АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной работе представлены два оптимизированных протокола исследования резидентных и периферических иммунных клеток в центральной нервной системе, включая головной и спинной мозг и мозговые оболочки. Каждый из этих протоколов помогает установить функцию и состав клеток, занимающих эти компартменты, в равновесном состоянии и воспалительных условиях.

Аннотация

Центральная нервная система (ЦНС) состоит из головного и спинного мозга и окружена мозговыми оболочками, мембранными слоями, служащими барьером между периферией и ЦНС. ЦНС является иммунологически специализированным участком, и в стационарных условиях иммунная привилегия наиболее выражена в паренхиме ЦНС. Напротив, мозговые оболочки содержат разнообразный набор резидентных клеток, включая врожденные и адаптивные иммунные клетки. Во время воспалительных состояний, вызванных повреждением ЦНС, аутоиммунными заболеваниями, инфекцией или даже нейродегенерацией, периферические иммунные клетки могут проникать в паренхиму и поселиться в мозговых оболочках. Считается, что эти клетки выполняют как полезные, так и вредные действия в патогенезе ЦНС. Несмотря на эти знания, мозговые оболочки часто упускаются из виду при анализе компартмента ЦНС, потому что традиционные методы экстракции тканей ЦНС опускают менингеальные слои. В этом протоколе представлены два различных метода быстрого выделения тканей ЦНС мышей (т.е. головного мозга, спинного мозга и мозговых оболочек), которые подходят для последующего анализа с помощью одноклеточных методов, иммуногистохимии и методов гибридизации in situ. Описанные методы обеспечивают комплексный анализ тканей ЦНС, идеально подходящий для оценки фенотипа, функции и локализации клеток, занимающих компартмент ЦНС, в гомеостатических условиях и при патогенезе заболевания.

Введение

Центральная нервная система (ЦНС) является иммунологически специализированным участком. Паренхима ЦНС, исключая ликворное пространство, мозговые оболочки и сосудистую сеть, классически рассматривается как иммунопривилегированный участок 1,2,3,4,5 и относительно лишена иммунных клеток в гомеостатических условиях 2,6,7. Напротив, мозговые оболочки, состоящие из слоев твердой мозговой оболочки, арахноидального слоя и слоев мия, являются важнейшими компонентами компартмента ЦНС, активно участвуя в гомеостатическом иммунном надзоре и воспалительных процессах при патогенезе заболевания 3,6,7,8. В равновесном состоянии мозговые оболочки поддерживают многочисленные иммунные клетки, включая врожденные лимфоидные клетки (ILC), макрофаги, дендритные клетки (DC), тучные клетки, Т-клетки и, в меньшей степени, В-клетки 9,10,11.

Мозговые оболочки представляют собой сильно васкуляризированные структуры и содержат лимфатические сосуды, обеспечивающие лимфатическую связь между ЦНС и ее периферией 8,12,13,14. При воспалительных состояниях, вызванных повреждением ЦНС, инфекциями, аутоиммунными заболеваниями или даже нейродегенерацией, периферические иммунные клетки проникают в паренхиму и изменяют иммунный ландшафт в мозговых оболочках. После клеточной инфильтрации мозговые оболочки могут представлять собой функциональную нишу для периферических иммунных клеток, способствуя агрегации иммунных клеток, локальной активации иммунных клеток и длительному выживанию в компартменте ЦНС. Выраженное воспаление менингеальных оболочек наблюдается при множественных заболеваниях, поражающих ЦНС, включая рассеянный склероз (РС)15,16,17,18,19, инсульт 20,21, стерильные повреждения 22,23 (т.е. повреждение спинного мозга и черепно-мозговые травмы), мигрени 24 и микробную инфекцию 25,26,27,28,29. Таким образом, характеристика резидентных клеток и периферических иммунных клеток в менингеальном компартменте имеет важное значение для понимания роли этих клеток в стационарных условиях и патогенеза заболевания.

Извлечение головного, спинного мозга и мозговых оболочек из черепной коробки и тел позвонков является технически сложным и трудоемким процессом. В настоящее время не существует методов быстрого извлечения мозга с неповрежденными всеми тремя менингеальными слоями. Несмотря на то, что ламинэктомия дает превосходную морфологию тканей спинного мозга и сохраняет менингеальные слои, она чрезвычайно трудоемка и сложна30,31. И наоборот, более традиционные методы экстракции, такие как извлечение головного мозга из черепной коробки и гидравлическая экструзия спинного мозга, способствуют быстрому извлечению ткани ЦНС, но при использовании этих методов утрачиваются как паутинные, так и твердые мозговые оболочки30,31. Опущение твердой мозговой оболочки и паутинных слоев при обычном выделении тканей головного и спинного мозга приводит к неполному анализу клеток в компартменте ЦНС. Таким образом, идентификация новых методик, ориентированных на быстрое извлечение тканей ЦНС с интактными мозговыми оболочками, имеет решающее значение для оптимального анализа компартмента ЦНС.

