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Method Article
本文提出了两种优化的方案,用于检查中枢神经系统内的常驻和外周来源的免疫细胞,包括大脑、脊髓和脑膜。这些协议中的每一个都有助于确定在稳态和炎症条件下占据这些隔室的细胞的功能和组成。
中枢神经系统(CNS)由大脑和脊髓组成,被脑膜包裹,膜层是外围和CNS之间的屏障。中枢神经系统是一个免疫学特化的部位,在稳态条件下,免疫特权在中枢神经系统实质中最为明显。相比之下,脑膜含有多种常驻细胞,包括先天性和适应性免疫细胞。在由中枢神经系统损伤、自身免疫、感染甚至神经变性引发的炎症性疾病中,外周来源的免疫细胞可能会进入脑实质并居住在脑膜内。这些细胞被认为在中枢神经系统疾病发病过程中执行有益和有害作用。尽管有这些知识,但在分析中枢神经系统隔室时,脑膜经常被忽视,因为传统的中枢神经系统组织提取方法省略了脑膜层。该协议提出了两种不同的方法,用于快速分离鼠中枢神经系统组织(即脑,脊髓和脑膜),适用于通过单细胞技术,免疫组织化学和原位杂交方法进行下游分析。所描述的方法提供了对CNS组织的全面分析,非常适合评估在稳态条件下和疾病发病期间占据CNS区室的细胞的表型,功能和定位。
中枢神经系统(CNS)是一个免疫学专业化的部位。中枢神经系统实质(不包括脑脊液间隙、脑膜和脉管系统)通常被视为免疫特权部位 1,2,3,4,5,在稳态条件下相对缺乏免疫细胞 2,6,7。相比之下,由硬脑膜、蛛网膜和软脑膜层组成的脑膜是中枢神经系统隔室的重要组成部分,在疾病发病机制期间积极参与稳态免疫监视和炎症过程 3,6,7,8。在稳态条件下,脑膜支持许多免疫哨兵细胞,包括先天淋巴细胞(ILC),巨噬细胞,树突状细胞(DC),肥大细胞,T细胞,以及在较小程度上的B细胞9,10,11。
脑膜是高度血管化的结构,含有淋巴管,在中枢神经系统与其外围之间提供淋巴连接8,12,13,14。在由中枢神经系统损伤、感染、自身免疫甚至神经变性引起的炎症性疾病中,外周来源的免疫细胞会浸润脑实质并改变脑膜内的免疫景观。细胞浸润后,脑膜可能代表外周来源免疫细胞的功能生态位,促进免疫细胞聚集、局部免疫细胞活化和中枢神经系统区室的长期存活。在影响中枢神经系统的多种疾病中观察到明显的脑膜炎症,包括多发性硬化症 (MS)15,16,17,18,19、中风 20,21、无菌损伤 22,23(即脊髓损伤和创伤性脑损伤)、偏头痛 24 和微生物感染 25,26,27,28,29.因此,脑膜区室中常驻细胞和外周衍生免疫细胞的表征对于了解这些细胞在稳态条件和疾病发病机制中的作用至关重要。
从颅骨和椎体中提取大脑、脊髓和脑膜在技术上具有挑战性且耗时。目前还没有可用于快速提取大脑的技术,所有三个脑膜层都完好无损。虽然椎板切除术产生出色的脊髓组织形态并保留了脑膜层,但它既非常耗时又复杂30,31。相反,更传统的提取方法,例如从颅骨中取出大脑和脊髓的液压挤出有助于快速提取CNS组织,但蛛网膜和硬脑膜都因这些技术而丢失30,31。在脑和脊髓组织的常规分离过程中,硬脑膜和蛛网膜层的遗漏导致对中枢神经系统隔室内细胞的分析不完整。因此,确定专注于快速提取具有完整脑膜的CNS组织的新技术对于CNS室的最佳分析至关重要。
本手稿介绍了两种从小鼠中快速提取大脑、脊髓和脑膜的方法,有助于对中枢神经系统实质和脑膜中的常驻细胞和外周衍生免疫细胞进行下游分析。这些优化的方案侧重于 1) 分离单细胞悬液以进行下游分析和 2) 准备组织以进行组织学处理。从大脑、脊髓组织以及硬脑膜和蛛网膜脑膜32 获得单细胞悬浮液可以同时分析存在于实质和脑膜隔室中的细胞。单细胞悬浮液可用于不同的应用,包括用于体外刺激的细胞培养测定33、酶联免疫斑点(ELISpot)28、34、35、流式细胞术36、33和单细胞37或批量转录组学。此外,分别具有完整颅骨或椎体的整个大脑和脊髓脱钙的优化方案允许周围骨骼的温和脱钙,使脑膜完整并保留组织形态。该方法允许在实质和脑膜间隙内使用免疫组织化学(IHC)或原位杂交(ISH)技术选择性鉴定蛋白质或RNA。中枢神经系统内驻留细胞和外周来源免疫细胞的表型、活化状态和定位的表征可能为了解中枢神经系统区室中的单个细胞类型如何促进稳态和疾病发病机制提供必不可少的信息。
所有动物工作都采用达特茅斯盖泽尔医学院机构动物护理和使用委员会(IACUC)审查和批准的协议。
1. 处理脑和脊髓样本进行脱钙
2. 脑膜和中枢神经系统组织的制备,用于流式细胞术染色
该代表性实验旨在量化B和T细胞,并描述B和T细胞在稳态条件下脑膜和实质CNS区室以及小鼠进行性MS模型(即TMEV-IDD)中的定位。如前所述,TMEV-IDD通过5 x 106 斑块形成单位(PFU)的TMEV BeAn的颅内感染在5周龄雌性SJL小鼠中诱导29。
本研究评估了感染后第120天慢性TMEV-IDD期间脑膜,大脑和脊髓中的B和T细胞。使用年龄匹配的假处理小鼠作为对照。该研究由?...
