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  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este artículo presenta dos protocolos optimizados para examinar las células inmunitarias residentes y derivadas periféricas dentro del sistema nervioso central, incluyendo el cerebro, la médula espinal y las meninges. Cada uno de estos protocolos ayuda a determinar la función y composición de las células que ocupan estos compartimentos en estado estacionario y en condiciones inflamatorias.

Resumen

El sistema nervioso central (SNC) está compuesto por el cerebro y la médula espinal y está envuelto por las meninges, capas membranosas que sirven como barrera entre la periferia y el SNC. El SNC es un sitio inmunológicamente especializado y, en condiciones de estado estacionario, el privilegio inmunitario es más evidente en el parénquima del SNC. Por el contrario, las meninges albergan una amplia gama de células residentes, incluidas las células inmunitarias innatas y adaptativas. Durante las afecciones inflamatorias desencadenadas por una lesión del SNC, la autoinmunidad, la infección o incluso la neurodegeneración, las células inmunitarias de origen periférico pueden entrar en el parénquima y residir dentro de las meninges. Se cree que estas células realizan acciones beneficiosas y perjudiciales durante la patogénesis de la enfermedad del SNC. A pesar de este conocimiento, las meninges a menudo se pasan por alto cuando se analiza el compartimento del SNC, porque los métodos convencionales de extracción de tejido del SNC omiten las capas meníngeas. Este protocolo presenta dos métodos distintos para el aislamiento rápido de tejidos murinos del SNC (es decir, cerebro, médula espinal y meninges) que son adecuados para el análisis posterior mediante técnicas unicelulares, inmunohistoquímica y métodos de hibridación in situ. Los métodos descritos proporcionan un análisis exhaustivo de los tejidos del SNC, ideal para evaluar el fenotipo, la función y la localización de las células que ocupan el compartimento del SNC en condiciones homeostáticas y durante la patogénesis de la enfermedad.

Introducción

El sistema nervioso central (SNC) es un sitio inmunológicamente especializado. El parénquima del SNC, excluyendo el espacio LCR, las meninges y la vasculatura, es considerado clásicamente como un sitio inmunoprivilegiado 1,2,3,4,5 y está relativamente desprovisto de células inmunitarias durante las condiciones homeostáticas 2,6,7. Por el contrario, las meninges, compuestas por las capas duramadre, aracnoidea y pia, son componentes cruciales del compartimento del SNC, participando activamente en la vigilancia inmunitaria homeostática y en los procesos inflamatorios durante la patogénesis de la enfermedad 3,6,7,8. Durante las condiciones de estado estacionario, las meninges albergan numerosas células centinela inmunitarias, incluidas las células linfoides innatas (ILC), los macrófagos, las células dendríticas (DC), los mastocitos, las células T y, en menor medida, las células B 9,10,11.

Las meninges son estructuras altamente vascularizadas y contienen vasos linfáticos que proporcionan una conexión linfática entre el SNC y su periferia 8,12,13,14. En las afecciones inflamatorias inducidas por lesiones del SNC, infecciones, autoinmunidad o incluso neurodegeneración, las células inmunitarias de origen periférico se infiltran en el parénquima y alteran el paisaje inmunitario dentro de las meninges. Después de la infiltración celular, las meninges pueden representar un nicho funcional para las células inmunitarias derivadas periféricamente, promoviendo la agregación de células inmunitarias, la activación local de las células inmunitarias y la supervivencia a largo plazo en el compartimento del SNC. La inflamación meníngea prominente se observa en múltiples enfermedades que afectan al SNC, incluyendo la esclerosis múltiple (EM)15,16,17,18,19, el accidente cerebrovascular 20,21, la lesión estéril 22,23 (es decir, la lesión de la médula espinal y la lesión cerebral traumática), las migrañas 24 y la infección microbiana 25,26,27,28,29. Por lo tanto, la caracterización de las células residentes y las células inmunitarias derivadas periféricamente en el compartimento meníngeo es esencial para comprender el papel de estas células durante las condiciones de estado estacionario y la patogénesis de la enfermedad.

La extracción del cerebro, la médula espinal y las meninges del cráneo y los cuerpos vertebrales es técnicamente difícil y requiere mucho tiempo. Actualmente no existen técnicas disponibles para la extracción rápida del cerebro con las tres capas meníngeas intactas. Si bien la laminectomía produce una excelente morfología del tejido de la médula espinal y preserva las capas meníngeas, requiere mucho tiempo y es extremadamente complicada30,31. Por el contrario, los métodos de extracción más convencionales, como la extirpación del cerebro del cráneo y la extrusión hidráulica de la médula espinal, facilitan la extracción rápida del tejido del SNC, pero con estas técnicas se pierden tanto las meninges aracnoideas como las durales30,31. La omisión de las capas duramadre y aracnoidea durante el aislamiento convencional de los tejidos del cerebro y la médula espinal da lugar a un análisis incompleto de las células dentro del compartimento del SNC. Por lo tanto, la identificación de nuevas técnicas enfocadas a la extracción rápida de tejidos del SNC con meninges intactas es crucial para el análisis óptimo del compartimento del SNC.

Este manuscrito presenta dos métodos para la extracción rápida del cerebro, la médula espinal y las meninges de ratones, lo que facilita el análisis posterior de las células residentes y las células inmunitarias derivadas periféricamente en el parénquima y las meninges del SNC. Estos protocolos optimizados se centran en 1) aislar suspensiones unicelulares para el análisis posterior y 2) preparar el tejido para el procesamiento histológico. La obtención de suspensiones unicelulares del cerebro, del tejido de la médula espinal y de las meninges durales y aracnoideas32 permite el análisis simultáneo de las células que residen en los compartimentos parenquimatoso y meníngeo. Las suspensiones unicelulares se pueden utilizar en diferentes aplicaciones, incluidos los ensayos de cultivo celular para realizar estimulación in vitro 33, inmunopunto ligado a enzimas (ELISpot)28,34,35, citometría de flujo36,33 y transcriptómica de una sola célula 37 o a granel. Además, el protocolo optimizado para la descalcificación de cerebros enteros y médula espinal con cráneos o columnas vertebrales intactos, respectivamente, permite la descalcificación suave del hueso circundante, dejando las meninges intactas y preservando la morfología del tejido. Este método permite la identificación selectiva de proteínas o ARN mediante técnicas de inmunohistoquímica (IHQ) o hibridación in situ (ISH) tanto en el espacio parenquimatoso como en el meníngeo. La caracterización del fenotipo, el estado de activación y la localización de las células residentes y las células inmunitarias derivadas periféricamente dentro del SNC puede proporcionar información esencial para comprender cómo los tipos de células individuales en el compartimento del SNC contribuyen a la homeostasis y la patogénesis de la enfermedad.

Protocolo

Todo el trabajo con animales utiliza protocolos revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Facultad de Medicina Geisel en Dartmouth.

1. Procesamiento de muestras de cerebro y médula espinal para la descalcificación

  1. Aislamiento de muestras de cerebro y médula espinal
    1. Sacrificar al ratón mediante inhalación de CO2 . Asegúrese de que el caudal deCO2 desplace entre el 10 % y el 30 % del volumen de la jaula por minuto.
    2. Con fórceps, levante la apófisis xifoides y corte la pared abdominal lateralmente justo debajo de la caja torácica con unas tijeras, tirando hacia arriba para evitar cortar los vasos sanguíneos u órganos subyacentes. Corta el diafragma lateralmente.
    3. Corta la caja torácica a lo largo de los bordes laterales paralelos a los pulmones hasta la clavícula. Con fórceps, levante el esternón y pinde el esternón con un hemostático. Coloque el hemostático sobre la cabeza para levantar la caja torácica y exponer el corazón.
    4. Con fórceps, agarre el corazón cerca de su vértice y haga una incisión en la aurícula derecha del corazón para proporcionar una salida. Inserte una aguja de 25 g con una jeringa de 10 ml conectada para administrar lentamente 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x helada en el ventrículo izquierdo para perfundir transcardialmente al ratón.
      NOTA: La perfusión debe ocurrir durante 4-5 minutos hasta que el hígado esté libre de sangre. Un total de 10 ml de 1x PBS suele ser suficiente para la perfusión, pero se puede utilizar más si es necesario. Un hígado limpio suele indicar una perfusión adecuada.
    5. Con unas tijeras afiladas, retire la cabeza por decapitación (Figura 1; 1). Haga una incisión en la línea media de la piel (Figura 1; 2) y voltee la piel sobre los ojos para liberar el cráneo.
    6. Cortar en el hueso nasal para liberar la mandíbula del cráneo (Figura 1; 3). Extirpa la mandíbula, la lengua y los ojos. Cortar a lo largo de los aspectos laterales del cráneo para liberar el tejido a lo largo del meato auditivo externo (Figura 1; 4). Recorte para eliminar todo el exceso de piel, músculo y tejido que recubre el cráneo.
    7. Separe la caja torácica de la columna vertebral cortando paralelamente a la columna vertebral con unas tijeras afiladas (Figura 1; 5 y 6). Realizar una pequeña incisión en la región lumbar inferior para aislar la columna vertebral (Figura 1; 7). Recorte y retire cualquier músculo restante a lo largo de la columna vertebral para exponer las vértebras (Figura 1; 8).
      NOTA: Es necesario eliminar el exceso de tejido de la columna vertebral y el cráneo para obtener una penetración adecuada del tampón de descalcificación fijador de paraformaldehído (PFA) y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).
  2. Postfijación, descalcificación y criopreservación
    1. Con fórceps, coloque el cerebro con el cráneo o la columna vertebral intactos en un tubo cónico de 15 ml que contenga 10 ml de PFA al 4 %. Colocar los tubos a 4 °C durante al menos 48 h para una fijación adecuada.
      NOTA: Para evitar la sobrefijación del tejido, no superar las 72 h de fijación. Los tiempos de fijación se amplían para las muestras óseas antes de la descalcificación. Una fijación adecuada protegerá el tejido de los efectos de la descalcificación y asegurará una mejor morfología del tejido.
    2. Enjuague el cerebro o la médula espinal retirando el tejido del PFA al 4 % con fórceps y colocando el tejido en un tubo desechable de 14 ml con 10 ml de 1x PBS durante 5 minutos. Transfiera el cerebro o la médula espinal a un tubo cónico de 50 ml con 10 ml de EDTA al 10 % (pH = 7,2–7,4).
      NOTA: El uso de un tubo más grande con 10 ml de EDTA le da al EDTA una mayor área de contacto con el tejido y acelera el proceso de descalcificación.
    3. Compruebe diariamente si el hueso está blando y flexible: retire el tejido de la solución de EDTA con pinzas, colóquelo en una placa de Petri y pruebe suavemente la suavidad del hueso con una aguja de 25 G. Si la aguja penetra fácilmente en el hueso, el proceso de descalcificación está completo.
    4. Retire el tejido de la solución de EDTA y transfiera el cerebro o la médula espinal a un tubo desechable de 14 ml que contenga 10 ml de 1x PBS y lávese durante 10 minutos. Repita el lavado.
      NOTA: La descalcificación suele tardar de 2 a 3 días. La solución debe cambiarse cada 2-3 días si el hueso aún no está adecuadamente descalcificado. Sin embargo, la incubación prolongada en EDTA después de que el hueso se haya descalcificado puede dañar la morfología del tejido.
    5. Prepare soluciones de sacarosa al 10%, 20% y 30% agregando sacarosa a 1x PBS. Por ejemplo, para sacarosa al 10%, agregue 10 g de sacarosa y lleve el volumen a 100 ml usando PBS estéril 1x. Almacene la solución a 4 °C durante un máximo de 1 mes.
      NOTA: Las soluciones de sacarosa son propensas al crecimiento de microorganismos, por lo que las muestras no deben almacenarse durante períodos prolongados de tiempo en estas soluciones.
    6. Retirar el tejido del 1x PBS, colocarlo en 10 mL de solución de sacarosa al 10% y guardarlo a 4 °C. Deje reposar el pañuelo durante 24 horas o hasta que se hunda hasta el fondo del tubo.
    7. Repita este proceso, moviendo el tejido a una solución de sacarosa al 20% primero y finalmente a una solución de sacarosa al 30%. Deje que el tejido se hunda en sacarosa al 30% (al menos 24 h) y proceda a la inclusión del tejido.
  3. Inclusión y congelación de tejidos
    1. Con unas pinzas, retire el tejido de la sacarosa al 30%, colóquelo en una placa de Petri e incline la placa para eliminar el exceso de solución de sacarosa en el tejido. Con un bisturí, corte el tejido en los segmentos deseados.
    2. Cree una capa delgada de compuesto de temperatura óptima de corte (OCT) en la parte inferior del criomold y coloque la(s) pieza(s) de tejido en el molde. Cubra el tejido completamente con el compuesto OCT, asegurándose de que no haya burbujas.
    3. Congele rápidamente los bloques colocando el cursor sobre nitrógeno líquido38 o colocando los bloques en una suspensión de hielo seco / isopropanol al 100%39 hasta que el bloque esté opaco. Envuelva los criomoldes en papel de aluminio y almacene los bloques a -80 °C para su almacenamiento a largo plazo. Mueva los bloques a -20 °C antes de seccionarlos.
      NOTA: Se debe tener cuidado al seccionar y realizar protocolos histológicos en cerebros descalcificados, ya que las capas del cráneo y la meníngea pueden perderse si las secciones se manipulan bruscamente.

2. Preparación de las meninges y tejidos del SNC para la tinción por citometría de flujo

  1. Extracción del casquete craneal y del cerebro
    1. Con unas tijeras afiladas, retire la cabeza por decapitación (Figura 2A; 1). Con unas tijeras, haga una incisión en la línea media de la piel (Figura 2A; 2) y voltee la piel sobre los ojos para liberar el cráneo.
    2. Coloque las tijeras dentro del foramen magna y comience a cortar el cráneo lateralmente a lo largo de las cortezas hacia el bulbo olfatorio, manteniendo las incisiones por encima del meato auditivo externo y la mandíbula (Figura 2A; 3). Realice los mismos cortes en el lado opuesto, con cortes que se encuentran en el bulbo olfatorio para liberar la tapa del cráneo del cerebro (Figura 2A; 3).
    3. Con unas pinzas, retire el casquete craneal y colóquelo en un tubo cónico de 15 ml que contenga 5 ml de medio RPMI frío suplementado con 25 mM de HEPES. Mantenga el tubo en hielo.
    4. Con pinzas curvas, coloque las pinzas debajo de la base del cerebro y levántelas para liberar el cerebro de la tapa del cráneo. Coloque el cerebro en un tubo cónico de 15 mL que contenga 5 mL de RPMI frío suplementado con 25 mM de HEPES. Mantenga el tubo en hielo hasta que se procese.
  2. Extracción de la columna vertebral y el tejido de la médula espinal
    1. Con fórceps y tijeras afiladas, separe la caja torácica de la columna vertebral cortando paralelamente a la columna vertebral (Figura 2A; 4 y 5). Realizar una pequeña incisión en la región lumbar inferior para aislar la columna vertebral (Figura 2A; 6). Recorte y retire cualquier músculo restante a lo largo de la columna vertebral para exponer las vértebras (Figura 2A; 7).
    2. Coloque las tijeras quirúrgicas extrafinas dentro de la columna vertebral y corte a lo largo del borde lateral de la columna (Figura 2C). Corta completamente el borde lateral opuesto para dividir la columna vertebral en una porción anterior y otra posterior.
      NOTA: La médula espinal permanecerá unida a la columna vertebral.
    3. Con fórceps, retire lenta y cuidadosamente la médula espinal de la columna vertebral y coloque el tejido en un tubo cónico de 15 ml que contenga 5 ml de RPMI frío con 25 mM de HEPES. Transfiera las porciones anterior y posterior de la columna vertebral a un tubo cónico de 15 mL que contenga 5 mL de RPMI frío con 25 mM de HEPES.
  3. Extracción de las meninges para preparar suspensiones unicelulares
    1. Con unas pinzas, retire el casquete craneal del medio RPMI. Uso de pinzas afiladas (pinzas #7; Tabla de materiales), marque alrededor del borde exterior de la tapa del cráneo (Figura 2B) y retire las meninges del borde de la tapa del cráneo, raspando para eliminar las meninges durales y aracnoideas. Coloca las meninges en una placa de Petri.
      NOTA: La extirpación de las meninges tanto del cerebro como de la médula espinal requiere práctica. Si el usuario experimenta dificultades para extraer las meninges, use un microscopio de disección para ayudar en la extracción.
    2. Retire la columna vertebral del tubo. Con pinzas afiladas, marque alrededor de los bordes de la columna vertebral para liberar las meninges y despegue las meninges del borde de la vértebra con pinzas curvas. Coloca las meninges en una placa de Petri.
    3. Coloque un colador de malla de nailon en un tubo cónico de 50 ml. Mueva las meninges al colador y agregue 3 mL de RPMI suplementado con 25 mM de HEPES. Usando el émbolo de una jeringa de 5 ml, muela el tejido y el medio a través del colador.
    4. Con una pipeta serológica de 5 ml, lave el colador con 2 a 3 ml adicionales de medio RPMI/HEPES hasta que todo el tejido visible haya pasado a través del colador.
      NOTA: Para obtener un número adecuado de células para el análisis citométrico de flujo, es posible que sea necesario agrupar las meninges de varios animales. En este experimento (Figura 3 y Figura 4), se agruparon las meninges del cerebro y la médula espinal de 4 a 5 ratones. Si las muestras se agrupan, se requerirán medios adicionales para moler el tejido a través del colador de malla de nailon para evitar el sobrecalentamiento del tejido.
    5. Con una pipeta serológica de 10 ml, transfiera las células y el medio a un tubo cónico nuevo de 15 ml. Con una pipeta serológica de 10 ml, lave el tubo cónico de 50 ml con 5 ml de medio para recoger las células restantes. Centrifugar a 450 x g durante 5 min a 4 °C para granular las células.
    6. Utilizando una pipeta Pasteur con vacío, aspire el sobrenadante teniendo cuidado de evitar el gránulo celular y vuelva a suspender las células en un volumen y tampón adecuados.
    7. Para contar la suspensión unicelular, diluya un pequeño volumen de las células (es decir, 5-10 μL) con colorante de exclusión azul de tripano (dilución 1:10) y RPMI. Añadir 10 μL de la dilución al hemocitómetro.
    8. Cuente las celdas como se describió anteriormente40,41, promediando al menos dos cuadrículas de 16 cuadrados para mayor precisión.
      NOTA: En la Figura 3, por ejemplo, las células peletizadas agrupadas de las meninges se resuspendieron en 250 μL de tampón de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) (1x PBS con 1% de FBS) para la tinción superficial posterior. Las células se diluyeron 1:10 para el recuento (5 μL de células, 5 μL de azul de tripano, 40 μL de RPMI). Esta dilución produjo entre 50 y 100 células por cada 16 cuadrículas cuadradas, lo que garantiza un recuento de células más preciso porque las células no son ni demasiado densas ni superpuestas ni demasiado escasas. Los recuentos de células nucleadas de las meninges combinadas del cerebro y la médula espinal por ratón fueron los siguientes: para las meninges de ratones con tratamiento simulado = 100.000-150.000 células y para las meninges de los ratones de la enfermedad desmielinizante inducida por el virus de la encefalomielitis murina de Theiler (TMEV-IDD) = 300.000-350.000 células. Los recuentos celulares variarán según la precisión de la recolección, el procesamiento y si hay inflamación meníngea.
    9. Proceda a la técnica de célula única deseada, como una superficie FACS (Figura 3)14,36,42,43,44, protocolos de tinción intracelular 33,45, estimulación in vitro, ensayos de cultivo celular 33,46,47, ensayo ELISPOT 28,34,35 y células a granel o unicelulares Transcriptómica37,48.
      NOTA: Mantenga todos los tubos en hielo entre los pasos de procesamiento.
  4. Preparación de suspensiones unicelulares de tejido cerebral y de la médula espinal
    1. Transfiera el tejido del cerebro o de la médula espinal con medios a la parte superior de la placa de Petri de 100 mm vertiendo el tejido y los medios del tubo. Con unas pinzas, mueva el tejido hasta el fondo de la placa de Petri. Pica finamente el cerebro o la médula espinal con una cuchilla de afeitar estéril. Con la cuchilla de afeitar, mueva el pañuelo picado al fondo del plato raspando para recoger el pañuelo.
      NOTA: Para el protocolo de digestión enzimática que se indica a continuación, se pueden agrupar hasta dos médulas espinales para su procesamiento. Los cerebros deben ser procesados individualmente.
    2. Con una pipeta serológica de 5 ml, agregue 3 ml de RPMI suplementado con suero fetal de ternero (FCS) al 10% a la placa de Petri. Con una pipeta serológica de 10 ml, pipetee hacia arriba y hacia abajo para resuspender el tejido en el medio y transferirlo a un tubo cónico de 15 ml.
      NOTA: Si la aplicación posterior es el análisis de secuenciación de ARN a granel o de una sola célula o el cultivo celular, los lotes de FCS deben probarse para garantizar que las células no se activen antes del análisis. Alternativamente, las celdas se pueden procesar usando 1x PBS con 0.04% BSA en lugar de RPMI con 10% FCS.
    3. Con una pipeta serológica de 10 ml, lave la placa de Petri con 2 ml adicionales de medio para recolectar cualquier tejido residual y transferirlo a un tubo cónico para obtener un volumen total de 5 ml. Mantenga los tubos en hielo entre los pasos de procesamiento.
    4. Con una pipeta, vuelva a suspender el polvo de colagenasa I en un medio de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) para obtener la concentración deseada (es decir, 100 mg/ml). Añadir colagenasa tipo I al tubo cónico que contiene la muestra de tejido picado para obtener la concentración final deseada (es decir, 50 μL por 1 mg/mL).
      NOTA: Las concentraciones más altas de colagenasa aumentarán el rendimiento celular, pero pueden escindir los marcadores de la superficie celular. Por lo tanto, los lotes de colagenasa I deben valorarse para determinar la concentración óptima necesaria para obtener el mayor número de células viables con todos los marcadores de superficie celular necesarios intactos. Por ejemplo, la colagenasa I se analizó a concentraciones finales de 0,5 mg/ml, 1 mg/ml y 2 mg/ml en muestras individuales de cerebro o médula espinal. La viabilidad celular se determinó mediante el método de exclusión de azul de tripano y los marcadores de superficie celular CD45, CD19 y CD4 se evaluaron mediante citometría de flujo. Una concentración de 1 mg/ml de colagenasa I produjo el mayor recuento de células vivas al tiempo que conservó todos los marcadores de superficie celular de interés. Por lo tanto, esta concentración se utilizó para otros experimentos que examinaron estos tipos de células.
    5. Resuspender suavemente el polvo de DNasa I con cloruro de sodio 0,15 M hasta la concentración de material deseada. Añadir la DNasa I resuspendida al tubo cónico que contiene la muestra de tejido picado para obtener una concentración final de 20 U/mL.
      NOTA: Los lotes de DNasa I varían según las unidades de actividad por ml. La concentración que se añadirá a la muestra de tejido cambiará en función de las unidades de actividad por mililitro del vial madre. La concentración final deseada por muestra es de 20 U/mL.
    6. Coloque los tubos en una rejilla de tubos en un baño de agua a 37 °C e incube durante 40 min. Invierta los tubos cada 15 minutos para mezclar bien el tejido con las enzimas. Después de la incubación, añadir 500 μL de EDTA 0,1 M (pH = 7,2) a cada tubo para obtener una concentración final de 0,01 M de EDTA e incubar durante 5 min más para inactivar la colagenasa.
    7. Con una pipeta serológica de 10 ml, agregue 9 ml de RPMI suplementado con FCS al 10% a cada tubo para llevar el volumen de cada tubo a ~14,5 ml. Centrifugar a 450 x g durante 5 min a 4 °C. Utilizando una pipeta Pasteur con vacío, aspire el sobrenadante teniendo cuidado de no tocar el gránulo celular.
    8. Con una pipeta serológica de 5 ml, añadir 3 ml de solución de gradiente de densidad isotónica al 100 % al tubo que contiene el gránulo celular. Con una pipeta serológica de 10 ml, agregue medios adicionales de RPMI 10% FCS para llevar el volumen final a 10 ml y vuelva a suspender el gránulo celular para crear una capa de solución de gradiente de densidad isotónica al 30%.
      NOTA: Prepare el medio de gradiente de densidad isotónica 100% de stock con anticipación, alícuota, y guárdelo a 4 °C durante un máximo de 3 meses. Para preparar la solución de gradiente de densidad isotónica 100% original, diluya el medio de gradiente de densidad (Tabla de materiales) con tampón de dilución de medios de gradiente de densidad. Prepare el tampón de dilución de medios de gradiente de densidad (80,0 g/L de NaCl, 3,0 g/L de KCl; 0,73 g/L de Na2 HP0 4, 0,20 g/L de KH2HP04; 20,0 g/L de glucosa) y filtre la esterilización con un sistema de filtro de vacío. Prepare la solución de gradiente de densidad isotónica 100% original mezclando 1 parte de tampón de dilución de gradiente de densidad y 9 partes de medios de gradiente de densidad. Mezclar bien.
    9. Invierta y mezcle bien cada tubo antes de agregar la base de la solución de gradiente de densidad isotónica al 70%. Inserte una pipeta serológica de 1 ml que contenga 1 ml de solución de gradiente de densidad isotónica al 70% en el fondo del tubo. Coloque lentamente 1 ml de la solución, teniendo cuidado de no hacer burbujas. Retire lentamente la pipeta serológica del tubo, teniendo cuidado de no alterar el gradiente.
      NOTA: Para la capa subyacente al 70 %, la solución de gradiente de densidad isotónica al 100 % debe diluirse al 70 % utilizando medios RPMI (es decir, 7 ml de solución de gradiente de densidad isotónica al 100 % y 3 ml de medios RPMI bien mezclados). Además, la creación de una capa de base limpia e inalterada del 70% es esencial para la eliminación de restos de mielina y para obtener suspensiones unicelulares puras en la interfaz de gradiente después de la centrifugación.
    10. Centrifugar a 800 x g durante 30 min a 4 °C sin freno. Aspire el sobrenadante, incluida la capa de restos de mielina, hasta que queden 2-3 ml en el tubo, teniendo cuidado de no alterar la capa celular. Extraiga la capa celular entre el gradiente de densidad del 30/70% utilizando una pipeta de 1 ml y transfiérala a un nuevo tubo cónico de 15 ml.
    11. Con una pipeta serológica de 10 ml, agregue medios RPMI 10% FCS para llevar el volumen final a 15 ml. Centrifugar 450 x g durante 5 min a 4 °C.
      NOTA: Durante este paso, las capas de células de dos tubos se pueden agrupar si es necesario. No agrupe más de dos tubos o las células no se granularán debido a una concentración de medios de gradiente de alta densidad.
    12. Aspire el sobrenadante con cuidado para no alterar el gránulo de la célula. Vuelva a suspender las células en un volumen/tampón adecuado para contar las células utilizando un hemocitómetro (p. ej., resuspender una sola médula espinal en 250 μL de tampón FACS para la tinción superficial posterior) (Figura 3).
    13. Con una pipeta de 1 ml, transfiera las suspensiones celulares a la parte superior de un tubo superior del filtro (Tabla de materiales) y deje que las células se filtren al fondo del tubo para eliminar cualquier residuo de mielina restante.
    14. Usando un tinte de exclusión azul de tripano, diluya y cuente las células en un hemocitómetro promediando al menos dos cuadrículas de 16 cuadrados para una precisión40,41.
    15. Proceda con la técnica de análisis de una sola célula deseada.
      NOTA: Utilizando varias formas de colagenasa (es decir, D, tipo I, tipo II, tipo IV), las células inmunitarias, la microglía (Figura 3), los astrocitos, los pericitos, las células endoteliales49 y las neuronas50 se pueden aislar de manera eficiente. Los recuentos de células nucleadas obtenidos para los resultados fueron los siguientes utilizando la enzima colagenasa I titulada: Cerebro entero tratado simulado = 500.000-600.000 células; Cerebro completo de TMEV-IDD = 800.000-1.000.000 de células; Médula espinal entera tratada de forma simulada = 150.000–200.000 células; Médula espinal completa de TMEV-IDD = 300.000–400.000. Los recuentos celulares variarán dependiendo de la precisión de la recolección, el procesamiento y la presencia de inflamación del SNC.

Resultados

Este experimento representativo tuvo como objetivo cuantificar las células B y T y describir la localización de las células B y T en los compartimentos meníngeo y parenquimatoso del SNC en condiciones homeostáticas, así como en un modelo de EM progresiva murina (es decir, TMEV-IDD). La TMEV-IDD fue inducida en ratones hembra SJL de 5 semanas de edad mediante infección intracraneal con 5 x 106 unidades formadoras de placa (UFP) de TMEV BeAn como se describió anteriormente29.

...

Discusión

Los métodos para evaluar la composición celular en el compartimento del SNC durante la homeostasis y la enfermedad son esenciales para comprender los estados fisiológicos y patológicos del SNC. Sin embargo, a pesar de servir como una barrera importante en el SNC y albergar una amplia gama de células inmunitarias, las meninges a menudo se omiten del análisis porque muchos métodos convencionales de extracción de tejidos para el cerebro y la médula espinal no permiten la recolección de estas membranas. Esta omisi?...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen al personal del Centro de Medicina e Investigación Comparativa (CCMR) de Dartmouth por su atención experta a los ratones utilizados para estos estudios. El Fondo de Investigación Bornstein financió esta investigación.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Aluminum foilanyN/A
Bovine Serum AlbuminThermoFisher Scientific37002D
CentrifugeBeckman CoulterAllegra X-12R centrifuge
Collagenase IWorthingtonLS004196
Conical tube, 15 mLVWR525-1069
Conical tube, 50 mLVWR89039-658
Cover glassHauser Scientific5000
CryomoldVWR18000-128
Curved forcepsFine Science Tools11003-14
Disposable polystyrene tube, 14 mLFisher Scientific14-959-1B
Disposable ScalpelFisher ScientificNC0595256
DNAse IWorthingtonLS002139
Dry iceAirgasN/A
Durmont #7ForcepsFine Science Tools11271-30
EDTA disodium salt dihydrateAmresco0105-500g
Ethanol, 100%anyN/A
Fetal Bovine Serum (FBS)HycloneSH30910.03
Filter top tube, 5 mLVWR352235
Fixable viability stain 780Becton Dickinson565388
Flow cytometerBeckman CoulterGallios
GlucoseFisher ChemicalD16-500
Goat anti-mouse IgG (488 conjugate)Jackson immunoresearch115-546-146
Goat anti-mouse IgG (594 conjugate)Jackson immunoresearch115-586-146
Goat anti-rabbit 488Jackson immunoresearch111-545-144
Goat anti-rat 594Jackson immunoresearch112-585-167
Goat anti-rat 650Jackson immunoresearch112-605-167
Hank's Balnced Salt Solution (HBSS)Corning21-020-CV
HemacytometerAndwin Scientific02-671-51B
HemostatFine Science Tools13004-14
HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid)ThermoFisher Scientific15630080
KClFisher chemicalBP366-500
KH2PO4 (anhydrous)Sigma AldrichP5655-100G
Liquid NitrogenAirgasN/A
Mouse FC block (CD16/32)Becton Dickinson553141
Na2HP04 (anhydrous)Fisher ChemicalS374-500
NaClFisher chemicalS671-500
Needle, 25 gaugeBecton Dickinson305122
Normal mouse serumThermoFisher Scientific31881
Nylon mesh strainerVWR352350
OCTSakura4583
Paraformaldehyde, 20%Electron Microscopy Sciences15713-SDiluted to 4% using 1 x PBS
Pasteur pipette, 9 inch, unpluggedFisher Scientific13-678-20C
PBS (1x)Corning21-040-CV
PE Rat Anti-Mouse CD4Becton Dickinson553730
PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19Becton Dickinson562329
Percoll density gradient mediaGE healthcare17-0891-01
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45Becton Dickinson550994
Petri dish, 100 mmVWR353003
pH meterFisher Scientific13-636-AB150
Pipet-AidDrummond Scientific Corporation4-000-101
Pipette 200 µlGilsonFA10005M
Pipette tips, 1 mLUSA Scientific1111-2831
Pipette tips, 200 µlUSA Scientific1111-1816
Pipette, 1 mLGilsonFA10006M
Prolong Diamond mountant with DAPIThermoFisher ScientificP36962
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32Becton Dickinson553141
Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone)Abcamab16669
Rabbit anti-mouse lamininAbcamab11575
Rat anti-mouse ERT-R7Abcamab51824
RPMI 1640Corning10-040-CV
Serological pipet, 1 mLVWR357521
Serological pipet, 10 mLVWR357551
Serological pipet, 5 mLVWR357543
Sodium hydroxideFisher ScientificS318-100
SucroseFisher chemicalS5-500
Surgical scissorsFine Science Tools14001-16
Surgical scissors, extra fineRobozRS-5882
Syringe, 10 mLBecton Dickinson302995
Syringe, 5 mLBecton Dickinson309646
Trypan blueGibco15250-061
Vacuum filter systemMillipore20207749
Vacuum flaskThomas Scientific5340-2L
Vacuum in-line filterPall Corporation4402
Vacuum lineCole PalmerEW-06414-20
Water bathThermoFisher ScientificVersa bath

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