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Résumé

Cet article présente deux protocoles optimisés pour l’examen des cellules immunitaires résidentes et dérivées périphériques du système nerveux central, y compris le cerveau, la moelle épinière et les méninges. Chacun de ces protocoles permet de déterminer la fonction et la composition des cellules occupant ces compartiments dans des conditions d’équilibre et inflammatoires.

Résumé

Le système nerveux central (SNC) est composé du cerveau et de la moelle épinière et est enveloppé par les méninges, couches membraneuses servant de barrière entre la périphérie et le SNC. Le SNC est un site immunologiquement spécialisé, et dans des conditions d’état d’équilibre, le privilège immunitaire est le plus évident dans le parenchyme du SNC. En revanche, les méninges abritent un large éventail de cellules résidentes, y compris des cellules immunitaires innées et adaptatives. Au cours d’affections inflammatoires déclenchées par une lésion du SNC, une auto-immunité, une infection ou même une neurodégénérescence, des cellules immunitaires d’origine périphérique peuvent pénétrer dans le parenchyme et s’installer dans les méninges. On pense que ces cellules effectuent des actions à la fois bénéfiques et préjudiciables pendant la pathogenèse de la maladie du SNC. Malgré ces connaissances, les méninges sont souvent négligées lors de l’analyse du compartiment du SNC, car les méthodes conventionnelles d’extraction des tissus du SNC omettent les couches méningées. Ce protocole présente deux méthodes distinctes pour l’isolement rapide des tissus murins du SNC (c’est-à-dire le cerveau, la moelle épinière et les méninges) qui conviennent à l’analyse en aval via des techniques unicellulaires, l’immunohistochimie et les méthodes d’hybridation in situ. Les méthodes décrites fournissent une analyse complète des tissus du SNC, idéale pour évaluer le phénotype, la fonction et la localisation des cellules occupant le compartiment du SNC dans des conditions homéostatiques et pendant la pathogenèse de la maladie.

Introduction

Le système nerveux central (SNC) est un site immunologiquement spécialisé. Le parenchyme du SNC, à l’exclusion de l’espace du LCR, des méninges et du système vasculaire, est classiquement considéré comme un site privilégié par le système immunitaire 1,2,3,4,5 et est relativement dépourvu de cellules immunitaires dans des conditions homéostatiques 2,6,7. En revanche, les méninges, composées des couches de dure-mère, d’arachnoïde et de pia, sont des composants cruciaux du compartiment du SNC, participant activement à la surveillance immunitaire homéostatique et aux processus inflammatoires au cours de la pathogenèse de la maladie 3,6,7,8. Dans des conditions d’état d’équilibre, les méninges soutiennent de nombreuses cellules sentinelles immunitaires, notamment les cellules lymphoïdes innées (ILC), les macrophages, les cellules dendritiques (DC), les mastocytes, les lymphocytes T et, dans une moindre mesure, les lymphocytes B 9,10,11.

Les méninges sont des structures hautement vascularisées et contiennent des vaisseaux lymphatiques qui assurent une connexion lymphatique entre le SNC et sa périphérie 8,12,13,14. Dans les conditions inflammatoires induites par une lésion du SNC, des infections, une auto-immunité ou même une neurodégénérescence, les cellules immunitaires dérivées périphériques infiltrent le parenchyme et modifient le paysage immunitaire dans les méninges. Après l’infiltration cellulaire, les méninges peuvent représenter une niche fonctionnelle pour les cellules immunitaires dérivées périphériquement, favorisant l’agrégation des cellules immunitaires, l’activation locale des cellules immunitaires et la survie à long terme dans le compartiment du SNC. Une inflammation méningée importante est observée dans de multiples maladies affectant le SNC, y compris la sclérose en plaques (SEP)15,16,17,18,19, les accidents vasculaires cérébraux 20,21, les lésions stériles 22,23 (c.-à-d. lésions de la moelle épinière et les traumatismes crâniens), les migraines 24 et les infections microbiennes 25,26.27,28,29. Ainsi, la caractérisation des cellules résidentes et des cellules immunitaires dérivées périphériques dans le compartiment méningé est essentielle pour comprendre le rôle de ces cellules dans des conditions d’équilibre et de pathogenèse de la maladie.

L’extraction du cerveau, de la moelle épinière et des méninges du crâne et des corps vertébraux est techniquement difficile et prend du temps. Il n’existe actuellement aucune technique d’extraction rapide du cerveau avec les trois couches méningées intactes. Bien que la laminectomie donne une excellente morphologie du tissu de la moelle épinière et préserve les couches méningées, elle est à la fois extrêmement longue et compliquée30,31. À l’inverse, des méthodes d’extraction plus conventionnelles telles que l’ablation du cerveau du crâne et l’extrusion hydraulique de la moelle épinière facilitent l’extraction rapide du tissu du SNC, mais les méninges arachnoïdiennes et durales sont perdues avec ces techniques30,31. L’omission des couches de la dure-mère et de l’arachnoïde lors de l’isolement conventionnel des tissus du cerveau et de la moelle épinière entraîne une analyse incomplète des cellules du compartiment du SNC. Ainsi, l’identification de nouvelles techniques axées sur l’extraction rapide de tissus du SNC avec des méninges intactes est cruciale pour l’analyse optimale du compartiment du SNC.

Ce manuscrit présente deux méthodes d’extraction rapide du cerveau, de la moelle épinière et des méninges chez la souris, facilitant l’analyse en aval des cellules résidentes et des cellules immunitaires dérivées périphériques dans le parenchyme et les méninges du SNC. Ces protocoles optimisés se concentrent sur 1) l’isolement de suspensions unicellulaires pour l’analyse en aval et 2) la préparation des tissus pour le traitement histologique. L’obtention de suspensions unicellulaires du cerveau, du tissu de la moelle épinière et des méninges durales et arachnoïdiennes32 permet l’analyse simultanée des cellules résidant à la fois dans les compartiments parenchymateux et méningé. Les suspensions unicellulaires peuvent être utilisées dans différentes applications, y compris les tests de culture cellulaire pour effectuer une stimulation in vitro 33, l’immunospot enzymatique (ELISpot)28,34,35, la cytométrie en flux36,33 et la transcriptomique unicellulaire 37 ou en vrac. De plus, le protocole optimisé pour la décalcification de cerveaux entiers et de moelles épinières avec des crânes ou des colonnes vertébrales intacts, respectivement, permet une décalcification douce de l’os environnant, laissant les méninges intactes et préservant la morphologie des tissus. Cette méthode permet l’identification sélective de protéines ou d’ARN à l’aide de techniques d’immunohistochimie (IHC) ou d’hybridation in situ (ISH) dans les espaces parenchymateux et méningés. La caractérisation du phénotype, de l’état d’activation et de la localisation des cellules résidentes et des cellules immunitaires dérivées périphériques dans le SNC peut fournir des informations essentielles pour comprendre comment les types de cellules individuelles dans le compartiment du SNC contribuent à l’homéostasie et à la pathogenèse de la maladie.

Protocole

Tous les travaux sur les animaux utilisent des protocoles examinés et approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de la Geisel School of Medicine de Dartmouth.

1. Traitement d’échantillons de cerveau et de moelle épinière pour la décalcification

  1. Isolement d’échantillons de cerveau et de moelle épinière
    1. Euthanasier la souris par inhalation de CO2 . Assurez-vous que le débit deCO2 déplace 10 à 30 % du volume de la cage par minute.
    2. À l’aide d’une pince, soulevez le processus xiphoïde et coupez la paroi abdominale latéralement juste en dessous de la cage thoracique avec des ciseaux, en tirant vers le haut pour éviter de couper les vaisseaux sanguins ou les organes sous-jacents. Coupez le diaphragme latéralement.
    3. Coupez la cage thoracique le long des bords latéraux parallèles aux poumons jusqu’à la clavicule. À l’aide d’une pince, soulevez le sternum et serrez-le avec un hémostatique. Placez l’hémostatique sur la tête pour soulever la cage thoracique et exposer le cœur.
    4. À l’aide d’une pince, saisissez le cœur près de son sommet et faites une incision dans l’oreillette droite du cœur pour fournir une sortie. Insérez une aiguille de 25 g avec une seringue de 10 ml attachée pour administrer lentement 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) glacée 1x dans le ventricule gauche pour perfuser la souris par voie transcardique.
      REMARQUE : La perfusion doit se produire sur 4 à 5 minutes jusqu’à ce que le foie soit débarrassé du sang. Un total de 10 mL de 1x PBS est généralement suffisant pour la perfusion, mais plus peut être utilisé si nécessaire. Un foie clair indique généralement une perfusion adéquate.
    5. À l’aide de ciseaux bien aiguisés, retirez la tête par décapitation (figure 1 ; 1). Faites une incision médiane dans la peau (Figure 1 ; 2) et retournez la peau sur les yeux pour libérer le crâne.
    6. Couper l’os nasal pour libérer la mandibule du crâne (Figure 1 ; 3). Retirez la mandibule, la langue et les yeux. Coupez le long des faces latérales du crâne pour libérer le tissu le long du méat auditif externe (Figure 1 ; 4). Taillez pour enlever tout excès de peau, de muscle et de tissu recouvrant le crâne.
    7. Séparez la cage thoracique de la colonne vertébrale en coupant parallèlement à la colonne vertébrale avec des ciseaux bien aiguisés (Figure 1 ; 5 et 6). Faites une petite incision dans la région lombaire inférieure pour isoler la colonne vertébrale (Figure 1 ; 7). Coupez et enlevez tout muscle restant le long de la colonne vertébrale pour exposer les vertèbres (Figure 1 ; 8).
      REMARQUE : L’ablation de l’excès de tissu de la colonne vertébrale et du crâne est nécessaire pour obtenir une pénétration adéquate du tampon fixateur de paraformaldéhyde (PFA) et d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA).
  2. Post-fixation, décalcification et cryoconservation
    1. À l’aide d’une pince, placer le cerveau avec le crâne ou la colonne vertébrale intact dans un tube conique de 15 mL contenant 10 mL de PFA à 4 %. Placez les tubes à 4 °C pendant au moins 48 h pour une fixation adéquate.
      REMARQUE : Pour éviter une surfixation du tissu, ne pas dépasser 72 h de fixation. Les temps de fixation sont prolongés pour les échantillons osseux avant décalcification. Une fixation adéquate protégera les tissus des effets de la décalcification et assurera une meilleure morphologie des tissus.
    2. Rincez le cerveau ou la moelle épinière en retirant le tissu de l’APF à 4 % à l’aide d’une pince et en plaçant le tissu dans un tube jetable de 14 ml avec 10 ml de PBS 1x pendant 5 minutes. Transférez le cerveau ou la moelle épinière dans un tube conique de 50 mL avec 10 mL d’EDTA à 10 % (pH = 7,2 à 7,4).
      REMARQUE : L’utilisation d’un tube plus grand avec 10 mL d’EDTA donne à l’EDTA une plus grande surface de contact avec le tissu et accélère le processus de décalcification.
    3. Vérifiez quotidiennement si l’os est mou et souple : retirez le tissu de la solution d’EDTA avec une pince, placez-le sur une boîte de Pétri et testez doucement la mollesse de l’os avec une aiguille de 25 G. Si l’aiguille pénètre facilement dans l’os, le processus de décalcification est terminé.
    4. Retirez le tissu de la solution d’EDTA et transférez le cerveau ou la moelle épinière dans un tube jetable de 14 ml contenant 10 ml de 1x PBS et lavez pendant 10 minutes. Répétez le lavage.
      REMARQUE : La décalcification prend généralement 2 à 3 jours. La solution doit être changée tous les 2 à 3 jours si l’os n’est pas encore correctement décalcifié. Cependant, une incubation prolongée dans l’EDTA après la décalcification de l’os peut endommager la morphologie des tissus.
    5. Préparez des solutions de saccharose à 10 %, 20 % et 30 % en ajoutant du saccharose à 1x PBS. Par exemple, pour 10 % de saccharose, ajoutez 10 g de saccharose et portez le volume à 100 mL en utilisant du PBS stérile 1x. Conservez la solution à 4 °C jusqu’à 1 mois.
      REMARQUE : Les solutions de saccharose sont sujettes à la croissance de micro-organismes, de sorte que les échantillons ne doivent pas être stockés pendant des périodes prolongées dans ces solutions.
    6. Retirez le tissu du PBS 1x, placez-le dans 10 mL de solution de saccharose à 10 % et conservez-le à 4 °C. Laissez reposer le mouchoir pendant 24 h ou jusqu’à ce qu’il coule au fond du tube.
    7. Répétez ce processus, en déplaçant d’abord le tissu vers une solution de saccharose à 20 %, puis vers une solution de saccharose à 30 %. Laisser le tissu pénétrer dans 30 % de saccharose (au moins 24 h) et procéder à l’enrobage des tissus.
  3. Enrobage et congélation des tissus
    1. À l’aide d’une pince, retirez le tissu du saccharose à 30 %, placez-le sur une boîte de Pétri et inclinez la boîte pour éliminer tout excès de solution de saccharose sur le tissu. À l’aide d’un scalpel, coupez le tissu en segments souhaités.
    2. Créez une fine couche de composé à température de coupe optimale (OCT) au fond du cryomoule et placez le(s) morceau(s) de tissu dans le moule. Recouvrez complètement le tissu avec le composé OCT, en vous assurant qu’il n’y a pas de bulles.
    3. Congelez les blocs en les survolant de l’azote liquide38 ou en les plaçant sur une boue 100 % isopropanol/glace carbonique39 jusqu’à ce que le bloc soit opaque. Enveloppez les cryomoules dans du papier d’aluminium et stockez les blocs à -80 °C pour un stockage à long terme. Déplacez les blocs à -20 °C avant de les sectionner.
      REMARQUE : Des précautions doivent être prises lors de la section et de l’exécution des protocoles d’histologie sur les cerveaux décalcifiés, car les couches du crâne et du méninge peuvent être perdues si les coupes sont manipulées brutalement.

2. Préparation des méninges et des tissus du SNC pour la coloration par cytométrie en flux

  1. Extraction de la calotte crânienne et du cerveau
    1. À l’aide de ciseaux bien aiguisés, retirez la tête par décapitation (figure 2A ; 1). À l’aide de ciseaux, faites une incision médiane dans la peau (Figure 2A ; 2) et retournez la peau sur les yeux pour libérer le crâne.
    2. Placez les ciseaux à l’intérieur du foramen magna et commencez à couper le crâne latéralement le long des cortex vers le bulbe olfactif, en gardant les incisions au-dessus du méat auditif externe et de la mandibule (Figure 2A ; 3). Effectuez les mêmes incisions du côté opposé, les incisions se rejoignant au niveau du bulbe olfactif pour libérer la calotte crânienne du cerveau (Figure 2A ; 3).
    3. À l’aide d’une pince, retirez la calotte crânienne et placez-la dans un tube conique de 15 mL contenant 5 mL de milieu RPMI froid complété par 25 mM de HEPES. Gardez le tube sur de la glace.
    4. À l’aide d’une pince incurvée, placez la pince sous la base du cerveau et soulevez-la pour libérer le cerveau de la calotte. Placez le cerveau dans un tube conique de 15 mL contenant 5 mL de RPMI froid complété par 25 mM HEPES. Gardez le tube sur de la glace jusqu’au traitement.
  2. Extraction du tissu de la colonne vertébrale et de la moelle épinière
    1. À l’aide d’une pince et de ciseaux bien aiguisés, séparez la cage thoracique de la colonne vertébrale en coupant parallèlement à la colonne vertébrale (figures 2A ; 4 et 5). Faites une petite incision dans la région lombaire inférieure pour isoler la colonne vertébrale (figure 2A ; 6). Coupez et enlevez tout muscle restant le long de la colonne vertébrale pour exposer les vertèbres (figure 2A ; 7).
    2. Placez les ciseaux chirurgicaux extra-fins à l’intérieur de la colonne vertébrale et coupez le long du bord latéral de la colonne (Figure 2C). Coupez complètement le bord latéral opposé pour diviser la colonne vertébrale en une partie antérieure et une partie postérieure.
      REMARQUE : La moelle épinière restera attachée à la colonne vertébrale.
    3. À l’aide d’une pince, retirez lentement et soigneusement la moelle épinière de la colonne vertébrale et placez le tissu dans un tube conique de 15 mL contenant 5 mL de RPMI froid avec 25 mM de HEPES. Transférez les parties antérieure et postérieure de la colonne vertébrale dans un tube conique de 15 mL contenant 5 mL de RPMI froid avec 25 mM de HEPES.
  3. Enlever les méninges pour préparer des suspensions unicellulaires
    1. À l’aide d’une pince, retirez la calotte crânienne du support RPMI. À l’aide d’une pince tranchante (pince #7 ; Table des matériaux), entaillez le pourtour du bord extérieur de la calotte crânienne (figure 2B) et retirez les méninges du bord de la calotte crânienne, en grattant pour enlever les méninges durales et arachnoïdiennes. Placez les méninges sur une boîte de Pétri.
      REMARQUE : L’ablation des méninges du cerveau et de la moelle épinière nécessite de la pratique. Si l’utilisateur éprouve des difficultés à extraire les méninges, utilisez un microscope à dissection pour faciliter le retrait.
    2. Retirez la colonne vertébrale du tube. À l’aide d’une pince tranchante, entaillez les bords de la colonne vertébrale pour libérer les méninges et décollez les méninges du bord de la vertèbre à l’aide d’une pince courbée. Placez les méninges sur une boîte de Pétri.
    3. Placer une crépine en maille de nylon dans un tube conique de 50 ml. Déplacez les méninges dans la passoire et ajoutez 3 mL de RPMI complété par 25 mM HEPES. À l’aide du piston d’une seringue de 5 ml, broyer le tissu et le milieu à travers la passoire.
    4. À l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL, laver la crépine avec 2 à 3 mL supplémentaires de milieu RPMI/HEPES jusqu’à ce que tous les tissus visibles aient traversé la crépine.
      REMARQUE : Pour obtenir un nombre de cellules adéquat pour l’analyse par cytométrie en flux, il peut être nécessaire de regrouper les méninges de plusieurs animaux. Dans cette expérience (Figure 3 et Figure 4), les méninges du cerveau et de la moelle épinière de 4 à 5 souris ont été regroupées. Si les échantillons sont regroupés, des milieux supplémentaires seront nécessaires pour broyer le tissu à travers la crépine en nylon afin d’éviter la surchauffe du tissu.
    5. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 ml, transférer les cellules et le milieu dans un tube conique neuf de 15 ml. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL, laver le tube conique de 50 mL avec 5 mL de milieu pour recueillir les cellules restantes. Centrifuger à 450 x g pendant 5 min à 4 °C pour granuler les cellules.
    6. À l’aide d’une pipette Pasteur sous vide, aspirer le surnageant en prenant soin d’éviter la pastille cellulaire et remettre les cellules en suspension dans un volume et un tampon appropriés.
    7. Pour compter la suspension unicellulaire, diluer un petit volume de cellules (c.-à-d. 5 à 10 μL) à l’aide d’un colorant d’exclusion au bleu de trypan (dilution 1 :10) et d’un RPMI. Ajouter 10 μL de dilution dans l’hémocytomètre.
    8. Comptez les cellules comme décrit précédemment40,41, en faisant la moyenne d’au moins deux grilles de 16 carrés pour plus de précision.
      NOTA : Dans la figure 3, par exemple, des cellules groupées et granulées des méninges ont été remises en suspension dans 250 μL de tampon de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) (1 x PBS avec 1 % de FBS) pour la coloration de surface en aval. Les cellules ont été diluées à l’échelle 1 :10 pour le comptage (5 μL de cellules, 5 μL de bleu de trypan, 40 μL de RPMI). Cette dilution a permis d’obtenir entre 50 et 100 cellules par 16 grilles carrées, ce qui garantit un comptage plus précis des cellules, car les cellules ne sont ni trop denses, ni trop superposées, ni trop clairsemées. Le nombre de cellules nucléées provenant de méninges cérébrales et méninges de la moelle épinière regroupées par souris était le suivant : pour les méninges de souris traitées par simulacre = 100 000 à 150 000 cellules et pour les méninges de souris atteintes de la maladie démyélinisante induite par le virus de l’encéphalomyélite murine de Theiler (TMEV-IDD) = 300 000 à 350 000 cellules. Le nombre de cellules varie en fonction de la précision du prélèvement, du traitement et de la présence d’une inflammation méningée.
    9. Passez à la technique unicellulaire souhaitée telle qu’une surface FACS (Figure 3)14,36,42,43,44, des protocoles de coloration intracellulaire 33,45, de la stimulation in vitro, des essais de culture cellulaire 33,46,47, du test ELISPOT 28,34,35 et des tests en vrac ou unicellulaires transcriptomique 37,48.
      REMARQUE : Gardez tous les tubes sur de la glace entre les étapes de traitement.
  4. Préparation de suspensions unicellulaires de tissus cérébraux et de moelle épinière
    1. Transférez le tissu du cerveau ou de la moelle épinière avec le milieu vers le haut de la boîte de Pétri de 100 mm en versant le tissu et le milieu à partir du tube. À l’aide d’une pince, déplacez le tissu au fond de la boîte de Pétri. Hacher finement le cerveau ou la moelle épinière à l’aide d’une lame de rasoir stérile. À l’aide de la lame de rasoir, déplacez le tissu haché vers le fond de l’assiette en grattant pour rassembler le tissu.
      REMARQUE : Pour le protocole de digestion enzymatique ci-dessous, jusqu’à deux moelles épinières peuvent être regroupées pour le traitement. Les cerveaux doivent être traités individuellement.
    2. À l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL, ajouter 3 mL de RPMI additionné de 10 % de sérum de veau fœtal (FCS) dans la boîte de Pétri. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL, pipeter de haut en bas pour remettre le tissu en suspension dans le milieu et transférer dans un tube conique de 15 mL.
      REMARQUE : Si l’application en aval est l’analyse de séquençage de l’ARN ou la culture cellulaire d’une seule cellule ou en vrac, les lots de FCS doivent être testés pour s’assurer que les cellules ne sont pas activées avant l’analyse. Alternativement, les cellules peuvent être traitées en utilisant 1x PBS avec 0,04% BSA au lieu de RPMI avec 10% FCS.
    3. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL, laver la boîte de Pétri avec 2 mL supplémentaires de milieu pour recueillir tout tissu résiduel et transférer dans un tube conique pour obtenir un volume total de 5 mL. Gardez les tubes sur de la glace entre les étapes de traitement.
    4. À l’aide d’une pipette, remettre en suspension la poudre de collagénase I dans le milieu Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) pour obtenir la concentration désirée (c.-à-d. 100 mg/mL). Ajouter la collagénase de type I dans le tube conique contenant l’échantillon de tissu haché pour obtenir la concentration finale désirée (c.-à-d. 50 μL pour 1 mg/mL).
      REMARQUE : Des concentrations plus élevées de collagénase augmenteront les rendements cellulaires, mais peuvent cliver les marqueurs de surface cellulaire. Par conséquent, les lots de collagénase I doivent être titrés pour déterminer la concentration optimale nécessaire pour obtenir le plus grand nombre de cellules viables avec tous les marqueurs de surface cellulaire requis intacts. Par exemple, la collagénase I a été testée à des concentrations finales de 0,5 mg/mL, 1 mg/mL et 2 mg/mL sur des échantillons de cerveau ou de moelle épinière. La viabilité cellulaire a été déterminée à l’aide de la méthode d’exclusion du bleu de trypan et les marqueurs de surface cellulaire CD45, CD19 et CD4 ont été évalués par cytométrie en flux. Une concentration de 1 mg/mL de collagénase I a permis d’obtenir le nombre de cellules vivantes le plus élevé tout en conservant tous les marqueurs de surface cellulaire d’intérêt. Ainsi, cette concentration a été utilisée pour d’autres expériences examinant ces types de cellules.
    5. Remettre délicatement en suspension la poudre de DNase I en utilisant du chlorure de sodium de 0,15 M jusqu’à la concentration de base souhaitée. Ajouter la DNase I remise en suspension dans le tube conique contenant l’échantillon de tissu haché pour obtenir une concentration finale de 20 U/mL.
      REMARQUE : Les lots de DNase I varient selon les unités d’activité par mL. La concentration à ajouter à l’échantillon de tissu changera en fonction des unités d’activité par millilitre du flacon de stock. La concentration finale souhaitée par échantillon est de 20 U/mL.
    6. Placez les tubes dans un portoir à tubes au bain-marie à 37 °C et incubez-les pendant 40 min. Retournez les tubes toutes les 15 minutes pour bien mélanger le tissu avec les enzymes. Après incubation, ajouter 500 μL d’EDTA 0,1 M (pH = 7,2) dans chaque tube pour une concentration finale de 0,01 M EDTA et incuber pendant 5 min supplémentaires pour inactiver la collagénase.
    7. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL, ajouter 9 mL de RPMI complété par 10 % de FCS dans chaque tube pour porter le volume de chaque tube à ~14,5 mL. Centrifuger à 450 x g pendant 5 min à 4 °C. À l’aide d’une pipette Pasteur sous vide, aspirer le surnageant en prenant soin de ne pas toucher la pastille de cellule.
    8. À l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL, ajouter 3 mL de solution de gradient de densité isotonique à 100 % dans le tube contenant la pastille cellulaire. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL, ajouter un milieu RPMI 10 % FCS supplémentaire pour porter le volume final à 10 mL et remettre en suspension la pastille cellulaire pour créer une couche de solution de gradient de densité isotonique à 30 %.
      REMARQUE : Préparer le milieu à gradient de densité isotonique 100 % à l’avance, aliquote, et conserver à 4 °C jusqu’à 3 mois. Pour préparer la solution de gradient de densité isotonique à 100 %, diluer le milieu de gradient de densité (tableau des matériaux) avec un tampon de dilution du milieu de gradient de densité. Préparer le tampon de dilution du milieu à gradient de densité (80,0 g/L de NaCl, 3,0 g/L de KCl ; 0,73 g/L de Na 2 HP0 4, 0,20 g/L de KH2HP04 ; 20,0 g/L de glucose) et stériliser le filtre à l’aide d’un système de filtration sous vide. Préparez la solution de gradient de densité isotonique à 100 % en mélangeant 1 partie de tampon de dilution de gradient de densité et 9 parties de milieu de gradient de densité. Bien mélanger.
    9. Retournez et mélangez bien chaque tube avant d’ajouter la sous-couche de solution de gradient de densité isotonique à 70 %. Insérez une pipette sérologique de 1 mL contenant 1 mL de solution de gradient de densité isotonique à 70 % dans le fond du tube. Déposer lentement 1 mL de la solution, en prenant soin de ne pas faire de bulles. Retirez lentement la pipette sérologique du tube, en prenant soin de ne pas perturber le gradient.
      REMARQUE : Pour la sous-couche à 70 %, la solution de gradient de densité isotonique à 100 % doit être diluée à 70 % à l’aide d’un média RPMI (c.-à-d. 7 mL de solution de gradient de densité isotonique à 100 % et 3 mL de substrat RPMI bien mélangés). De plus, la création d’une sous-couche propre et non perturbée à 70 % est essentielle pour l’élimination des débris de myéline et pour l’obtention de suspensions unicellulaires pures à l’interface du gradient après centrifugation.
    10. Centrifuger à 800 x g pendant 30 min à 4 °C sans frein. Aspirer le surnageant, y compris la couche de débris de myéline, jusqu’à ce qu’il reste 2 à 3 ml dans le tube, en prenant soin de ne pas perturber la couche cellulaire. Prélever la couche cellulaire entre le gradient de densité de 30 et 70 % à l’aide d’une pipette de 1 mL et la transférer dans un nouveau tube conique de 15 mL.
    11. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL, ajouter le milieu FPS à 10 % RPMI pour porter le volume final à 15 mL. Centrifuger 450 x g pendant 5 min à 4 °C.
      REMARQUE : Au cours de cette étape, les couches cellulaires de deux tubes peuvent être regroupées si nécessaire. Ne mettez pas en commun plus de deux tubes, sinon les cellules ne granuleront pas en raison d’une concentration de milieu à gradient haute densité.
    12. Aspirez le surnageant avec précaution pour ne pas perturber la pastille cellulaire. Remettre les cellules en suspension dans un volume/tampon approprié pour les compter à l’aide d’un hémocytomètre (p. ex., remettre en suspension une seule moelle épinière dans 250 μL de tampon FACS pour la coloration de la surface en aval) (figure 3).
    13. À l’aide d’une pipette de 1 ml, transférez les suspensions cellulaires dans le haut d’un tube supérieur filtrant (tableau des matériaux) et laissez les cellules filtrer vers le fond du tube pour éliminer les débris de myéline restants.
    14. À l’aide d’un colorant d’exclusion au bleu de trypan, diluez et comptez les cellules sur un hémocytomètre en faisant la moyenne d’au moins deux grilles de 16 carrés pour une précisionde 40,41.
    15. Procédez à la technique d’analyse unicellulaire souhaitée.
      REMARQUE : À l’aide de diverses formes de collagénase (c.-à-d. D, type I, type II, type IV), les cellules immunitaires, la microglie (Figure 3), les astrocytes, les péricytes, les cellules endothéliales49 et les neurones50 peuvent tous être isolés efficacement. Le nombre de cellules nucléées obtenues pour les résultats était le suivant à l’aide de l’enzyme collagénase I titrée : cerveau entier traité par simulacre = 500 000 à 600 000 cellules ; Cerveau entier TMEV-IDD = 800 000 à 1 000 000 de cellules ; Moelle épinière entière traitée par simulacre = 150 000 à 200 000 cellules ; Moelle épinière TMEV-IDD entière = 300 000 à 400 000. Le nombre de cellules varie en fonction de la précision du prélèvement, du traitement et de la présence ou non d’une inflammation du SNC.

Résultats

Cette expérience représentative visait à quantifier les lymphocytes B et T et à décrire la localisation des lymphocytes B et T dans les compartiments méningés et parenchymateux du SNC dans des conditions homéostatiques ainsi que dans un modèle murin de SEP progressive (c’est-à-dire TMEV-IDD). Le TMEV-IDD a été induit chez des souris SJL femelles âgées de 5 semaines par une infection intracrânienne avec 5 x 106 unités formant la plaque (PFU) de TMEV BeAn, comme décrit précédemment

Discussion

Les méthodes d’évaluation de la composition cellulaire dans le compartiment du SNC au cours de l’homéostasie et de la maladie sont essentielles pour comprendre les états physiologiques et pathologiques du SNC. Cependant, bien qu’elles constituent une barrière importante dans le SNC et qu’elles abritent un large éventail de cellules immunitaires, les méninges sont souvent omises de l’analyse car de nombreuses méthodes conventionnelles d’extraction de tissus pour le cerveau et la moelle épinière ne pe...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient le personnel du Center for Comparative Medicine and Research (CCMR) de Dartmouth pour les soins spécialisés qu’ils ont prodigués aux souris utilisées pour ces études. Cette recherche a été financée par le Fonds de recherche de Bornstein.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Aluminum foilanyN/A
Bovine Serum AlbuminThermoFisher Scientific37002D
CentrifugeBeckman CoulterAllegra X-12R centrifuge
Collagenase IWorthingtonLS004196
Conical tube, 15 mLVWR525-1069
Conical tube, 50 mLVWR89039-658
Cover glassHauser Scientific5000
CryomoldVWR18000-128
Curved forcepsFine Science Tools11003-14
Disposable polystyrene tube, 14 mLFisher Scientific14-959-1B
Disposable ScalpelFisher ScientificNC0595256
DNAse IWorthingtonLS002139
Dry iceAirgasN/A
Durmont #7ForcepsFine Science Tools11271-30
EDTA disodium salt dihydrateAmresco0105-500g
Ethanol, 100%anyN/A
Fetal Bovine Serum (FBS)HycloneSH30910.03
Filter top tube, 5 mLVWR352235
Fixable viability stain 780Becton Dickinson565388
Flow cytometerBeckman CoulterGallios
GlucoseFisher ChemicalD16-500
Goat anti-mouse IgG (488 conjugate)Jackson immunoresearch115-546-146
Goat anti-mouse IgG (594 conjugate)Jackson immunoresearch115-586-146
Goat anti-rabbit 488Jackson immunoresearch111-545-144
Goat anti-rat 594Jackson immunoresearch112-585-167
Goat anti-rat 650Jackson immunoresearch112-605-167
Hank's Balnced Salt Solution (HBSS)Corning21-020-CV
HemacytometerAndwin Scientific02-671-51B
HemostatFine Science Tools13004-14
HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid)ThermoFisher Scientific15630080
KClFisher chemicalBP366-500
KH2PO4 (anhydrous)Sigma AldrichP5655-100G
Liquid NitrogenAirgasN/A
Mouse FC block (CD16/32)Becton Dickinson553141
Na2HP04 (anhydrous)Fisher ChemicalS374-500
NaClFisher chemicalS671-500
Needle, 25 gaugeBecton Dickinson305122
Normal mouse serumThermoFisher Scientific31881
Nylon mesh strainerVWR352350
OCTSakura4583
Paraformaldehyde, 20%Electron Microscopy Sciences15713-SDiluted to 4% using 1 x PBS
Pasteur pipette, 9 inch, unpluggedFisher Scientific13-678-20C
PBS (1x)Corning21-040-CV
PE Rat Anti-Mouse CD4Becton Dickinson553730
PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19Becton Dickinson562329
Percoll density gradient mediaGE healthcare17-0891-01
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45Becton Dickinson550994
Petri dish, 100 mmVWR353003
pH meterFisher Scientific13-636-AB150
Pipet-AidDrummond Scientific Corporation4-000-101
Pipette 200 µlGilsonFA10005M
Pipette tips, 1 mLUSA Scientific1111-2831
Pipette tips, 200 µlUSA Scientific1111-1816
Pipette, 1 mLGilsonFA10006M
Prolong Diamond mountant with DAPIThermoFisher ScientificP36962
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32Becton Dickinson553141
Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone)Abcamab16669
Rabbit anti-mouse lamininAbcamab11575
Rat anti-mouse ERT-R7Abcamab51824
RPMI 1640Corning10-040-CV
Serological pipet, 1 mLVWR357521
Serological pipet, 10 mLVWR357551
Serological pipet, 5 mLVWR357543
Sodium hydroxideFisher ScientificS318-100
SucroseFisher chemicalS5-500
Surgical scissorsFine Science Tools14001-16
Surgical scissors, extra fineRobozRS-5882
Syringe, 10 mLBecton Dickinson302995
Syringe, 5 mLBecton Dickinson309646
Trypan blueGibco15250-061
Vacuum filter systemMillipore20207749
Vacuum flaskThomas Scientific5340-2L
Vacuum in-line filterPall Corporation4402
Vacuum lineCole PalmerEW-06414-20
Water bathThermoFisher ScientificVersa bath

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