在稳态和疾病期间评估CNS区室细胞组成的方法对于了解CNS的生理和病理状态至关重要。然而,尽管是中枢神经系统的重要屏障并容纳多种免疫细胞,但脑膜经常被省略在分析中,因为许多传统的大脑和脊髓组织提取方法不允许收集这些膜。这种遗漏是我们了解脑膜细胞组成和功能及其在稳态和炎症条件下的作用的关键限制。最近的研究表明,驻留在脑膜隔室中的常驻和外周来源的免疫细胞在维持?...
作者没有什么可透露的。
作者感谢达特茅斯比较医学和研究中心(CCMR)的工作人员对用于这些研究的小鼠的专业护理。伯恩斯坦研究基金资助了这项研究。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Aluminum foil | any | N/A | |
Bovine Serum Albumin | ThermoFisher Scientific | 37002D | |
Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-12R centrifuge | |
Collagenase I | Worthington | LS004196 | |
Conical tube, 15 mL | VWR | 525-1069 | |
Conical tube, 50 mL | VWR | 89039-658 | |
Cover glass | Hauser Scientific | 5000 | |
Cryomold | VWR | 18000-128 | |
Curved forceps | Fine Science Tools | 11003-14 | |
Disposable polystyrene tube, 14 mL | Fisher Scientific | 14-959-1B | |
Disposable Scalpel | Fisher Scientific | NC0595256 | |
DNAse I | Worthington | LS002139 | |
Dry ice | Airgas | N/A | |
Durmont #7Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | |
EDTA disodium salt dihydrate | Amresco | 0105-500g | |
Ethanol, 100% | any | N/A | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | |
Filter top tube, 5 mL | VWR | 352235 | |
Fixable viability stain 780 | Becton Dickinson | 565388 | |
Flow cytometer | Beckman Coulter | Gallios | |
Glucose | Fisher Chemical | D16-500 | |
Goat anti-mouse IgG (488 conjugate) | Jackson immunoresearch | 115-546-146 | |
Goat anti-mouse IgG (594 conjugate) | Jackson immunoresearch | 115-586-146 | |
Goat anti-rabbit 488 | Jackson immunoresearch | 111-545-144 | |
Goat anti-rat 594 | Jackson immunoresearch | 112-585-167 | |
Goat anti-rat 650 | Jackson immunoresearch | 112-605-167 | |
Hank's Balnced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-020-CV | |
Hemacytometer | Andwin Scientific | 02-671-51B | |
Hemostat | Fine Science Tools | 13004-14 | |
HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid) | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
KCl | Fisher chemical | BP366-500 | |
KH2PO4 (anhydrous) | Sigma Aldrich | P5655-100G | |
Liquid Nitrogen | Airgas | N/A | |
Mouse FC block (CD16/32) | Becton Dickinson | 553141 | |
Na2HP04 (anhydrous) | Fisher Chemical | S374-500 | |
NaCl | Fisher chemical | S671-500 | |
Needle, 25 gauge | Becton Dickinson | 305122 | |
Normal mouse serum | ThermoFisher Scientific | 31881 | |
Nylon mesh strainer | VWR | 352350 | |
OCT | Sakura | 4583 | |
Paraformaldehyde, 20% | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | Diluted to 4% using 1 x PBS |
Pasteur pipette, 9 inch, unplugged | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
PBS (1x) | Corning | 21-040-CV | |
PE Rat Anti-Mouse CD4 | Becton Dickinson | 553730 | |
PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19 | Becton Dickinson | 562329 | |
Percoll density gradient media | GE healthcare | 17-0891-01 | |
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45 | Becton Dickinson | 550994 | |
Petri dish, 100 mm | VWR | 353003 | |
pH meter | Fisher Scientific | 13-636-AB150 | |
Pipet-Aid | Drummond Scientific Corporation | 4-000-101 | |
Pipette 200 µl | Gilson | FA10005M | |
Pipette tips, 1 mL | USA Scientific | 1111-2831 | |
Pipette tips, 200 µl | USA Scientific | 1111-1816 | |
Pipette, 1 mL | Gilson | FA10006M | |
Prolong Diamond mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36962 | |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | Becton Dickinson | 553141 | |
Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone) | Abcam | ab16669 | |
Rabbit anti-mouse laminin | Abcam | ab11575 | |
Rat anti-mouse ERT-R7 | Abcam | ab51824 | |
RPMI 1640 | Corning | 10-040-CV | |
Serological pipet, 1 mL | VWR | 357521 | |
Serological pipet, 10 mL | VWR | 357551 | |
Serological pipet, 5 mL | VWR | 357543 | |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | |
Sucrose | Fisher chemical | S5-500 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-16 | |
Surgical scissors, extra fine | Roboz | RS-5882 | |
Syringe, 10 mL | Becton Dickinson | 302995 | |
Syringe, 5 mL | Becton Dickinson | 309646 | |
Trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
Vacuum filter system | Millipore | 20207749 | |
Vacuum flask | Thomas Scientific | 5340-2L | |
Vacuum in-line filter | Pall Corporation | 4402 | |
Vacuum line | Cole Palmer | EW-06414-20 | |
Water bath | ThermoFisher Scientific | Versa bath |
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