В данной статье представлены два метода быстрого извлечения головного, спинного мозга и мозговых оболочек у мышей, облегчающие последующий анализ резидентных клеток и периферических иммунных клеток в паренхиме и мозговых оболочках ЦНС. Эти оптимизированные протоколы сосредоточены на 1) выделении одноклеточных суспензий для последующего анализа и 2) подготовке ткани к гистологической обработке. Получение одноклеточных суспензий из тканей головного мозга, спинного мозга, твердых мозговых и паутинных мозгов32 позволяет проводить одновременный анализ клеток, находящихся как в паренхиматозном, так и в менингеальном компартментах. Одноклеточные суспензии могут быть использованы в различных областях, включая анализ клеточных культур для стимуляции in vitro 33, иммуноферментное пятно (ELISpot)28,34,35, проточную цитометрию 36,33 и одноклеточную 37 или объемную транскриптомику. Кроме того, оптимизированный протокол декальцинации всего головного и спинного мозга с интактными черепами или позвоночными столбами, соответственно, позволяет мягко декальцинировать окружающую кость, оставляя мозговые оболочки нетронутыми и сохраняя морфологию тканей. Этот метод позволяет проводить селективную идентификацию белков или РНК с помощью методов иммуногистохимии (ИГХ) или гибридизации in situ (ISH) как в паренхимозном, так и в менингеальном пространствах. Характеристика фенотипа, состояния активации и локализации резидентных клеток и периферических иммунных клеток в ЦНС может предоставить информацию, необходимую для понимания того, как отдельные типы клеток в компартменте ЦНС вносят вклад в гомеостаз и патогенез заболевания.

протокол

Во всех работах с животными используются протоколы, рассмотренные и одобренные Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Медицинской школе Гейзеля в Дартмуте.

1. Обработка образцов головного и спинного мозга для декальцинации

  1. Выделение образцов головного и спинного мозга
    1. Усыпьте мышь с помощью ингаляции CO2 . Следите за тем, чтобы расход CO2 вытеснялся на 10–30% от объема сепаратора в минуту.
    2. Используя щипцы, приподнимите мечевидный отросток и разрежьте ножницами брюшную стенку сбоку чуть ниже грудной клетки, подтягивая вверх, чтобы избежать перерезания нижележащих кровеносных сосудов или органов. Разрежьте диафрагму сбоку.
    3. Разрежьте грудную клетку по боковым краям параллельно легким вплоть до ключицы. С помощью щипцов приподнимите грудину и зажмите грудину гемостатом. Поместите гемостат над головой, чтобы отодвинуть грудную клетку и обнажить сердце.
    4. С помощью щипцов захватите сердце возле его верхушки и сделайте надрез в правом предсердии сердца, чтобы обеспечить выход. Введите иглу 25 G со шприцем 10 мл, чтобы медленно ввести 10 мл ледяного 1x фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) в левый желудочек для транскардиальной перфузии мыши.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перфузия должна происходить в течение 4-5 минут до тех пор, пока печень не очистится от крови. Для перфузии обычно достаточно 10 мл 1x PBS, но при необходимости можно использовать и больше. Прозрачная печень обычно указывает на адекватную перфузию.
    5. Острыми ножницами удалите голову путем обезглавливания (рис. 1; 1). Сделайте разрез на коже по средней линии (рис. 1; 2) и переверните кожу над глазами, чтобы освободить череп.
    6. Надрезают носовую кость, чтобы освободить нижнюю челюсть от черепа (рис. 1; 3). Удалите нижнюю челюсть, язык и глаза. Разрезают вдоль боковых сторон черепа, чтобы освободить ткань вдоль наружного слухового прохода (рис. 1; 4). Обрезайте, чтобы удалить всю лишнюю кожу, мышцы и ткани, покрывающие череп.
    7. Отделите грудную клетку от позвоночного столба, разрезав параллельно позвоночнику острыми ножницами (рис. 1; 5 и 6). Сделайте небольшой надрез в нижней поясничной области, чтобы изолировать позвоночный столб (рис. 1; 7). Обрежьте и удалите все оставшиеся мышцы вдоль позвоночника, чтобы обнажить позвонки (Рисунок 1; 8).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление лишней ткани из позвоночного столба и черепа необходимо для получения адекватного проникновения фиксирующего параформальдегида (PFA) и этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) буфера для декальцификации.
  2. Постфиксация, декальцинация и криоконсервация
    1. С помощью щипцов поместите головной мозг с неповрежденным черепом или позвоночником в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 10 мл 4% PFA. Поместите пробирки при температуре 4 °C не менее чем на 48 часов для надлежащей фиксации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание чрезмерной фиксации ткани не превышайте 72 ч фиксации. Время фиксации образцов костей перед декальцинацией увеличивается. Адекватная фиксация защитит ткани от последствий декальцинации и обеспечит лучшую морфологию тканей.
    2. Промойте головной или спинной мозг, удалив ткань из 4% PFA щипцами и поместив ткань в одноразовую пробирку объемом 14 мл с 10 мл 1x PBS на 5 минут. Перенесите головной или спинной мозг в коническую пробирку объемом 50 мл с 10 мл 10% ЭДТА (рН = 7,2–7,4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование пробирки большего размера с 10 мл ЭДТА дает ЭДТА большую площадь контакта с тканью и ускоряет процесс декальцинации.
    3. Ежедневно проверяйте, мягкая ли кость и податливая: извлеките ткань из раствора ЭДТА с помощью щипцов, поместите ее на чашку Петри и осторожно проверьте мягкость кости иглой 25 G. Если игла легко проникает в кость, процесс декальцинации завершен.
    4. Извлеките ткань из раствора ЭДТА и перенесите головной или спинной мозг в одноразовую пробирку объемом 14 мл, содержащую 10 мл 1x PBS, и промойте в течение 10 минут. Повторите стирку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Декальцинация обычно занимает 2–3 дня. Раствор следует менять каждые 2–3 дня, если кость еще недостаточно декальцинирована. Однако длительная инкубация в ЭДТА после декальцинации кости может повредить морфологию ткани.
    5. Приготовьте 10%, 20% и 30% растворы сахарозы, добавив сахарозу в 1x PBS. Например, для 10% сахарозы добавьте 10 г сахарозы и доведите объем до 100 мл, используя стерильный 1x PBS. Хранить раствор при температуре 4 °C до 1 месяца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Растворы сахарозы склонны к росту микроорганизмов, поэтому образцы не следует хранить в этих растворах в течение длительных периодов времени.
    6. Извлеките ткань из 1x PBS, поместите ее в 10 мл 10% раствора сахарозы и храните при температуре 4 °C. Оставьте ткань на 24 часа или пока она не опустится на дно пробирки.
    7. Повторите этот процесс, переместив ткань сначала в 20% раствор сахарозы, а затем в 30% раствор сахарозы. Дайте ткани погрузиться в 30% сахарозу (не менее 24 ч) и приступайте к заделке ткани.
  3. Встраивание и замораживание тканей
    1. С помощью щипцов удалите ткань из 30% сахарозы, поместите ее на чашку Петри и наклоните чашку, чтобы избавиться от излишков раствора сахарозы на ткани. С помощью скальпеля разрежьте ткань на нужные сегменты.
    2. Создайте тонкий слой компаунда оптимальной температуры резки (OCT) на дне криомолда и поместите кусочек (кусочки) ткани в форму. Полностью покройте ткань ОКТ-соединением, убедившись в отсутствии пузырьков.
    3. Мгновенную заморозку блоков, наведя курсор на жидкий азот 38 или поместив блоки на 100% изопропанол/суспензиюсухого льда39 до тех пор, пока блок не станет непрозрачным. Заверните криоформы в алюминиевую фольгу и храните блоки при температуре -80 °C для длительного хранения. Переместите блоки до -20 °C перед секционированием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо соблюдать осторожность при секционировании и выполнении гистологических протоколов на декальцинированном головном мозге, так как слои черепа и менингеальных оболочек могут быть потеряны при грубом обращении со срезами.

2. Подготовка мозговых оболочек и тканей ЦНС к окрашиванию методом проточной цитометрии

  1. Извлечение черепной чашечки и головного мозга
    1. Острыми ножницами удалите голову путем обезглавливания (рис. 2А; 1). С помощью ножниц сделайте разрез на коже по средней линии (рис. 2А; 2) и переверните кожу над глазами, чтобы освободить череп.
    2. Поместите ножницы в большое затылочное отверстие и начните разрезать череп латерально вдоль коры по направлению к обонятельной луковице, сохраняя разрезы над наружным слуховым проходом и нижней челюстью (рис. 2А; 3). Выполните те же надрезы на противоположной стороне, при этом надрезы сходятся у обонятельной луковицы, чтобы освободить черепную чашечку от мозга (рис. 2А; 3).
    3. С помощью щипцов откинуть черепную крышку и поместить ее в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 5 мл холодной среды RPMI с добавлением 25 мМ HEPES. Держите трубку на льду.
    4. Используя изогнутые щипцы, поместите щипцы ниже основания мозга и приподнимите, чтобы освободить мозг от черепной чашечки. Поместите мозг в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 5 мл холодного RPMI с добавлением 25 мМ HEPES. Держите тюбик на льду до обработки.
  2. Извлечение тканей позвоночного столба и спинного мозга
    1. С помощью щипцов и острых ножниц отделите грудную клетку от позвоночного столба, разрезав параллельно позвоночнику (рис. 2А; 4 и 5). Сделайте небольшой надрез в нижней поясничной области, чтобы изолировать позвоночный столб (рис. 2А; 6). Обрежьте и удалите все оставшиеся мышцы вдоль позвоночника, чтобы обнажить позвонки (Рисунок 2A; 7).
    2. Поместите сверхтонкие хирургические ножницы в позвоночный столб и разрежьте вдоль бокового края столба (Рисунок 2C). Полностью обрежьте противоположный боковой край, чтобы разделить позвоночный столб на переднюю и заднюю части.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Спинной мозг останется прикрепленным к позвонковому столбу.
    3. С помощью щипцов медленно и осторожно отделите спинной мозг от позвоночного столба и поместите ткань в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 5 мл холодного RPMI с 25 мМ HEPES. Перенесите переднюю и заднюю части позвоночного столба в коническую трубку объемом 15 мл, содержащую 5 мл холодного RPMI с 25 мМ HEPES.
  3. Удаление мозговых оболочек для приготовления одноклеточных суспензий
    1. С помощью щипцов извлеките тюбетейку из носителя RPMI. Использование острых щипцов (щипцы #7; Таблица материалов), надрежьте вокруг внешнего края черепной чашечки (Рисунок 2B) и отклейте мозговые оболочки от края черепной чашечки, соскабливая, чтобы удалить твердую мозговую и паутинную оболочки. Поместите мозговые оболочки в чашку Петри.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление мозговых оболочек как из головного, так и из спинного мозга требует практики. Если пользователь испытывает трудности с извлечением мозговых оболочек, используйте препарирующий микроскоп, чтобы помочь в удалении.
    2. Извлеките позвоночный столб из трубки. Острыми щипцами надрежьте края позвоночного столба, чтобы освободить мозговые оболочки, и отделите мозговые оболочки от края позвонка с помощью изогнутых щипцов. Поместите мозговые оболочки в чашку Петри.
    3. Поместите ситечко из нейлоновой сетки в коническую пробирку объемом 50 мл. Переместите мозговые оболочки в ситечко и добавьте 3 мл RPMI с добавлением 25 мМ HEPES. С помощью поршня от шприца объемом 5 мл измельчите ткань и среду через ситечко.
    4. С помощью серологической пипетки объемом 5 мл промойте ситечко дополнительными 2–3 мл среды RPMI/HEPES до тех пор, пока все видимые ткани не пройдут через ситечко.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить достаточное количество клеток для проточного цитометрического анализа, мозговые оболочки нескольких животных могут быть объединены вместе. В этом эксперименте (рис. 3 и 4) мозговые и спинные оболочки головного и спинного мозга 4–5 мышей были объединены вместе. Если образцы объединены, потребуется дополнительная среда для измельчения ткани через нейлоновое сетчатое ситечко, чтобы предотвратить перегрев ткани.
    5. С помощью серологической пипетки объемом 10 мл перенесите клетки и среду в новую коническую пробирку объемом 15 мл. С помощью серологической пипетки объемом 10 мл промойте коническую пробирку объемом 50 мл с 5 мл среды, чтобы собрать оставшиеся клетки. Центрифуга при 450 x g в течение 5 мин при 4 °C, чтобы гранулировать клетки.
    6. Используя пипетку Пастера с вакуумом, отсасывайте надосадочную жидкость, стараясь не допустить образования гранул клеток, и повторно суспендируйте клетки в соответствующем объеме и буфере.
    7. Для подсчета одноклеточной суспензии разбавляют небольшой объем клеток (т. е. 5–10 мкл) с использованием красителя трипанового синего (разведение 1:10) и RPMI. Добавьте 10 мкл раствора в гемоцитометр.
    8. Подсчитайте ячейки, как описано ранее,40,41, усредняя не менее двух 16 квадратных сеток для точности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 3, например, объединенные, гранулированные клетки из мозговых оболочек были ресуспендированы в 250 мкл буфера флуоресцентно-активированной клеточной сортировки (FACS) (1x PBS с 1% FBS) для последующего поверхностного окрашивания. Клетки разбавляли 1:10 для подсчета (5 мкл клеток, 5 мкл трипанового синего, 40 мкл RPMI). Это разбавление дало от 50 до 100 клеток на 16 квадратных сеток, что обеспечило более точный подсчет клеток, поскольку клетки не были ни слишком плотными и перекрывающимися, ни слишком разреженными. Количество ядросодержащих клеток из объединенных мозговых и спинных мозговых оболочек у каждой мыши было следующим: для мозговых оболочек мышей, получавших фиктивное лечение, = 100 000–150 000 клеток, а для мозговых оболочек мышей, вызванных вирусом мышиного энцефаломиелита (TMEV-IDD), = 300 000–350 000 клеток. Количество клеток будет варьироваться в зависимости от точности сбора, обработки и наличия воспаления мозговых оболочек.
    9. Приступайте к желаемому методу одиночных клеток, такому как поверхность FACS (Рисунок 3)14,36,42,43,44, протоколы внутриклеточного окрашивания 33,45, стимуляция in vitro, анализы клеточных культур 33,46,47, анализ ELISPOT 28,34,35 и объемный или одноклеточный транскриптомика37,48.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держите все пробирки на льду между этапами обработки.
  4. Приготовление одноклеточных суспензий тканей головного и спинного мозга
    1. Перенесите ткань головного или спинного мозга со средой в верхнюю часть чашки Петри диаметром 100 мм, высыпав ткань и среду из трубки. С помощью щипцов переместите ткань на дно чашки Петри. Мелко измельчите головной или спинной мозг стерильным лезвием бритвы. Используя лезвие бритвы, переместите измельченную ткань в нижнюю часть тарелки, соскребая, чтобы собрать ткань.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для протокола ферментативного пищеварения, приведенного ниже, до двух спинных мозгов могут быть объединены вместе для обработки. Мозги должны обрабатываться индивидуально.
    2. С помощью серологической пипетки объемом 5 мл добавьте в чашку Петри 3 мл RPMI с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS). С помощью серологической пипетки объемом 10 мл пипетка поднимается и опускается, чтобы ресуспендировать ткань в среде и переложить в коническую пробирку объемом 15 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если последующим применением является анализ секвенирования отдельных клеток или объемных РНК или клеточных культур, партии FCS должны быть протестированы, чтобы убедиться, что клетки не активированы перед анализом. В качестве альтернативы ячейки могут быть обработаны с использованием 1x PBS с 0,04% BSA вместо RPMI с 10% FCS.
    3. С помощью серологической пипетки объемом 10 мл промойте чашку Петри дополнительными 2 мл среды, чтобы собрать остатки ткани, и переложите в коническую пробирку для получения общего объема 5 мл. Держите трубки на льду между этапами обработки.
    4. С помощью пипетки ресуспендируйте порошок коллагеназы I в среде Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) для получения желаемой концентрации (т. е. 100 мг/мл). Добавьте коллагеназу типа I в коническую пробирку, содержащую измельченный образец ткани, чтобы получить желаемую конечную концентрацию (т.е. 50 мкл для 1 мг/мл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокие концентрации коллагеназы увеличивают выход клеток, но могут расщеплять маркеры клеточной поверхности. Таким образом, партии коллагеназы I должны быть титрованы для определения оптимальной концентрации, необходимой для получения наибольшего количества жизнеспособных клеток со всеми необходимыми маркерами клеточной поверхности. Например, коллагеназа I была исследована в конечных концентрациях 0,5 мг/мл, 1 мг/мл и 2 мг/мл на отдельных образцах головного или спинного мозга. Жизнеспособность клеток определяли методом исключения трипанового синего, а маркеры клеточной поверхности CD45, CD19 и CD4 оценивали методом проточной цитометрии. Концентрация коллагеназы I в концентрации 1 мг/мл давала наибольшее количество живых клеток, сохраняя при этом все интересующие маркеры клеточной поверхности. Таким образом, эта концентрация была использована для дальнейших экспериментов по изучению этих типов клеток.
    5. Осторожно ресуспендируйте порошок ДНКазы I, используя 0,15 М хлорида натрия до желаемой концентрации. Добавьте ресуспендированную ДНКазу I в коническую пробирку, содержащую измельченный образец ткани, чтобы получить конечную концентрацию 20 ед/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество ДНКазы I варьируется в зависимости от единиц активности на мл. Концентрация, добавляемая в образец ткани, будет изменяться в зависимости от единиц активности флакона на миллилитр. Конечная требуемая концентрация на образец составляет 20 ед/мл.
    6. Поместите пробирки в штатив для пробирок на водяную баню с температурой 37 °C и инкубируйте в течение 40 минут. Переворачивайте пробирки каждые 15 минут, чтобы тщательно перемешать ткань с ферментами. После инкубации добавьте 500 мкл 0,1 М ЭДТА (рН = 7,2) в каждую пробирку для получения конечной концентрации 0,01 М ЭДТА и инкубируйте еще 5 мин для инактивации коллагеназы.
    7. Используя серологическую пипетку объемом 10 мл, добавьте в каждую пробирку 9 мл RPMI с добавлением 10% FCS, чтобы довести объем каждой пробирки до ~14,5 мл. Центрифуга при 450 x g в течение 5 мин при 4 °C. Используя пипетку Пастера с вакуумом, отсасывайте надосадочную жидкость, стараясь не касаться клеточной гранулы.
    8. С помощью серологической пипетки объемом 5 мл добавьте 3 мл 100% исходного раствора с градиентом изотонической плотности в пробирку, содержащую клеточную гранулу. Используя серологическую пипетку объемом 10 мл, добавьте дополнительную среду RPMI 10% FCS, чтобы довести окончательный объем до 10 мл, и повторно суспендируйте клеточную гранулу, чтобы создать слой раствора с градиентом изотонической плотности 30%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Заранее приготовьте 100% изотоническую среду градиента плотности, аликвоту, и храните при 4 °C до 3 месяцев. Для приготовления 100% исходного раствора изотонического градиента плотности разбавьте среду градиента плотности (таблица материалов) буфером для разбавления среды градиента плотности. Приготовьте буфер для разбавления среды градиента плотности (80,0 г/л NaCl, 3,0 г/л KCl; 0,73 г/лNa2HP0 4, 0,20 г/л KH2HP04; 20,0 г/л глюкозы) и фильтр стерилизуют с помощью системы вакуумных фильтров. Приготовьте 100% исходный раствор изотонического градиента плотности, смешав 1 часть буфера для разбавления градиента плотности и 9 частей среды градиента плотности. Хорошо перемешайте.
    9. Инвертируйте и хорошо перемешайте каждую пробирку перед добавлением 70% исходного раствора изотонического градиента плотности. Введите серологическую пипетку объемом 1 мл, содержащую 1 мл 70% исходного раствора с градиентом изотонической плотности, на дно пробирки. Медленно подложите 1 мл раствора, стараясь не образовывать пузырьков. Медленно извлеките серологическую пипетку из пробирки, стараясь не нарушить градиент.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для 70% подложки 100% исходный раствор изотонического градиента плотности следует разбавить до 70% с помощью среды RPMI (т. е. 7 мл 100% раствора изотонического градиента плотности и 3 мл среды RPMI хорошо перемешать). Кроме того, создание чистой, ненарушенной 70%-ной подложки необходимо для удаления остатков миелина и получения чистых одноклеточных суспензий на границе градиента после центрифугирования.
    10. Центрифуга при 800 x g в течение 30 мин при 4 °C без торможения. Аспирируйте надосадочную жидкость, включая слой миелиновых остатков, до тех пор, пока в пробирке не останется 2–3 мл, стараясь не повредить клеточный слой. Соберите клеточный слой между градиентом плотности 30/70% с помощью пипетки объемом 1 мл и переложите в новую коническую пробирку объемом 15 мл.
    11. Используя серологическую пипетку объемом 10 мл, добавьте 10% среды RPMI FCS, чтобы довести окончательный объем до 15 мл. Центрифуга 450 x g в течение 5 мин при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе клеточные слои из двух пробирок могут быть объединены, если это необходимо. Не объединяйте более двух пробирок, иначе ячейки не будут образовываться из-за высокой градиентной концентрации среды.
    12. Аспирируйте надосадочную жидкость осторожно, чтобы не повредить клеточную гранулу. Ресуспендируйте клетки в соответствующем объеме/буфере для подсчета клеток с помощью гемоцитометра (например, ресуспендируйте один спинной мозг в 250 мкл буфера FACS для последующего поверхностного окрашивания) (рисунок 3).
    13. С помощью пипетки объемом 1 мл перенесите клеточные суспензии в верхнюю часть верхней пробирки фильтра (Таблица материалов) и дайте клеткам отфильтроваться на дно пробирки, чтобы удалить оставшийся мусор миелина.
    14. Используя исключающий краситель трипанового синего, разбавляют и подсчитывают клетки на гемоцитометре, усредняя не менее двух 16 квадратных сеток для точности40,41.
    15. Приступайте к желаемому методу анализа отдельных клеток.
      Примечание: Используя различные формы коллагеназы (т.е. D, тип I, тип II, тип IV), можно эффективно выделить иммунные клетки, микроглию (рис. 3), астроциты, перициты, эндотелиальные клетки49 и нейроны50 . Количество клеток ядра, полученное для получения результатов с использованием титрованного фермента коллагеназы I, было следующим: Весь фиктивный мозг = 500 000–600 000 клеток; Весь мозг TMEV-IDD = 800 000–1 000 000 клеток; Весь спинной мозг, обработанный симуляцией, = 150 000–200 000 клеток; Весь спинной мозг TMEV-IDD = 300 000–400 000. Количество клеток будет варьироваться в зависимости от точности сбора, обработки и наличия воспаления ЦНС.

Результаты

Этот репрезентативный эксперимент был направлен на количественную оценку В- и Т-клеток и описание локализации В- и Т-клеток в менингеальных и паренхиматозных компартментах ЦНС в гомеостатических условиях, а также в мышиной модели прогрессирующего рассеянного склероза (т.е. TMEV-IDD). TMEV-IDD ?...

Обсуждение

Методы оценки клеточного состава в компартменте ЦНС в период гомеостаза и заболевания имеют важное значение для понимания физиологических и патологических состояний ЦНС. Однако, несмотря на то, что они служат важным барьером в ЦНС и содержат разнообразный набор иммунных клеток, мозго?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят сотрудников Центра сравнительной медицины и исследований (CCMR) в Дартмуте за их экспертную помощь мышам, использованным для этих исследований. Исследовательский фонд Борнштейна финансировал это исследование.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Aluminum foilanyN/A
Bovine Serum AlbuminThermoFisher Scientific37002D
CentrifugeBeckman CoulterAllegra X-12R centrifuge
Collagenase IWorthingtonLS004196
Conical tube, 15 mLVWR525-1069
Conical tube, 50 mLVWR89039-658
Cover glassHauser Scientific5000
CryomoldVWR18000-128
Curved forcepsFine Science Tools11003-14
Disposable polystyrene tube, 14 mLFisher Scientific14-959-1B
Disposable ScalpelFisher ScientificNC0595256
DNAse IWorthingtonLS002139
Dry iceAirgasN/A
Durmont #7ForcepsFine Science Tools11271-30
EDTA disodium salt dihydrateAmresco0105-500g
Ethanol, 100%anyN/A
Fetal Bovine Serum (FBS)HycloneSH30910.03
Filter top tube, 5 mLVWR352235
Fixable viability stain 780Becton Dickinson565388
Flow cytometerBeckman CoulterGallios
GlucoseFisher ChemicalD16-500
Goat anti-mouse IgG (488 conjugate)Jackson immunoresearch115-546-146
Goat anti-mouse IgG (594 conjugate)Jackson immunoresearch115-586-146
Goat anti-rabbit 488Jackson immunoresearch111-545-144
Goat anti-rat 594Jackson immunoresearch112-585-167
Goat anti-rat 650Jackson immunoresearch112-605-167
Hank's Balnced Salt Solution (HBSS)Corning21-020-CV
HemacytometerAndwin Scientific02-671-51B
HemostatFine Science Tools13004-14
HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid)ThermoFisher Scientific15630080
KClFisher chemicalBP366-500
KH2PO4 (anhydrous)Sigma AldrichP5655-100G
Liquid NitrogenAirgasN/A
Mouse FC block (CD16/32)Becton Dickinson553141
Na2HP04 (anhydrous)Fisher ChemicalS374-500
NaClFisher chemicalS671-500
Needle, 25 gaugeBecton Dickinson305122
Normal mouse serumThermoFisher Scientific31881
Nylon mesh strainerVWR352350
OCTSakura4583
Paraformaldehyde, 20%Electron Microscopy Sciences15713-SDiluted to 4% using 1 x PBS
Pasteur pipette, 9 inch, unpluggedFisher Scientific13-678-20C
PBS (1x)Corning21-040-CV
PE Rat Anti-Mouse CD4Becton Dickinson553730
PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19Becton Dickinson562329
Percoll density gradient mediaGE healthcare17-0891-01
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45Becton Dickinson550994
Petri dish, 100 mmVWR353003
pH meterFisher Scientific13-636-AB150
Pipet-AidDrummond Scientific Corporation4-000-101
Pipette 200 µlGilsonFA10005M
Pipette tips, 1 mLUSA Scientific1111-2831
Pipette tips, 200 µlUSA Scientific1111-1816
Pipette, 1 mLGilsonFA10006M
Prolong Diamond mountant with DAPIThermoFisher ScientificP36962
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32Becton Dickinson553141
Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone)Abcamab16669
Rabbit anti-mouse lamininAbcamab11575
Rat anti-mouse ERT-R7Abcamab51824
RPMI 1640Corning10-040-CV
Serological pipet, 1 mLVWR357521
Serological pipet, 10 mLVWR357551
Serological pipet, 5 mLVWR357543
Sodium hydroxideFisher ScientificS318-100
SucroseFisher chemicalS5-500
Surgical scissorsFine Science Tools14001-16
Surgical scissors, extra fineRobozRS-5882
Syringe, 10 mLBecton Dickinson302995
Syringe, 5 mLBecton Dickinson309646
Trypan blueGibco15250-061
Vacuum filter systemMillipore20207749
Vacuum flaskThomas Scientific5340-2L
Vacuum in-line filterPall Corporation4402
Vacuum lineCole PalmerEW-06414-20
Water bathThermoFisher ScientificVersa bath

Ссылки

  1. Mastorakos, P., McGavern, D. The anatomy and immunology of vasculature in the central nervous system. Science Immunology. 4 (37), 0492 (2019).
  2. Carson, M. J., Doose, J. M., Melchior, B., Schmid, C. D., Ploix, C. C. CNS immune privilege: hiding in plain sight. Immunological Reviews. 213, 48-65 (2006).
  3. Rua, R., McGavern, D. B. Advances in Meningeal Immunity. Trends in Molecular Medicine. 24 (6), 542-559 (2018).
  4. Greene, H. S. The transplantation of tumors to the brains of heterologous species. Cancer Research. 11 (7), 529-534 (1951).
  5. Murphy, J. B., Sturm, E. Conditions determining the transplantability of tissues in the brain. Journal of Experimental Medicine. 38 (2), 183-197 (1923).
  6. Louveau, A., Harris, T. H., Kipnis, J. Revisiting the Mechanisms of CNS Immune Privilege. Trends in Immunology. 36 (10), 569-577 (2015).
  7. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the CNS in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  8. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  9. Korin, B., et al. High-dimensional, single-cell characterization of the brain's immune compartment. Nature Neuroscience. 20 (9), 1300-1309 (2017).
  10. Walker-Caulfield, M. E., Hatfield, J. K., Brown, M. A. Dynamic changes in meningeal inflammation correspond to clinical exacerbations in a murine model of relapsing-remitting multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology. 278, 112-122 (2015).
  11. Gadani, S. P., Smirnov, I., Smith, A. T., Overall, C. C., Kipnis, J. Characterization of meningeal type 2 innate lymphocytes and their response to CNS injury. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 285-296 (2017).
  12. Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. Journal of Experimental Medicine. 212 (7), 991-999 (2015).
  13. Li, J., Zhou, J., Shi, Y. Scanning electron microscopy of human cerebral meningeal stomata. Annals of Anatomy. 178 (3), 259-261 (1996).
  14. Louveau, A., et al. CNS lymphatic drainage and neuroinflammation are regulated by meningeal lymphatic vasculature. Nature Neuroscience. 21 (10), 1380-1391 (2018).
  15. Choi, S. R., et al. Meningeal inflammation plays a role in the pathology of primary progressive multiple sclerosis. Brain. 135, 2925-2937 (2012).
  16. Howell, O. W., et al. Meningeal inflammation is widespread and linked to cortical pathology in multiple sclerosis. Brain. 134, 2755-2771 (2011).
  17. Kooi, E. J., Geurts, J. J., van Horssen, J., Bo, L., van der Valk, P. Meningeal inflammation is not associated with cortical demyelination in chronic multiple sclerosis. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 68 (9), 1021-1028 (2009).
  18. Lucchinetti, C. F., et al. Inflammatory cortical demyelination in early multiple sclerosis. New England Journal of Medicine. 365 (23), 2188-2197 (2011).
  19. Magliozzi, R., et al. A Gradient of neuronal loss and meningeal inflammation in multiple sclerosis. Annals of Neurology. 68 (4), 477-493 (2010).
  20. Arac, A., et al. Evidence that meningeal mast cells can worsen stroke pathology in mice. American Journal of Pathology. 184 (9), 2493-2504 (2014).
  21. Benakis, C., et al. Commensal microbiota affects ischemic stroke outcome by regulating intestinal gammadelta T cells. Nature Medicine. 22 (5), 516-523 (2016).
  22. Roth, T. L., et al. Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury. Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).
  23. Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
  24. Schain, A. J., et al. Activation of pial and dural macrophages and dendritic cells by cortical spreading depression. Annals of Neurology. 83 (3), 508-521 (2018).
  25. Azevedo, R. S. S., et al. In situ immune response and mechanisms of cell damage in central nervous system of fatal cases microcephaly by Zika virus. Scientific Reports. 8 (1), 1 (2018).
  26. Coles, J. A., et al. Intravital imaging of a massive lymphocyte response in the cortical dura of mice after peripheral infection by trypanosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (4), 0003714 (2015).
  27. Kang, S. S., McGavern, D. B. Lymphocytic choriomeningitis infection of the central nervous system. Frontiers in Bioscience. 13, 4529-4543 (2008).
  28. DiSano, K. D., Stohlman, S. A., Bergmann, C. C. Activated GL7(+) B cells are maintained within the inflamed CNS in the absence of follicle formation during viral encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 60, 71-83 (2017).
  29. DiSano, K. D., R, D. B., Gilli, F., Pachner, A. R. Central Nervous System Inflammatory Aggregates in the Theiler's Virus Model of Progressive Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
  30. Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. Journal of Histotechnology. 36 (3), 86-91 (2013).
  31. Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (119), e55226 (2017).
  32. Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis. Current Protocols in Immunology. 121 (1), 44 (2018).
  33. Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension. Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).
  34. Cao, Y., et al. An optimized assay for the enumeration of antigen-specific memory B cells in different compartments of the human body. Journal of Immunological Methods. 358 (1-2), 56-65 (2010).
  35. Wykes, M. N., Renia, L. ELISPOT Assay to Measure Peptide-specific IFN-γ Production. Bio-Protocol. 7 (11), (2017).
  36. Gjurich, B. N., Taghavie-Moghadam, P. L., Galkina, E. V. Flow Cytometric Analysis of Immune Cells Within Murine Aorta. Methods in Molecular Biology. 1339, 161-175 (2015).
  37. Laboissonniere, L. A., Sonoda, T., Lee, S. K., Trimarchi, J. M., Schmidt, T. M. Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells. Journal of Visualized Experiments. (123), e55229 (2017).
  38. Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. Journal of Visualized Experiments. (4), 198 (2007).
  39. McGowan, J. W., Bidwell, G. L. The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules. Journal of Visualized Experiments. (118), e54987 (2016).
  40. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count cells. Journal of Visualized Experiments Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2019)
  41. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. , e752 (2008).
  42. Hatfield, J. K., Brown, M. A. Group 3 innate lymphoid cells accumulate and exhibit disease-induced activation in the meninges in EAE. Cellular Immunology. 297 (2), 69-79 (2015).
  43. Molina Estevez, F. J., Mathews, T. D., Biffi, A., Peviani, M. Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods. Journal of Visualized Experiments. (153), e752 (2019).
  44. Herz, J., Louveau, A., Da Mesquita, S., Kipnis, J. Morphological and Functional Analysis of CNS-Associated Lymphatics. Methods in Molecular Biology. 1846, 141-151 (2018).
  45. Kwong, B., et al. T-bet-dependent NKp46(+) innate lymphoid cells regulate the onset of TH17-induced neuroinflammation. Nature Immunology. 18 (10), 1117-1127 (2017).
  46. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
  47. Nurkhametova, D., et al. Activation of P2X7 Receptors in Peritoneal and Meningeal Mast Cells Detected by Uptake of Organic Dyes: Possible Purinergic Triggers of Neuroinflammation in Meninges. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 45 (2019).
  48. Van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
  49. Czupalla, C. J., Yousef, H., Wyss-Coray, T., Butcher, E. C. Collagenase-based Single Cell Isolation of Primary Murine Brain Endothelial Cells Using Flow Cytometry. Bio-Protocol. 8 (22), 3092 (2018).
  50. Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons. Methods in Molecular Biology. 1656, 229-251 (2017).
  51. Eriksdotter-Nilsson, M., Björklund, H., Olson, L. Laminin immunohistochemistry: a simple method to visualize and quantitate vascular structures in the mammalian brain. Journal of Neuroscience Methods. 17 (4), 275-286 (1986).
  52. Cha, J. H., et al. Prompt meningeal reconstruction mediated by oxygen-sensitive AKAP12 scaffolding protein after central nervous system injury. Nature Communications. 5, 4952 (2014).
  53. Van Vliet, E., Melis, M., Foidart, J. M., Van Ewijk, W. Reticular fibroblasts in peripheral lymphoid organs identified by a monoclonal antibody. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (7), 883-890 (1986).
  54. Louveau, A., Filiano, A. J., Kipnis, J. Meningeal whole mount preparation and characterization of neural cells by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. 121 (1), (2018).
  55. Derecki, N., J, K. Mouse meninges isolation for FACS. Protocol Exchange. , (2014).
  56. Hedley, B. D., Keeney, M. Technical issues: flow cytometry and rare event analysis. International Journal of Laboratory Hematology. 35 (3), 344-350 (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

159

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены