43. Molina Estevez, F. J., Mathews, T. D., Biffi, A., Peviani, M. Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods. Journal of Visualized Experiments. (153), e752 (2019).
  44. Herz, J., Louveau, A., Da Mesquita, S., Kipnis, J. Morphological and Functional Analysis of CNS-Associated Lymphatics. Methods in Molecular Biology. 1846, 141-151 (2018).
  45. Kwong, B., et al. T-bet-dependent NKp46(+) innate lymphoid cells regulate the onset of TH17-induced neuroinflammation. Nature Immunology. 18 (10), 1117-1127 (2017).
  46. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
  47. Nurkhametova, D., et al. Activation of P2X7 Receptors in Peritoneal and Meningeal Mast Cells Detected by Uptake of Organic Dyes: Possible Purinergic Triggers of Neuroinflammation in Meninges. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 45 (2019).
  48. Van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
  49. Czupalla, C. J., Yousef, H., Wyss-Coray, T., Butcher, E. C. Collagenase-based Single Cell Isolation of Primary Murine Brain Endothelial Cells Using Flow Cytometry. Bio-Protocol. 8 (22), 3092 (2018).
  50. Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons. Methods in Molecular Biology. 1656, 229-251 (2017).
  51. Eriksdotter-Nilsson, M., Björklund, H., Olson, L. Laminin immunohistochemistry: a simple method to visualize and quantitate vascular structures in the mammalian brain. Journal of Neuroscience Methods. 17 (4), 275-286 (1986).
  52. Cha, J. H., et al. Prompt meningeal reconstruction mediated by oxygen-sensitive AKAP12 scaffolding protein after central nervous system injury. Nature Communications. 5, 4952 (2014).
  53. Van Vliet, E., Melis, M., Foidart, J. M., Van Ewijk, W. Reticular fibroblasts in peripheral lymphoid organs identified by a monoclonal antibody. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (7), 883-890 (1986).
  54. Louveau, A., Filiano, A. J., Kipnis, J. Meningeal whole mount preparation and characterization of neural cells by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. 121 (1), (2018).
  55. Derecki, N., J, K. Mouse meninges isolation for FACS. Protocol Exchange. , (2014).
  56. Hedley, B. D., Keeney, M. Technical issues: flow cytometry and rare event analysis. International Journal of Laboratory Hematology. 35 (3), 344-350 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

159

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved