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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo documento presenta due protocolli ottimizzati per l'esame delle cellule immunitarie residenti e di derivazione periferica all'interno del sistema nervoso centrale, tra cui il cervello, il midollo spinale e le meningi. Ognuno di questi protocolli aiuta ad accertare la funzione e la composizione delle cellule che occupano questi compartimenti in condizioni stazionarie e infiammatorie.

Abstract

Il sistema nervoso centrale (SNC) è composto dal cervello e dal midollo spinale ed è avvolto dalle meningi, strati membranosi che fungono da barriera tra la periferia e il SNC. Il sistema nervoso centrale è un sito immunologicamente specializzato e, in condizioni di stato stazionario, il privilegio immunitario è più evidente nel parenchima del sistema nervoso centrale. Al contrario, le meningi ospitano una vasta gamma di cellule residenti, comprese le cellule immunitarie innate e adattative. Durante le condizioni infiammatorie innescate da lesioni del sistema nervoso centrale, autoimmunità, infezioni o persino neurodegenerazione, le cellule immunitarie di derivazione periferica possono entrare nel parenchima e risiedere all'interno delle meningi. Si ritiene che queste cellule svolgano azioni sia benefiche che dannose durante la patogenesi della malattia del SNC. Nonostante questa conoscenza, le meningi sono spesso trascurate quando si analizza il compartimento del SNC, perché i metodi convenzionali di estrazione del tessuto del SNC omettono gli strati meningei. Questo protocollo presenta due metodi distinti per l'isolamento rapido dei tessuti murini del SNC (cioè cervello, midollo spinale e meningi) che sono adatti per l'analisi a valle tramite tecniche a singola cellula, immunoistochimica e metodi di ibridazione in situ. I metodi descritti forniscono un'analisi completa dei tessuti del SNC, ideale per valutare il fenotipo, la funzione e la localizzazione delle cellule che occupano il compartimento del SNC in condizioni omeostatiche e durante la patogenesi della malattia.

Introduzione

Il sistema nervoso centrale (SNC) è una sede immunologicamente specializzata. Il parenchima del SNC, escludendo lo spazio del liquido cerebrospinale, le meningi e la vascolarizzazione, è classicamente visto come un sito immuno-privilegiato 1,2,3,4,5 ed è relativamente privo di cellule immunitarie durante le condizioni omeostatiche 2,6,7. Al contrario, le meningi, che comprendono gli strati dura, aracnoideo e pia, sono componenti cruciali del compartimento del SNC, partecipando attivamente alla sorveglianza immunitaria omeostatica e ai processi infiammatori durante la patogenesi della malattia 3,6,7,8. In condizioni di stato stazionario, le meningi supportano numerose cellule sentinella immunitarie, tra cui le cellule linfoidi innate (ILC), i macrofagi, le cellule dendritiche (DC), i mastociti, le cellule T e, in misura minore, le cellule B 9,10,11.

Le meningi sono strutture altamente vascolarizzate e contengono vasi linfatici che forniscono una connessione linfatica tra il SNC e la sua periferia 8,12,13,14. Nelle condizioni infiammatorie indotte da lesioni del sistema nervoso centrale, infezioni, autoimmunità o persino neurodegenerazione, le cellule immunitarie di derivazione periferica si infiltrano nel parenchima e alterano il paesaggio immunitario all'interno delle meningi. A seguito dell'infiltrazione cellulare, le meningi possono rappresentare una nicchia funzionale per le cellule immunitarie di derivazione periferica, promuovendo l'aggregazione delle cellule immunitarie, l'attivazione delle cellule immunitarie locali e la sopravvivenza a lungo termine nel compartimento del SNC. L'infiammazione meningea prominente si osserva in molteplici malattie che colpiscono il sistema nervoso centrale, tra cui la sclerosi multipla (SM) 15,16,17,18,19, l'ictus 20,21, la lesione sterile 22,23 (cioè lesione del midollo spinale e lesione cerebrale traumatica), l'emicrania 24 e l'infezione microbica 25,26,27,28,29. Pertanto, la caratterizzazione delle cellule residenti e delle cellule immunitarie di derivazione periferica nel compartimento meningeo è essenziale per comprendere il ruolo di queste cellule durante le condizioni di stato stazionario e la patogenesi della malattia.

L'estrazione del cervello, del midollo spinale e delle meningi dal cranio e dai corpi vertebrali è tecnicamente impegnativa e richiede molto tempo. Attualmente non sono disponibili tecniche per l'estrazione rapida del cervello con tutti e tre gli strati meningei intatti. Sebbene la laminectomia produca un'eccellente morfologia del tessuto del midollo spinale e preservi gli strati meningei, è estremamente dispendiosa in termini di tempo e complicata30,31. Al contrario, i metodi di estrazione più convenzionali come la rimozione del cervello dal cranio e l'estrusione idraulica del midollo spinale facilitano la rapida estrazione del tessuto del SNC, ma sia le meningi aracnoidie che quelle durali vengono perse con queste tecniche30,31. L'omissione degli strati della dura e dell'aracnoide durante l'isolamento convenzionale dei tessuti cerebrali e del midollo spinale provoca un'analisi incompleta delle cellule all'interno del compartimento del SNC. Pertanto, l'identificazione di nuove tecniche focalizzate sull'estrazione rapida di tessuti del SNC con meningi intatte è fondamentale per l'analisi ottimale del compartimento del SNC.

Questo manoscritto presenta due metodi per l'estrazione rapida del cervello, del midollo spinale e delle meningi dai topi, facilitando l'analisi a valle delle cellule residenti e delle cellule immunitarie derivate perifericamente nel parenchima del SNC e nelle meningi. Questi protocolli ottimizzati si concentrano su 1) l'isolamento di sospensioni a singola cellula per l'analisi a valle e 2) la preparazione del tessuto per l'elaborazione istologica. L'ottenimento di sospensioni unicellulari dal cervello, dal tessuto del midollo spinale e dalle meningi durali e aracnoidee32 consente l'analisi simultanea delle cellule che risiedono sia nel compartimento parenchimale che in quello meningeo. Le sospensioni a singola cellula possono essere utilizzate in diverse applicazioni, tra cui saggi di coltura cellulare per eseguire la stimolazione in vitro 33, immunospot enzimatico (ELISpot)28,34,35, citometria a flusso36,33 e trascrittomica a singola cellula 37 o bulk. Inoltre, il protocollo ottimizzato per la decalcificazione di interi cervelli e midolli spinali con crani o colonne vertebrali intatti, rispettivamente, consente la decalcificazione delicata dell'osso circostante, lasciando intatte le meningi e preservando la morfologia dei tessuti. Questo metodo consente l'identificazione selettiva di proteine o RNA utilizzando tecniche di immunoistochimica (IHC) o ibridazione in situ (ISH) sia all'interno dello spazio parenchimale che meningeo. La caratterizzazione del fenotipo, dello stato di attivazione e della localizzazione delle cellule residenti e delle cellule immunitarie derivate perifericamente all'interno del SNC può fornire informazioni essenziali per comprendere come i singoli tipi di cellule nel compartimento del SNC contribuiscano all'omeostasi e alla patogenesi della malattia.

Protocollo

Tutto il lavoro sugli animali utilizza protocolli esaminati e approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso la Geisel School of Medicine di Dartmouth.

1. Elaborazione di campioni di cervello e midollo spinale per la decalcificazione

  1. Isolamento di campioni di cervello e midollo spinale
    1. Eutanasia il topo tramite inalazione di CO2 . Assicurarsi che la portata di CO2 sposti il 10%-30% del volume della gabbia al minuto.
    2. Usando una pinza, solleva il processo xifoideo e taglia la parete addominale lateralmente appena sotto la gabbia toracica con le forbici, tirando verso l'alto per evitare di tagliare i vasi sanguigni o gli organi sottostanti. Tagliare lateralmente il diaframma.
    3. Tagliare la gabbia toracica lungo i bordi laterali parallelamente ai polmoni fino alla clavicola. Usando una pinza, sollevare lo sterno e bloccare lo sterno con un emostato. Posiziona l'emostatico sopra la testa per sollevare la gabbia toracica ed esporre il cuore.
    4. Usando una pinza, afferra il cuore vicino al suo apice e fai un'incisione nell'atrio destro del cuore per fornire uno sbocco. Inserire un ago da 25 G con una siringa da 10 mL attaccata per somministrare lentamente 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) ghiacciata nel ventricolo sinistro per perfondere transcardicamente il topo.
      NOTA: La perfusione dovrebbe avvenire nell'arco di 4-5 minuti fino a quando il fegato non viene ripulito dal sangue. Un totale di 10 mL di PBS 1x è solitamente sufficiente per la perfusione, ma se necessario possono essere utilizzati di più. Un fegato chiaro di solito indica un'adeguata perfusione.
    5. Usando forbici affilate, rimuovere la testa mediante decapitazione (Figura 1; 1). Praticare un'incisione sulla linea mediana della pelle (Figura 1; 2) e capovolgere la pelle sugli occhi per liberare il cranio.
    6. Tagliare l'osso nasale per liberare la mandibola dal cranio (Figura 1; 3). Rimuovi la mandibola, la lingua e gli occhi. Tagliare lungo gli aspetti laterali del cranio per rilasciare il tessuto lungo il meato uditivo esterno (Figura 1; 4). Taglia per rimuovere tutta la pelle, i muscoli e i tessuti in eccesso che si sovrappongono al cranio.
    7. Separare la gabbia toracica dalla colonna vertebrale tagliando parallelamente alla colonna vertebrale con forbici affilate (Figura 1; 5 e 6). Praticare un piccolo taglio nella regione lombare inferiore per isolare la colonna vertebrale (Figura 1; 7). Tagliare e rimuovere eventuali muscoli rimanenti lungo la colonna vertebrale per esporre le vertebre (Figura 1; 8).
      NOTA: La rimozione del tessuto in eccesso dalla colonna vertebrale e dal cranio è necessaria per ottenere un'adeguata penetrazione del tampone di decalcificazione fissativa della paraformaldeide (PFA) e dell'acido etilendiamminotetraacetico (EDTA).
  2. Post-fissazione, decalcificazione e crioconservazione
    1. Usando una pinza, posizionare il cervello con il cranio intatto o la colonna vertebrale in una provetta conica da 15 mL contenente 10 mL di PFA al 4%. Posizionare i tubi a 4 °C per almeno 48 ore per un fissaggio adeguato.
      NOTA: Per evitare la fissazione eccessiva del tessuto, non superare le 72 ore di fissazione. I tempi di fissazione sono prolungati per i campioni ossei prima della decalcificazione. Un'adeguata fissazione proteggerà il tessuto dagli effetti della decalcificazione e garantirà una migliore morfologia del tessuto.
    2. Sciacquare il cervello o il midollo spinale rimuovendo il tessuto dal PFA al 4% con una pinza e posizionando il tessuto in una provetta monouso da 14 ml con 10 ml di 1x PBS per 5 minuti. Trasferire il cervello o il midollo spinale in una provetta conica da 50 mL con 10 mL di EDTA al 10% (pH = 7,2-7,4).
      NOTA: L'uso di una provetta più grande con 10 mL di EDTA conferisce all'EDTA una maggiore area di contatto con il tessuto e accelera il processo di decalcificazione.
    3. Controllare quotidianamente se l'osso è morbido e flessibile: rimuovere il tessuto dalla soluzione di EDTA con una pinza, posizionarlo su una capsula di Petri e testare delicatamente la morbidezza dell'osso con un ago da 25 G. Se l'ago penetra facilmente nell'osso, il processo di decalcificazione è completo.
    4. Rimuovere il tessuto dalla soluzione di EDTA e trasferire il cervello o il midollo spinale in una provetta monouso da 14 mL contenente 10 mL di 1x PBS e lavare per 10 minuti. Ripetere il lavaggio.
      NOTA: La decalcificazione richiede solitamente 2-3 giorni. La soluzione deve essere cambiata ogni 2-3 giorni se l'osso non è ancora adeguatamente decalcificato. Tuttavia, l'incubazione prolungata in EDTA dopo che l'osso è stato decalcificato può danneggiare la morfologia del tessuto.
    5. Preparare soluzioni di saccarosio al 10%, 20% e 30% aggiungendo saccarosio a 1x PBS. Ad esempio, per il 10% di saccarosio, aggiungere 10 g di saccarosio e portare il volume a 100 ml utilizzando 1x PBS sterile. Conservare la soluzione a 4 °C per un massimo di 1 mese.
      NOTA: Le soluzioni di saccarosio sono soggette alla crescita di microrganismi, quindi i campioni non devono essere conservati per periodi di tempo prolungati in queste soluzioni.
    6. Rimuovere il tessuto dal PBS 1x, metterlo in 10 mL di soluzione di saccarosio al 10% e conservarlo a 4 °C. Lasciare riposare il tessuto per 24 ore o fino a quando non affonda sul fondo del tubo.
    7. Ripeti questo processo, spostando il tessuto prima in una soluzione di saccarosio al 20% e infine in una soluzione di saccarosio al 30%. Lasciare che il tessuto affondi nel saccarosio al 30% (almeno 24 ore) e procedere all'inclusione del tessuto.
  3. Inclusione e congelamento dei tessuti
    1. Usando una pinza, rimuovere il tessuto dal saccarosio al 30%, posizionarlo su una piastra di Petri e inclinare il piatto per eliminare la soluzione di saccarosio in eccesso sul tessuto. Usando un bisturi, tagliare il tessuto nei segmenti desiderati.
    2. Creare uno strato sottile di composto per la temperatura di taglio ottimale (OCT) sul fondo del crioma e posizionare i pezzi di tessuto nello stampo. Coprire completamente il tessuto con il composto OCT, assicurandosi che non siano presenti bolle.
    3. Congelare i blocchi passando il mouse sopra l'azoto liquido38 o impostando i blocchi su un impasto isopropanolo/ghiaccio secco al 100%39 fino a quando il blocco non è opaco. Avvolgere i criostampi in un foglio di alluminio e conservare i blocchi a -80 °C per la conservazione a lungo termine. Spostare i blocchi a -20 °C prima del sezionamento.
      NOTA: È necessario prestare attenzione durante il sezionamento e l'esecuzione di protocolli istologici su cervelli decalcificati poiché gli strati del cranio e della meningea possono essere persi se le sezioni vengono maneggiate in modo approssimativo.

2. Preparazione delle meningi e dei tessuti del SNC per la colorazione con citometria a flusso

  1. Estrazione della calotta cranica e del cervello
    1. Usando forbici affilate, rimuovere la testa mediante decapitazione (Figura 2A; 1). Usando le forbici, praticare un'incisione sulla linea mediana della pelle (Figura 2A; 2) e capovolgere la pelle sopra gli occhi per liberare il cranio.
    2. Posiziona le forbici all'interno del forame magna e inizia a tagliare il cranio lateralmente lungo le cortecce verso il bulbo olfattivo, mantenendo le incisioni sopra il meato uditivo esterno e la mandibola (Figura 2A; 3). Eseguire gli stessi tagli sul lato opposto, con i tagli che si incontrano al bulbo olfattivo per liberare la calotta cranica dal cervello (Figura 2A; 3).
    3. Usando una pinza, staccare la calotta cranica e posizionare la calotta cranica in una provetta conica da 15 mL contenente 5 mL di terreno RPMI freddo integrato con 25 mM di HEPES. Tenere il tubo sul ghiaccio.
    4. Usando una pinza curva, posiziona la pinza sotto la base del cervello e sollevala per liberare il cervello dalla calotta cranica. Mettere il cervello in una provetta conica da 15 mL contenente 5 mL di RPMI freddo integrato con 25 mM di HEPES. Tenere il tubo sul ghiaccio fino alla lavorazione.
  2. Estrazione della colonna vertebrale e del tessuto del midollo spinale
    1. Usando una pinza e delle forbici affilate, separare la gabbia toracica dalla colonna vertebrale tagliando parallelamente alla colonna vertebrale (Figura 2A; 4 e 5). Praticare un piccolo taglio nella regione lombare inferiore per isolare la colonna vertebrale (Figura 2A; 6). Tagliare e rimuovere eventuali muscoli rimanenti lungo la colonna vertebrale per esporre le vertebre (Figura 2A; 7).
    2. Posizionare le forbici chirurgiche extra fini all'interno della colonna vertebrale e tagliare lungo il bordo laterale della colonna (Figura 2C). Tagliare completamente il bordo laterale opposto per dividere la colonna vertebrale in una porzione anteriore e posteriore.
      NOTA: Il midollo spinale rimarrà attaccato alla colonna vertebrale.
    3. Usando una pinza, staccare lentamente e con attenzione il midollo spinale dalla colonna vertebrale e posizionare il tessuto in una provetta conica da 15 mL contenente 5 mL di RPMI freddo con 25 mM di HEPES. Trasferire le porzioni anteriore e posteriore della colonna vertebrale in una provetta conica da 15 mL contenente 5 mL di RPMI freddo con HEPES da 25 mM.
  3. Rimozione delle meningi per preparare sospensioni monocellulari
    1. Usando una pinza, rimuovere la calotta cranica dal supporto RPMI. Utilizzo di pinze affilate (#7 pinze; Tabella dei materiali), incidendo intorno al bordo esterno della calotta cranica (Figura 2B) e staccando le meningi dal bordo della calotta cranica, raschiando per rimuovere le meningi durali e aracnoidee. Disporre le meningi su una capsula di Petri.
      NOTA: La rimozione delle meningi sia dal cervello che dal midollo spinale richiede pratica. Se l'utente ha difficoltà a estrarre le meningi, utilizzare un microscopio da dissezione per facilitare la rimozione.
    2. Rimuovere la colonna vertebrale dal tubo. Usando una pinza affilata, incidi intorno ai bordi della colonna vertebrale per liberare le meningi e stacca le meningi dal bordo della vertebra usando una pinza curva. Disporre le meningi su una capsula di Petri.
    3. Mettere un colino a rete di nylon in una provetta conica da 50 ml. Spostare le meningi nel colino e aggiungere 3 mL di RPMI integrato con 25 mM di HEPES. Utilizzando lo stantuffo di una siringa da 5 ml, macinare il tessuto e il terreno attraverso il colino.
    4. Utilizzando una pipetta sierologica da 5 mL, lavare il filtro con altri 2 o 3 mL di terreno RPMI/HEPES fino a quando tutto il tessuto visibile non è passato attraverso il filtro.
      NOTA: Per ottenere un numero di cellule adeguato per l'analisi citofluorimetrica, potrebbe essere necessario raggruppare le meningi di più animali. In questo esperimento (Figura 3 e Figura 4), le meningi cerebrali e del midollo spinale di 4-5 topi sono state raggruppate insieme. Se i campioni vengono raggruppati, saranno necessari terreni aggiuntivi per macinare il tessuto attraverso il filtro a rete di nylon per evitare il surriscaldamento del tessuto.
    5. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, trasferire le cellule e il terreno in una nuova provetta conica da 15 mL. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, lavare la provetta conica da 50 mL con 5 mL di terreno per raccogliere le cellule rimanenti. Centrifugare a 450 x g per 5 minuti a 4 °C per pellettare le cellule.
    6. Utilizzando una pipetta Pasteur con vuoto, aspirare il surnatante facendo attenzione ad evitare il pellet cellulare e risospendere le cellule in un volume e tampone appropriati.
    7. Per contare la sospensione unicellulare, diluire un piccolo volume di cellule (cioè 5-10 μL) utilizzando un colorante di esclusione del blu di tripano (diluizione 1:10) e RPMI. Aggiungere 10 μL di diluizione all'emocitometro.
    8. Conta le celle come descritto in precedenza40,41, facendo una media di almeno due griglie quadrate da 16 per la precisione.
      NOTA: Nella Figura 3, ad esempio, le cellule in pool e pellettate delle meningi sono state risospese in 250 μL di tampone FACS (Fluorescence-activated Cell Sorting) (1x PBS con 1% FBS) per la colorazione superficiale a valle. Le cellule sono state diluite 1:10 per il conteggio (5 μL di cellule, 5 μL di blu di tripano, 40 μL di RPMI). Questa diluizione ha prodotto tra 50 e 100 cellule per 16 griglie quadrate, garantendo un conteggio più accurato delle cellule perché le cellule non sono né troppo dense e sovrapposte né troppo sparse. La conta delle cellule nucleate delle meningi del cervello e del midollo spinale raggruppate per topo era la seguente: per le meningi di topi sottoposti a trattamento fittizio = 100.000-150.000 cellule e per le meningi di topi della malattia demielinizzante indotta dal virus dell'encefalomielite murina di Theiler (TMEV-IDD) = 300.000-350.000 cellule. La conta cellulare varia a seconda della precisione della raccolta, dell'elaborazione e della presenza di infiammazione meningea.
    9. Procedere alla tecnica a singola cellula desiderata come una superficie FACS (Figura 3)14,36,42,43,44, protocolli di colorazione intracellulare 33,45, stimolazione in vitro, saggi di coltura cellulare 33,46,47, saggio ELISPOT 28,34,35 e test bulk o a singola cellula Trascrittomica37,48.
      NOTA: Tenere tutte le provette sul ghiaccio tra una fase di lavorazione e l'altra.
  4. Preparazione di sospensioni unicellulari di tessuto cerebrale e del midollo spinale
    1. Trasferire il tessuto cerebrale o del midollo spinale con il terreno nella parte superiore della piastra di Petri da 100 mm versando il tessuto e il terreno dalla provetta. Usando una pinza, sposta il tessuto sul fondo della capsula di Petri. Tritare finemente il cervello o il midollo spinale con una lametta sterile. Usando la lama del rasoio, sposta il tessuto tritato sul fondo della piastra raschiando per raccogliere il tessuto.
      NOTA: Per il protocollo di digestione enzimatica riportato di seguito, è possibile raggruppare fino a due midolli spinali per l'elaborazione. I cervelli dovrebbero essere elaborati individualmente.
    2. Utilizzando una pipetta sierologica da 5 mL, aggiungere 3 mL di RPMI integrato con il 10% di siero fetale di vitello (FCS) alla capsula di Petri. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, pipettare su e giù per risospendere il tessuto nel terreno e trasferirlo in una provetta conica da 15 mL.
      NOTA: Se l'applicazione a valle è l'analisi di sequenziamento di RNA a singola cellula o di massa o la coltura cellulare, i lotti FCS devono essere testati per garantire che le cellule non vengano attivate prima dell'analisi. In alternativa, le celle possono essere processate utilizzando 1x PBS con 0,04% di BSA invece di RPMI con 10% di FCS.
    3. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, lavare la capsula di Petri con altri 2 mL di terreno per raccogliere eventuali residui di tessuto e trasferirla in una provetta conica per un volume totale di 5 mL. Tenere i tubi su ghiaccio tra una fase di lavorazione e l'altra.
    4. Utilizzando una pipetta, sospendere nuovamente la polvere di collagenasi I nel terreno di coltura Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) per ottenere la concentrazione desiderata (cioè 100 mg/mL). Aggiungere la collagenasi di tipo I alla provetta conica contenente il campione di tessuto tritato per ottenere la concentrazione finale desiderata (cioè 50 μL per 1 mg/mL).
      NOTA: Concentrazioni più elevate di collagenasi aumentano la resa cellulare, ma possono scindere i marcatori della superficie cellulare. Pertanto, i lotti di collagenasi I devono essere titolati per determinare la concentrazione ottimale necessaria per ottenere il maggior numero di cellule vitali con tutti i marcatori di superficie cellulare richiesti intatti. Ad esempio, la collagenasi I è stata testata a concentrazioni finali di 0,5 mg/mL, 1 mg/mL e 2 mg/mL su singoli campioni di cervello o midollo spinale. La vitalità cellulare è stata determinata utilizzando il metodo di esclusione del blu di tripano e i marcatori di superficie cellulare CD45, CD19 e CD4 sono stati valutati mediante citometria a flusso. Una concentrazione di 1 mg/mL di collagenasi I ha prodotto il più alto numero di cellule vive, pur mantenendo tutti i marcatori di interesse sulla superficie cellulare. Pertanto, questa concentrazione è stata utilizzata per ulteriori esperimenti che esaminano questi tipi di cellule.
    5. Risospendere delicatamente la polvere di DNasi I utilizzando cloruro di sodio 0,15 M fino alla concentrazione madre desiderata. Aggiungere la DNasi I risospesa alla provetta conica contenente il campione di tessuto tritato per ottenere una concentrazione finale di 20 U/mL.
      NOTA: I lotti DNasi I variano in base alle unità di attività per mL. La concentrazione da aggiungere al campione di tessuto cambierà in base alle unità di attività del flaconcino per millilitro. La concentrazione finale desiderata per campione è di 20 U/mL.
    6. Mettere le provette in un rack per provette a bagnomaria a 37 °C e incubare per 40 minuti. Capovolgere le provette ogni 15 minuti per mescolare accuratamente il tessuto con gli enzimi. Dopo l'incubazione, aggiungere 500 μL di EDTA 0,1 M (pH = 7,2) in ciascuna provetta per una concentrazione finale di EDTA 0,01 M e incubare per altri 5 minuti per inattivare la collagenasi.
    7. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, aggiungere 9 mL di RPMI integrato con FCS al 10% a ciascuna provetta per portare il volume di ciascuna provetta a ~14,5 mL. Centrifugare a 450 x g per 5 minuti a 4 °C. Utilizzando una pipetta Pasteur con vuoto, aspirare il surnatante facendo attenzione a non toccare il pellet cellulare.
    8. Utilizzando una pipetta sierologica da 5 mL, aggiungere 3 mL di soluzione a gradiente di densità isotonica al 100% alla provetta contenente il pellet cellulare. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, aggiungere ulteriore terreno RPMI 10% FCS per portare il volume finale a 10 mL e risospendere il pellet cellulare per creare uno strato di soluzione di gradiente di densità isotonica al 30%.
      NOTA: Preparare in anticipo il terreno di gradiente di densità isotonica al 100%, aliquotarlo e conservarlo a 4 °C per un massimo di 3 mesi. Per preparare la soluzione di gradiente di densità isotonica al 100%, diluire il terreno di densità (Tabella dei materiali) con un tampone di diluizione del terreno di densità gradiente di densità. Preparare il tampone di diluizione del terreno a gradiente di densità (80,0 g/L NaCl, 3,0 g/L KCl; 0,73 g/L Na 2 HP04, 0,20 g/L KH2HP04; 20,0 g/L glucosio) e sterilizzare con filtro utilizzando un sistema di filtraggio sottovuoto. Preparare la soluzione di gradiente di densità isotonica al 100% mescolando 1 parte di tampone di diluizione del gradiente di densità e 9 parti di terreno di sodio a gradiente di densità. Mescolare bene.
    9. Capovolgere e mescolare bene ogni provetta prima di aggiungere il sottofondo della soluzione di gradiente di densità isotonica al 70%. Inserire una pipetta sierologica da 1 mL contenente 1 mL di soluzione monotonica al 70% di gradiente di densità isotonica sul fondo della provetta. Sottoporre lentamente 1 mL di soluzione, facendo attenzione a non formare bolle. Rimuovere lentamente la pipetta sierologica dalla provetta, facendo attenzione a non disturbare il gradiente.
      NOTA: Per il sottofondo al 70%, la soluzione di gradiente di densità isotonica al 100% deve essere diluita al 70% utilizzando terreni RPMI (ad esempio, 7 mL di soluzione di gradiente di densità isotonica al 100% e 3 mL di terreno RPMI mescolati bene). Inoltre, la creazione di un sottofondo pulito e indisturbato al 70% è essenziale per la rimozione dei detriti di mielina e per ottenere sospensioni monocellulari pure all'interfaccia del gradiente dopo la centrifugazione.
    10. Centrifugare a 800 x g per 30 minuti a 4 °C senza freno. Aspirare il surnatante, compreso lo strato di detriti di mielina, fino a quando non rimangono 2-3 mL nella provetta, facendo attenzione a non disturbare lo strato cellulare. Prelevare lo strato cellulare tra il gradiente di densità del 30/70% utilizzando una pipetta da 1 mL e trasferirlo in una nuova provetta conica da 15 mL.
    11. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, aggiungere il terreno RPMI 10% FCS per portare il volume finale a 15 mL. Centrifugare 450 x g per 5 minuti a 4 °C.
      NOTA: Durante questa fase, gli strati cellulari di due provette possono essere raggruppati, se necessario. Non raggruppare più di due provette o le celle non si pelletteranno a causa di una concentrazione di terreno a gradiente ad alta densità.
    12. Aspirare il surnatante con attenzione per non disturbare il pellet cellulare. Risospendere le cellule in un volume/tampone appropriato per contare le cellule utilizzando un emocitometro (ad esempio, risospendere un singolo midollo spinale in 250 μL di tampone FACS per la colorazione superficiale a valle) (Figura 3).
    13. Utilizzando una pipetta da 1 ml, trasferire le sospensioni cellulari nella parte superiore di un tubo superiore del filtro (Tabella dei materiali) e lasciare che le cellule filtrino sul fondo della provetta per rimuovere eventuali residui di mielina.
    14. Usando il colorante di esclusione del blu di tripano, diluire e contare le cellule su un emocitometro facendo una media di almeno due griglie quadrate da 16 per una precisionedi 40,41.
    15. Procedere con la tecnica di analisi a singola cellula desiderata.
      NOTA: Utilizzando varie forme di collagenasi (ad esempio, D, tipo I, tipo II, tipo IV), le cellule immunitarie, la microglia (Figura 3), gli astrociti, i periciti, le cellule endoteliali49 e i neuroni50 possono essere isolati in modo efficiente. La conta delle cellule nucleate ottenuta per i risultati è stata la seguente utilizzando l'enzima collagenasi I titolata: cervello intero trattato con sham = 500.000-600.000 cellule; Cervello intero TMEV-IDD = 800.000–1.000.000 di cellule; Intero midollo spinale trattato con sham = 150.000-200.000 cellule; Intero midollo spinale TMEV-IDD = 300.000–400.000. La conta cellulare varia a seconda della precisione della raccolta, dell'elaborazione e della presenza di infiammazione del sistema nervoso centrale.

Risultati

Questo esperimento rappresentativo aveva lo scopo di quantificare le cellule B e T e descrivere la localizzazione delle cellule B e T nei compartimenti meningeo e parenchimale del SNC in condizioni omeostatiche e in un modello murino di SM progressiva (i.e., TMEV-IDD). TMEV-IDD è stato indotto in topi SJL femmine di 5 settimane da infezione intracranica con 5 x 106 unità formanti placca (PFU) di TMEV BeAn come descrittoin precedenza 29.

Il presente studio h...

Discussione

I metodi per valutare la composizione cellulare nel compartimento del SNC durante l'omeostasi e la malattia sono essenziali per comprendere gli stati fisiologici e patologici del SNC. Tuttavia, nonostante fungano da importante barriera nel sistema nervoso centrale e ospitino una vasta gamma di cellule immunitarie, le meningi sono spesso omesse dall'analisi perché molti metodi convenzionali di estrazione dei tessuti per il cervello e il midollo spinale non consentono la raccolta di queste membrane. Questa omissione è un...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Gli autori ringraziano il personale del Center for Comparative Medicine and Research (CCMR) di Dartmouth per la loro cura esperta dei topi utilizzati per questi studi. Il Bornstein Research Fund ha finanziato questa ricerca.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Aluminum foilanyN/A
Bovine Serum AlbuminThermoFisher Scientific37002D
CentrifugeBeckman CoulterAllegra X-12R centrifuge
Collagenase IWorthingtonLS004196
Conical tube, 15 mLVWR525-1069
Conical tube, 50 mLVWR89039-658
Cover glassHauser Scientific5000
CryomoldVWR18000-128
Curved forcepsFine Science Tools11003-14
Disposable polystyrene tube, 14 mLFisher Scientific14-959-1B
Disposable ScalpelFisher ScientificNC0595256
DNAse IWorthingtonLS002139
Dry iceAirgasN/A
Durmont #7ForcepsFine Science Tools11271-30
EDTA disodium salt dihydrateAmresco0105-500g
Ethanol, 100%anyN/A
Fetal Bovine Serum (FBS)HycloneSH30910.03
Filter top tube, 5 mLVWR352235
Fixable viability stain 780Becton Dickinson565388
Flow cytometerBeckman CoulterGallios
GlucoseFisher ChemicalD16-500
Goat anti-mouse IgG (488 conjugate)Jackson immunoresearch115-546-146
Goat anti-mouse IgG (594 conjugate)Jackson immunoresearch115-586-146
Goat anti-rabbit 488Jackson immunoresearch111-545-144
Goat anti-rat 594Jackson immunoresearch112-585-167
Goat anti-rat 650Jackson immunoresearch112-605-167
Hank's Balnced Salt Solution (HBSS)Corning21-020-CV
HemacytometerAndwin Scientific02-671-51B
HemostatFine Science Tools13004-14
HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid)ThermoFisher Scientific15630080
KClFisher chemicalBP366-500
KH2PO4 (anhydrous)Sigma AldrichP5655-100G
Liquid NitrogenAirgasN/A
Mouse FC block (CD16/32)Becton Dickinson553141
Na2HP04 (anhydrous)Fisher ChemicalS374-500
NaClFisher chemicalS671-500
Needle, 25 gaugeBecton Dickinson305122
Normal mouse serumThermoFisher Scientific31881
Nylon mesh strainerVWR352350
OCTSakura4583
Paraformaldehyde, 20%Electron Microscopy Sciences15713-SDiluted to 4% using 1 x PBS
Pasteur pipette, 9 inch, unpluggedFisher Scientific13-678-20C
PBS (1x)Corning21-040-CV
PE Rat Anti-Mouse CD4Becton Dickinson553730
PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19Becton Dickinson562329
Percoll density gradient mediaGE healthcare17-0891-01
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45Becton Dickinson550994
Petri dish, 100 mmVWR353003
pH meterFisher Scientific13-636-AB150
Pipet-AidDrummond Scientific Corporation4-000-101
Pipette 200 µlGilsonFA10005M
Pipette tips, 1 mLUSA Scientific1111-2831
Pipette tips, 200 µlUSA Scientific1111-1816
Pipette, 1 mLGilsonFA10006M
Prolong Diamond mountant with DAPIThermoFisher ScientificP36962
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32Becton Dickinson553141
Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone)Abcamab16669
Rabbit anti-mouse lamininAbcamab11575
Rat anti-mouse ERT-R7Abcamab51824
RPMI 1640Corning10-040-CV
Serological pipet, 1 mLVWR357521
Serological pipet, 10 mLVWR357551
Serological pipet, 5 mLVWR357543
Sodium hydroxideFisher ScientificS318-100
SucroseFisher chemicalS5-500
Surgical scissorsFine Science Tools14001-16
Surgical scissors, extra fineRobozRS-5882
Syringe, 10 mLBecton Dickinson302995
Syringe, 5 mLBecton Dickinson309646
Trypan blueGibco15250-061
Vacuum filter systemMillipore20207749
Vacuum flaskThomas Scientific5340-2L
Vacuum in-line filterPall Corporation4402
Vacuum lineCole PalmerEW-06414-20
Water bathThermoFisher ScientificVersa bath

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