Autores
Entre em contato

Entrar

É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.

Neste Artigo

  • Resumo
  • Resumo
  • Introdução
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Este artigo apresenta dois protocolos otimizados para examinar células imunes residentes e derivadas periféricas dentro do sistema nervoso central, incluindo cérebro, medula espinhal e meninges. Cada um desses protocolos ajuda a determinar a função e a composição das células que ocupam esses compartimentos em condições de estado estacionário e inflamatório.

Resumo

O sistema nervoso central (SNC) é composto pelo cérebro e pela medula espinhal e é envolto pelas meninges, camadas membranosas que servem de barreira entre a periferia e o SNC. O SNC é um sítio imunologicamente especializado e, em condições de estado estacionário, o privilégio imunológico é mais evidente no parênquima do SNC. Em contraste, as meninges abrigam uma gama diversificada de células residentes, incluindo células imunes inatas e adaptativas. Durante condições inflamatórias desencadeadas por lesão do SNC, autoimunidade, infecção ou mesmo neurodegeneração, células imunes derivadas da periferia podem entrar no parênquima e se instalar dentro das meninges. Acredita-se que essas células realizem ações benéficas e prejudiciais durante a patogênese da doença do SNC. Apesar desse conhecimento, as meninges são frequentemente negligenciadas quando se analisa o compartimento do SNC, pois os métodos convencionais de extração tecidual do SNC omitem as camadas meníngeas. Este protocolo apresenta dois métodos distintos para o isolamento rápido de tecidos murinos do SNC (isto é, cérebro, medula espinhal e meninges) que são adequados para análise a jusante através de técnicas de célula única, imunohistoquímica e métodos de hibridização in situ. Os métodos descritos fornecem uma análise abrangente dos tecidos do SNC, ideal para avaliar o fenótipo, a função e a localização das células que ocupam o compartimento do SNC sob condições homeostáticas e durante a patogênese da doença.

Introdução

O sistema nervoso central (SNC) é um sítio imunologicamente especializado. O parênquima do SNC, excluindo o espaço liquórico, as meninges e a vasculatura, é classicamente visto como um sítio imunoprivilegiado 1,2,3,4,5 e é relativamente desprovido de células imunes durante condições homeostáticas2,6,7. Em contraste, as meninges, compostas pelas camadas dura, aracnoide e pia, são componentes cruciais do compartimento do SNC, participando ativamente da vigilância imunológica homeostática e dos processos inflamatórios durante a patogênese da doença 3,6,7,8. Durante condições de estado estacionário, as meninges suportam numerosas células sentinelas imunes, incluindo células linfoides inatas (ILC), macrófagos, células dendríticas (DC), mastócitos, células T e, em menor grau, células B 9,10,11.

As meninges são estruturas altamente vascularizadas e contêm vasos linfáticos que fornecem uma conexão linfática entre o SNC e sua periferia8,12,13,14. Em condições inflamatórias induzidas por lesão do SNC, infecções, autoimunidade ou mesmo neurodegeneração, células imunes derivadas da periferia infiltram o parênquima e alteram a paisagem imune dentro das meninges. Após a infiltração celular, as meninges podem representar um nicho funcional para células imunes derivadas da periferia, promovendo agregação de células imunes, ativação de células imunes locais e sobrevivência a longo prazo no compartimento do SNC. Inflamação meníngea proeminente é observada em múltiplas doenças que afetam o SNC, incluindo esclerose múltipla (EM)15,16,17,18,19, acidente vascular cerebral 20,21, lesão estéril 22,23 (i.e., lesão medular e traumatismo cranioencefálico), enxaqueca 24 e infecção microbiana 25,26,27,28,29. Assim, a caracterização de células residentes e células imunes derivadas periféricas no compartimento meníngeo é essencial para a compreensão do papel dessas células durante condições de estado estacionário e patogênese da doença.

A extração do cérebro, medula espinhal e meninges do crânio e corpos vertebrais é tecnicamente desafiadora e demorada. Atualmente, não há técnicas disponíveis para a extração rápida do cérebro com as três camadas meníngeas intactas. Embora a laminectomia produza excelente morfologia do tecido medular e preserve as camadas meníngeas, é extremamente demorada e complicada30,31. Por outro lado, métodos de extração mais convencionais, como a remoção do cérebro do crânio e a extrusão hidráulica da medula espinhal, facilitam a rápida extração do tecido do SNC, mas tanto a meninge aracnoide quanto a dural são perdidas com essas técnicas30,31. A omissão das camadas dura-máter e aracnoide durante o isolamento convencional dos tecidos do cérebro e da medula espinhal resulta em uma análise incompleta das células dentro do compartimento do SNC. Assim, a identificação de novas técnicas focadas na extração rápida de tecidos do SNC com meninges intactas é crucial para a análise ótima do compartimento do SNC.

Este manuscrito apresenta dois métodos para a extração rápida do cérebro, medula espinhal e meninges de camundongos, facilitando a análise a jusante de células residentes e células imunes derivadas da periferia no parênquima do SNC e meninges. Esses protocolos otimizados concentram-se em 1) isolar suspensões unicelulares para análise a jusante e 2) preparar o tecido para processamento histológico. A obtenção de suspensões unicelulares do cérebro, tecido medular e meninges durais e aracnoides32 permite a análise simultânea de células residentes nos compartimentos parenquimatoso e meníngeo. Suspensões unicelulares podem ser usadas em diferentes aplicações, incluindo ensaios de cultura celular para realizar estimulação in vitro 33, imunospot ligado à enzima (ELISpot)28,34,35, citometria de fluxo 36,33 e transcriptômica de célula única 37 ou em massa. Além disso, o protocolo otimizado para descalcificação de cérebros inteiros e medula espinhal com crânios ou colunas vertebrais intactos, respectivamente, permite a descalcificação suave do osso circundante, deixando as meninges intactas e preservando a morfologia tecidual. Este método permite a identificação seletiva de proteínas ou RNA usando técnicas de imunohistoquímica (IHQ) ou hibridização in situ (HIS) dentro dos espaços parenquimatoso e meníngeo. A caracterização do fenótipo, estado de ativação e localização de células residentes e células imunes derivadas periféricas dentro do SNC pode fornecer informações essenciais para a compreensão de como tipos celulares individuais no compartimento do SNC contribuem para a homeostase e patogênese da doença.

Protocolo

Todo trabalho com animais utiliza protocolos revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Escola de Medicina Geisel de Dartmouth.

1. Processamento de amostras de cérebro e medula espinhal para descalcificação

  1. Isolamento de amostras de cérebro e medula espinhal
    1. Eutanásia do rato por inalação de CO2 . Certifique-se de que a taxa de fluxo de CO2 desloca de 10% a 30% do volume da gaiola por minuto.
    2. Usando pinças, levante o processo xifoide e corte a parede abdominal lateralmente logo abaixo da caixa torácica com uma tesoura, puxando para cima para evitar cortar vasos sanguíneos ou órgãos subjacentes. Corte o diafragma lateralmente.
    3. Corte a caixa torácica ao longo das bordas laterais paralelas aos pulmões até a clavícula. Usando pinças, levante o esterno e pinça o esterno com um hemostático. Coloque o hemostático sobre a cabeça para levantar a caixa torácica e expor o coração.
    4. Usando pinças, segure o coração perto de seu ápice e faça uma incisão no átrio direito do coração para fornecer uma saída. Insira uma agulha de 25 G com uma seringa de 10 mL conectada para administrar lentamente 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) gelada no ventrículo esquerdo para perfundir transcardialmente o camundongo.
      NOTA: A perfusão deve ocorrer durante 4 a 5 minutos até que o fígado seja limpo de sangue. Um total de 10 mL de 1x PBS geralmente é suficiente para a perfusão, mas mais pode ser utilizado se necessário. Um fígado claro geralmente indica perfusão adequada.
    5. Com tesoura afiada, retirar a cabeça por decapitação (Figura 1; 1). Faça uma incisão na linha média da pele (Figura 1; 2) e vire a pele sobre os olhos para liberar o crânio.
    6. Corte no osso nasal para liberação da mandíbula do crânio (Figura 1; 3). Remova a mandíbula, a língua e os olhos. Corte ao longo das faces laterais do crânio para liberar o tecido ao longo do conduto auditivo externo (Figura 1; 4). Corte para remover todo o excesso de pele, músculo e tecido que cobre o crânio.
    7. Separe a caixa torácica da coluna vertebral cortando paralelamente à coluna vertebral com tesoura afiada (Figura 1; 5 e 6). Realizar um pequeno corte na região lombar inferior para isolar a coluna vertebral (Figura 1; 7). Aparar e remover qualquer músculo remanescente ao longo da coluna vertebral para expor as vértebras (Figura 1; 8).
      NOTA: A remoção do excesso de tecido da coluna vertebral e do crânio é necessária para obter uma penetração adequada do tampão de descalcificação do fixador paraformaldeído (PFA) e do ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).
  2. Pós-fixação, descalcificação e criopreservação
    1. Usando pinças, colocar o cérebro com o crânio intacto ou a coluna vertebral em um tubo cônico de 15 mL contendo 10 mL de PFA a 4%. Colocar os tubos a 4 °C durante, pelo menos, 48 h para uma fixação adequada.
      NOTA: Para evitar a sobrefixação do tecido, não exceda 72 h de fixação. Os tempos de fixação dos espécimes ósseos são prolongados antes da descalcificação. A fixação adequada protegerá o tecido dos efeitos da descalcificação e garantirá melhor morfologia tecidual.
    2. Enxaguar o cérebro ou a medula espinhal removendo o tecido do PFA a 4% com pinça e colocando o tecido em um tubo descartável de 14 mL com 10 mL de PBS 1x por 5 min. Transferir o cérebro ou a medula espinhal para um tubo cônico de 50 mL com 10 mL de EDTA a 10% (pH = 7,2–7,4).
      NOTA: O uso de um tubo maior com 10 mL de EDTA proporciona ao EDTA uma maior área de contato com o tecido e acelera o processo de descalcificação.
    3. Verifique diariamente se o osso está macio e maleável: retire o tecido da solução de EDTA com pinças, coloque-o em uma placa de Petri e teste suavemente a maciez óssea com uma agulha de 25 G. Se a agulha penetrar facilmente no osso, o processo de descalcificação está completo.
    4. Retire o tecido da solução de EDTA e transfira o cérebro ou a medula espinhal para um tubo descartável de 14 mL contendo 10 mL de PBS 1x e lave por 10 min. Repita a lavagem.
      NOTA: A descalcificação geralmente leva de 2 a 3 dias. A solução deve ser trocada a cada 2–3 dias se o osso ainda não estiver adequadamente descalcificado. No entanto, a incubação prolongada em EDTA após a descalcificação do osso pode danificar a morfologia tecidual.
    5. Prepare soluções de sacarose a 10%, 20% e 30% adicionando sacarose a 1x PBS. Por exemplo, para 10% de sacarose, adicione 10 g de sacarose e leve o volume para 100 mL usando 1x PBS estéril. Conservar a solução a 4 °C durante um período máximo de 1 mês.
      NOTA: As soluções de sacarose são propensas ao crescimento de microrganismos, pelo que as amostras não devem ser armazenadas durante períodos prolongados de tempo nestas soluções.
    6. Retire o tecido do PBS 1x, coloque-o em 10 mL de solução de sacarose a 10% e armazene-o a 4 °C. Deixe o tecido descansar por 24 h ou até afundar no fundo do tubo.
    7. Repita este processo, movendo o tecido para uma solução de sacarose a 20% primeiro e, finalmente, para uma solução de sacarose a 30%. Deixar o tecido afundar em sacarose a 30% (pelo menos 24 h) e proceder à inclusão do tecido.
  3. Incorporação e congelamento de tecidos
    1. Usando pinças, retire o tecido da sacarose a 30%, coloque-o em uma placa de Petri e incline a placa para se livrar de qualquer excesso de solução de sacarose no tecido. Usando um bisturi, corte o tecido em segmentos desejados.
    2. Crie uma camada fina de composto de temperatura de corte ideal (OCT) na parte inferior do criomold e coloque a(s) peça(s) de tecido no molde. Cubra completamente o tecido com o composto OCT, garantindo que não haja bolhas.
    3. Congelar os blocos pairando sobre nitrogênio líquido38 ou colocando os blocos em uma pasta de gelo seco39 com isopropanol 100% até que o bloco fique opaco. Embrulhe os criomoldes em papel alumínio e armazene os blocos a -80 °C para armazenamento a longo prazo. Mova os blocos para -20 °C antes de seccionar.
      NOTA: Deve-se ter cuidado ao seccionar e realizar protocolos histológicos em cérebros descalcificados, pois as camadas craniana e meníngea podem ser perdidas se os cortes forem manuseados grosseiramente.

2. Preparo das meninges e tecidos do SNC para coloração por citometria de fluxo

  1. Extraindo a calota craniana e o cérebro
    1. Com tesoura afiada, retirar a cabeça por decapitação (Figura 2A; 1). Com tesoura, fazer uma incisão mediana na pele (Figura 2A; 2) e virar a pele sobre os olhos para liberar o crânio.
    2. Coloque a tesoura dentro do forame magno e comece a cortar o crânio lateralmente ao longo dos córtices em direção ao bulbo olfatório, mantendo as incisões acima do conduto auditivo externo e da mandíbula (Figura 2A; 3). Realizar os mesmos cortes no lado oposto, com cortes que se encontram no bulbo olfatório para liberar a calota craniana do cérebro (Figura 2A; 3).
    3. Usando pinças, descasque a calota craniana e coloque a calota craniana em um tubo cônico de 15 mL contendo 5 mL de meio RPMI frio suplementado com HEPES 25 mM. Mantenha o tubo no gelo.
    4. Usando pinças curvas, coloque a pinça abaixo da base do cérebro e levante para libertar o cérebro da calota craniana. Coloque o cérebro em um tubo cônico de 15 mL contendo 5 mL de RPMI frio suplementado com 25 mM HEPES. Mantenha o tubo no gelo até o processamento.
  2. Extração da coluna vertebral e tecido medular
    1. Com pinça e tesoura afiada, separar a caixa torácica da coluna vertebral cortando paralelamente à coluna vertebral (Figura 2A; 4 e 5). Realizar um pequeno corte na região lombar inferior para isolar a coluna vertebral (Figura 2A; 6). Aparar e remover qualquer músculo remanescente ao longo da coluna vertebral para expor as vértebras (Figura 2A; 7).
    2. Coloque a tesoura cirúrgica extrafina dentro da coluna vertebral e corte ao longo da borda lateral da coluna (Figura 2C). Cortar completamente a borda lateral oposta para dividir a coluna vertebral em uma porção anterior e posterior.
      NOTA: A medula espinhal permanecerá presa à coluna vertebral.
    3. Com pinças, descasque lenta e cuidadosamente a medula espinhal da coluna vertebral e coloque o tecido em um tubo cônico de 15 mL contendo 5 mL de RPMI fria com HEPES 25 mM. Transferir as porções anterior e posterior da coluna vertebral para um tubo cônico de 15 mL contendo 5 mL de RPMI fria com HEPES 25 mM.
  3. Remoção das meninges para preparar suspensões unicelulares
    1. Usando pinças, remova a calota craniana da mídia RPMI. Usando pinças afiadas (pinça #7; Tabela de Materiais), escore ao redor da borda externa da calota craniana (Figura 2B) e descasque as meninges para longe da borda da calota craniana, raspando para remover as meninges dural e aracnoide. Coloque as meninges em uma placa de Petri.
      NOTA: A remoção das meninges do cérebro e da medula espinhal requer prática. Se o usuário tiver dificuldade para extrair as meninges, use um microscópio dissecante para ajudar na remoção.
    2. Retire a coluna vertebral do tubo. Usando pinças afiadas, escore ao redor das bordas da coluna vertebral para liberar as meninges e descasque as meninges da borda da vértebra usando pinças curvas. Coloque as meninges em uma placa de Petri.
    3. Coloque um filtro de tela de nylon em um tubo cônico de 50 mL. Mover as meninges para o filtro e adicionar 3 mL de RPMI suplementado com 25 mM HEPES. Usando o êmbolo de uma seringa de 5 mL, triture o tecido e o meio através do filtro.
    4. Usando uma pipeta sorológica de 5 mL, lave o filtro com mais 2 a 3 mL de meio RPMI/HEPES até que todo o tecido visível tenha passado pelo filtro.
      NOTA: Para obter números de células adequados para análise por citometria de fluxo, meninges de vários animais podem precisar ser agrupadas. Neste experimento (Figura 3 e Figura 4), as meninges do cérebro e da medula espinhal de 4 a 5 camundongos foram agrupadas. Se as amostras forem agrupadas, será necessário um meio adicional para triturar o tecido através do filtro de malha de nylon para evitar o superaquecimento do tecido.
    5. Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, transferir as células e o meio para um tubo cônico fresco de 15 mL. Com pipeta sorológica de 10 mL, lave o tubo cônico de 50 mL com 5 mL de meio para coletar as células restantes. Centrifugar a 450 x g durante 5 min a 4 °C para pellet das células.
    6. Usando uma pipeta de Pasteur com vácuo, aspirar o sobrenadante tomando cuidado para evitar a pastilha celular e ressuspender as células em um volume e tampão apropriados.
    7. Para contar a suspensão de célula única, diluir um pequeno volume de células (isto é, 5–10 μL) usando corante de exclusão azul de tripano (diluição 1:10) e RPMI. Adicionar 10 μL da diluição ao hemocitômetro.
    8. Conte as células conforme descrito anteriormente40,41, com uma média de pelo menos duas grades de 16 quadrados para precisão.
      NOTA: Na Figura 3, por exemplo, células agrupadas e peletizadas das meninges foram ressuspensas em 250 μL de tampão de classificação celular ativada por fluorescência (FACS) (1x PBS com 1% FBS) para coloração a jusante da superfície. As células foram diluídas 1:10 para contagem (5 μL células, 5 μL de azul de tripano, 40 μL de RPMI). Essa diluição produziu entre 50 e 100 células por 16 grades quadradas, garantindo uma contagem celular mais precisa porque as células não são nem muito densas e sobrepostas, nem muito esparsas. As contagens de células nucleadas de meninges agrupadas do cérebro e da medula espinhal por camundongo foram as seguintes: Para meninges de camundongos de tratamento simulado = 100.000–150.000 células e para meninges de camundongos da doença desmielinizante induzida pelo vírus da encefalomielite murina de Theiler (TMEV-IDD) = 300.000–350.000 células. As contagens de células variam dependendo da precisão da coleta, do processamento e se a inflamação meníngea está presente.
    9. Proceder à técnica unicelular desejada, como superfície FACS (Figura 3)14,36,42,43,44, protocolos de coloração intracelular 33,45, estimulação in vitro, ensaios de cultura celular 33,46,47, ensaio ELISPOT 28,34,35 e massa ou unicelular transcriptômica37,48.
      NOTA: Mantenha todos os tubos no gelo entre as etapas de processamento.
  4. Preparação de suspensões unicelulares de tecido cerebral e medular
    1. Transfira o tecido cerebral ou da medula espinhal com o meio para o topo da placa de Petri de 100 mm, despejando o tecido e o meio do tubo. Usando pinças, mova o tecido para o fundo da placa de Petri. Pique finamente o cérebro ou a medula espinhal com uma lâmina de barbear estéril. Usando a lâmina de barbear, mova o tecido picado para o fundo da placa raspando para coletar o tecido.
      NOTA: Para o protocolo de digestão enzimática abaixo, até duas medulas, podem ser agrupadas para processamento. Os cérebros devem ser processados individualmente.
    2. Usando uma pipeta sorológica de 5 mL, adicionar 3 mL de RPMI suplementado com 10% de soro fetal de bezerro (FCS) à placa de Petri. Com pipeta sorológica de 10 mL, pipetar para cima e para baixo para ressuspender o tecido no meio e transferir para um tubo cônico de 15 mL.
      NOTA: Se a aplicação a jusante for análise de sequenciamento de RNA de célula única ou em massa ou cultura de células, os lotes FCS devem ser testados para garantir que as células não sejam ativadas antes da análise. Alternativamente, as células podem ser processadas usando 1x PBS com 0,04% BSA em vez de RPMI com 10% FCS.
    3. Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, lave a placa de Petri com mais 2 mL de meio para coletar qualquer tecido residual e transferir para um tubo cônico para um volume total de 5 mL. Mantenha os tubos no gelo entre as etapas de processamento.
    4. Com uma pipeta, ressuspenda o pó de colagenase I em meio Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) para obter a concentração desejada (i.e., 100 mg/mL). Adicionar colagenase tipo I ao tubo cônico contendo a amostra de tecido picado para obter a concentração final desejada (isto é, 50 μL por 1 mg/mL).
      NOTA: Concentrações mais elevadas de colagenase aumentarão o rendimento celular, mas podem clivar marcadores de superfície celular. Portanto, os lotes de colagenase I devem ser titulados para determinar a concentração ideal necessária para obter o maior número de células viáveis com todos os marcadores de superfície celular necessários intactos. Por exemplo, a colagenase I foi testada nas concentrações finais de 0,5 mg/mL, 1 mg/mL e 2 mg/mL em amostras de cérebro único ou medula espinhal. A viabilidade celular foi determinada pelo método de exclusão do azul de tripano e os marcadores de superfície celular CD45, CD19 e CD4 foram avaliados por citometria de fluxo. Uma concentração de 1 mg/mL de colagenase I produziu a maior contagem de células vivas, mantendo todos os marcadores de superfície celular de interesse. Assim, essa concentração foi utilizada para novos experimentos examinando esses tipos celulares.
    5. Ressuspenda suavemente o pó de DNase I usando cloreto de sódio 0,15 M até a concentração de estoque desejada. Adicionar a DNase I ressuspensa ao tubo cónico contendo a amostra de tecido picado para obter uma concentração final de 20 U/ml.
      NOTA: Os lotes da DNase I variam de acordo com as unidades de atividade por mL. A concentração a ser adicionada à amostra de tecido mudará com base nas unidades de atividade do frasco para injetáveis por mililitro. A concentração final desejada por amostra é de 20 U/mL.
    6. Coloque os tubos num suporte de tubo em banho-maria a 37 °C e incube durante 40 minutos. Inverta os tubos a cada 15 min para misturar completamente o tecido com as enzimas. Após a incubação, adicionar 500 μL de EDTA 0,1 M (pH = 7,2) a cada tubo para uma concentração final de EDTA 0,01 M e incubar por mais 5 min para inativar a colagenase.
    7. Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, adicione 9 mL de RPMI suplementado com 10% de SFB a cada tubo para trazer o volume de cada tubo para ~14,5 mL. Centrifugar a 450 x g durante 5 min a 4 °C. Usando uma pipeta de Pasteur com vácuo, aspirar o sobrenadante tomando cuidado para não tocar no pellet celular.
    8. Usando uma pipeta sorológica de 5 mL, adicionar 3 mL de solução de gradiente de densidade isotônica estoque a 100% ao tubo contendo o pellet de células. Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, adicione um meio RPMI 10% FCS adicional para trazer o volume final para 10 mL e ressuspenda o pellet de células para criar uma camada de solução de gradiente de densidade isotônica de 30%.
      NOTA: Prepare o meio de gradiente de densidade isotônico de estoque de 100% com antecedência, alíquota e armazene a 4 °C por até 3 meses. Para preparar a solução de gradiente de densidade isotônica de estoque de 100%, dilua o meio de gradiente de densidade (Tabela de Materiais) com tampão de diluição do meio de gradiente de densidade. Preparar o tampão de diluição do meio com gradiente de densidade (80,0 g/L NaCl, 3,0 g/L KCl; 0,73 g/L Na2 HP0 4, 0,20 g/L KH2HP04; 20,0 g/L glicose) e esterilizar o filtro usando um sistema de filtro a vácuo. Faça a solução de gradiente de densidade isotônica de estoque de 100% misturando 1 parte do tampão de diluição de gradiente de densidade e 9 partes de mídia de gradiente de densidade. Misture bem.
    9. Inverta e misture bem cada tubo antes de adicionar a solução de gradiente de densidade isotônica de 70% subjacente. Introduzir uma pipeta serológica de 1 ml contendo 1 ml de solução de gradiente de densidade isotónica de 70% no fundo do tubo. Subpor lentamente 1 mL da solução, tomando cuidado para não formar bolhas. Remover lentamente a pipeta sorológica do tubo, tomando cuidado para não perturbar o gradiente.
      NOTA: Para o underlay de 70%, a solução de gradiente de densidade isotônica de estoque de 100% deve ser diluída a 70% usando meio RPMI (ou seja, 7 mL de solução de gradiente de densidade isotônica de estoque a 100% e 3 mL de meio RPMI bem misturado). Além disso, a criação de uma camada limpa e não perturbada de 70% é essencial para a remoção de detritos de mielina e para a obtenção de suspensões unicelulares puras na interface gradiente após centrifugação.
    10. Centrifugar a 800 x g por 30 min a 4 °C sem freio. Aspirar o sobrenadante, incluindo a camada de debris de mielina até que 2–3 mL permaneçam no tubo, tomando cuidado para não perturbar a camada celular. Colher a camada celular entre o gradiente de densidade de 30/70% usando uma pipeta de 1 mL e transferir para um novo tubo cônico de 15 mL.
    11. Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, adicione o meio RPMI 10% FCS para trazer o volume final para 15 mL. Centrifugar 450 x g durante 5 min a 4 °C.
      Observação : durante esta etapa, camadas de célula de dois tubos podem ser agrupadas, se necessário. Não junte mais de dois tubos ou as células não serão granuladas devido a uma concentração de meio de gradiente de alta densidade.
    12. Aspirar o sobrenadante cuidadosamente para não perturbar o pellet celular. Ressuspender as células em um volume/tampão apropriado para contar as células usando um hemocitômetro (por exemplo, ressuspender uma única medula espinhal em 250 μL de tampão FACS para coloração da superfície a jusante) (Figura 3).
    13. Usando uma pipeta de 1 mL, transfira as suspensões celulares para a parte superior de um tubo superior do filtro (Tabela de Materiais) e permita que as células filtrem para o fundo do tubo para remover quaisquer detritos de mielina restantes.
    14. Usando o corante de exclusão azul de tripano, diluir e contar as células em um hemocitômetro com uma média de pelo menos duas grades de 16 quadrados para precisão40,41.
    15. Prossiga com a técnica de análise de célula única desejada.
      NOTA: Usando várias formas de colagenase (i.e., D, tipo I, tipo II, tipo IV), células imunes, micróglia (Figura 3), astrócitos, pericitos, células endoteliais49 e neurônios50 podem ser eficientemente isolados. As contagens de células nucleadas obtidas para os resultados foram as seguintes usando a enzima colagenase I titulada: Cérebro inteiro tratado com simulação = 500.000–600.000 células; Cérebro inteiro de DTI-TMEV = 800.000–1.000.000 células; Medula espinhal toda tratada com simulação = 150.000–200.000 células; Medula espinhal total de DTI-TMEV = 300.000–400.000. As contagens de células variam dependendo da precisão da coleta, do processamento e da presença de inflamação do SNC.

Resultados

Este experimento representativo teve como objetivo quantificar as células B e T e descrever a localização das células B e T nos compartimentos meníngeo e parenquimatoso do SNC em condições homeostáticas, bem como em um modelo murino de EM progressiva (i.e., IDD-TMEV). O DDI-TMEV foi induzido em camundongos SJL fêmeas com 5 semanas de idade por infecção intracraniana com 5 x 106 unidades formadoras de placa (UFP) de TMEV BeAn, conforme descrito anteriormente29.

Discussão

Métodos para avaliar a composição celular no compartimento do SNC durante a homeostase e a doença são essenciais para a compreensão dos estados fisiológicos e patológicos do SNC. No entanto, apesar de servir como uma barreira importante no SNC e abrigar uma gama diversificada de células imunes, as meninges são frequentemente omitidas da análise porque muitos métodos convencionais de extração de tecidos para o cérebro e a medula espinhal não permitem a coleta dessas membranas. Essa omissão é uma limitaç...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Os autores agradecem à equipe do Centro de Medicina Comparada e Pesquisa (CCMR) em Dartmouth por seu cuidado especializado com os camundongos usados para esses estudos. O Bornstein Research Fund financiou esta pesquisa.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Aluminum foilanyN/A
Bovine Serum AlbuminThermoFisher Scientific37002D
CentrifugeBeckman CoulterAllegra X-12R centrifuge
Collagenase IWorthingtonLS004196
Conical tube, 15 mLVWR525-1069
Conical tube, 50 mLVWR89039-658
Cover glassHauser Scientific5000
CryomoldVWR18000-128
Curved forcepsFine Science Tools11003-14
Disposable polystyrene tube, 14 mLFisher Scientific14-959-1B
Disposable ScalpelFisher ScientificNC0595256
DNAse IWorthingtonLS002139
Dry iceAirgasN/A
Durmont #7ForcepsFine Science Tools11271-30
EDTA disodium salt dihydrateAmresco0105-500g
Ethanol, 100%anyN/A
Fetal Bovine Serum (FBS)HycloneSH30910.03
Filter top tube, 5 mLVWR352235
Fixable viability stain 780Becton Dickinson565388
Flow cytometerBeckman CoulterGallios
GlucoseFisher ChemicalD16-500
Goat anti-mouse IgG (488 conjugate)Jackson immunoresearch115-546-146
Goat anti-mouse IgG (594 conjugate)Jackson immunoresearch115-586-146
Goat anti-rabbit 488Jackson immunoresearch111-545-144
Goat anti-rat 594Jackson immunoresearch112-585-167
Goat anti-rat 650Jackson immunoresearch112-605-167
Hank's Balnced Salt Solution (HBSS)Corning21-020-CV
HemacytometerAndwin Scientific02-671-51B
HemostatFine Science Tools13004-14
HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid)ThermoFisher Scientific15630080
KClFisher chemicalBP366-500
KH2PO4 (anhydrous)Sigma AldrichP5655-100G
Liquid NitrogenAirgasN/A
Mouse FC block (CD16/32)Becton Dickinson553141
Na2HP04 (anhydrous)Fisher ChemicalS374-500
NaClFisher chemicalS671-500
Needle, 25 gaugeBecton Dickinson305122
Normal mouse serumThermoFisher Scientific31881
Nylon mesh strainerVWR352350
OCTSakura4583
Paraformaldehyde, 20%Electron Microscopy Sciences15713-SDiluted to 4% using 1 x PBS
Pasteur pipette, 9 inch, unpluggedFisher Scientific13-678-20C
PBS (1x)Corning21-040-CV
PE Rat Anti-Mouse CD4Becton Dickinson553730
PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19Becton Dickinson562329
Percoll density gradient mediaGE healthcare17-0891-01
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45Becton Dickinson550994
Petri dish, 100 mmVWR353003
pH meterFisher Scientific13-636-AB150
Pipet-AidDrummond Scientific Corporation4-000-101
Pipette 200 µlGilsonFA10005M
Pipette tips, 1 mLUSA Scientific1111-2831
Pipette tips, 200 µlUSA Scientific1111-1816
Pipette, 1 mLGilsonFA10006M
Prolong Diamond mountant with DAPIThermoFisher ScientificP36962
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32Becton Dickinson553141
Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone)Abcamab16669
Rabbit anti-mouse lamininAbcamab11575
Rat anti-mouse ERT-R7Abcamab51824
RPMI 1640Corning10-040-CV
Serological pipet, 1 mLVWR357521
Serological pipet, 10 mLVWR357551
Serological pipet, 5 mLVWR357543
Sodium hydroxideFisher ScientificS318-100
SucroseFisher chemicalS5-500
Surgical scissorsFine Science Tools14001-16
Surgical scissors, extra fineRobozRS-5882
Syringe, 10 mLBecton Dickinson302995
Syringe, 5 mLBecton Dickinson309646
Trypan blueGibco15250-061
Vacuum filter systemMillipore20207749
Vacuum flaskThomas Scientific5340-2L
Vacuum in-line filterPall Corporation4402
Vacuum lineCole PalmerEW-06414-20
Water bathThermoFisher ScientificVersa bath

Referências

  1. Mastorakos, P., McGavern, D. The anatomy and immunology of vasculature in the central nervous system. Science Immunology. 4 (37), 0492 (2019).
  2. Carson, M. J., Doose, J. M., Melchior, B., Schmid, C. D., Ploix, C. C. CNS immune privilege: hiding in plain sight. Immunological Reviews. 213, 48-65 (2006).
  3. Rua, R., McGavern, D. B. Advances in Meningeal Immunity. Trends in Molecular Medicine. 24 (6), 542-559 (2018).
  4. Greene, H. S. The transplantation of tumors to the brains of heterologous species. Cancer Research. 11 (7), 529-534 (1951).
  5. Murphy, J. B., Sturm, E. Conditions determining the transplantability of tissues in the brain. Journal of Experimental Medicine. 38 (2), 183-197 (1923).
  6. Louveau, A., Harris, T. H., Kipnis, J. Revisiting the Mechanisms of CNS Immune Privilege. Trends in Immunology. 36 (10), 569-577 (2015).
  7. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the CNS in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  8. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  9. Korin, B., et al. High-dimensional, single-cell characterization of the brain's immune compartment. Nature Neuroscience. 20 (9), 1300-1309 (2017).
  10. Walker-Caulfield, M. E., Hatfield, J. K., Brown, M. A. Dynamic changes in meningeal inflammation correspond to clinical exacerbations in a murine model of relapsing-remitting multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology. 278, 112-122 (2015).
  11. Gadani, S. P., Smirnov, I., Smith, A. T., Overall, C. C., Kipnis, J. Characterization of meningeal type 2 innate lymphocytes and their response to CNS injury. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 285-296 (2017).
  12. Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. Journal of Experimental Medicine. 212 (7), 991-999 (2015).
  13. Li, J., Zhou, J., Shi, Y. Scanning electron microscopy of human cerebral meningeal stomata. Annals of Anatomy. 178 (3), 259-261 (1996).
  14. Louveau, A., et al. CNS lymphatic drainage and neuroinflammation are regulated by meningeal lymphatic vasculature. Nature Neuroscience. 21 (10), 1380-1391 (2018).
  15. Choi, S. R., et al. Meningeal inflammation plays a role in the pathology of primary progressive multiple sclerosis. Brain. 135, 2925-2937 (2012).
  16. Howell, O. W., et al. Meningeal inflammation is widespread and linked to cortical pathology in multiple sclerosis. Brain. 134, 2755-2771 (2011).
  17. Kooi, E. J., Geurts, J. J., van Horssen, J., Bo, L., van der Valk, P. Meningeal inflammation is not associated with cortical demyelination in chronic multiple sclerosis. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 68 (9), 1021-1028 (2009).
  18. Lucchinetti, C. F., et al. Inflammatory cortical demyelination in early multiple sclerosis. New England Journal of Medicine. 365 (23), 2188-2197 (2011).
  19. Magliozzi, R., et al. A Gradient of neuronal loss and meningeal inflammation in multiple sclerosis. Annals of Neurology. 68 (4), 477-493 (2010).
  20. Arac, A., et al. Evidence that meningeal mast cells can worsen stroke pathology in mice. American Journal of Pathology. 184 (9), 2493-2504 (2014).
  21. Benakis, C., et al. Commensal microbiota affects ischemic stroke outcome by regulating intestinal gammadelta T cells. Nature Medicine. 22 (5), 516-523 (2016).
  22. Roth, T. L., et al. Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury. Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).
  23. Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
  24. Schain, A. J., et al. Activation of pial and dural macrophages and dendritic cells by cortical spreading depression. Annals of Neurology. 83 (3), 508-521 (2018).
  25. Azevedo, R. S. S., et al. In situ immune response and mechanisms of cell damage in central nervous system of fatal cases microcephaly by Zika virus. Scientific Reports. 8 (1), 1 (2018).
  26. Coles, J. A., et al. Intravital imaging of a massive lymphocyte response in the cortical dura of mice after peripheral infection by trypanosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (4), 0003714 (2015).
  27. Kang, S. S., McGavern, D. B. Lymphocytic choriomeningitis infection of the central nervous system. Frontiers in Bioscience. 13, 4529-4543 (2008).
  28. DiSano, K. D., Stohlman, S. A., Bergmann, C. C. Activated GL7(+) B cells are maintained within the inflamed CNS in the absence of follicle formation during viral encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 60, 71-83 (2017).
  29. DiSano, K. D., R, D. B., Gilli, F., Pachner, A. R. Central Nervous System Inflammatory Aggregates in the Theiler's Virus Model of Progressive Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
  30. Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. Journal of Histotechnology. 36 (3), 86-91 (2013).
  31. Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (119), e55226 (2017).
  32. Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis. Current Protocols in Immunology. 121 (1), 44 (2018).
  33. Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension. Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).
  34. Cao, Y., et al. An optimized assay for the enumeration of antigen-specific memory B cells in different compartments of the human body. Journal of Immunological Methods. 358 (1-2), 56-65 (2010).
  35. Wykes, M. N., Renia, L. ELISPOT Assay to Measure Peptide-specific IFN-γ Production. Bio-Protocol. 7 (11), (2017).
  36. Gjurich, B. N., Taghavie-Moghadam, P. L., Galkina, E. V. Flow Cytometric Analysis of Immune Cells Within Murine Aorta. Methods in Molecular Biology. 1339, 161-175 (2015).
  37. Laboissonniere, L. A., Sonoda, T., Lee, S. K., Trimarchi, J. M., Schmidt, T. M. Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells. Journal of Visualized Experiments. (123), e55229 (2017).
  38. Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. Journal of Visualized Experiments. (4), 198 (2007).
  39. McGowan, J. W., Bidwell, G. L. The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules. Journal of Visualized Experiments. (118), e54987 (2016).
  40. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count cells. Journal of Visualized Experiments Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2019)
  41. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. , e752 (2008).
  42. Hatfield, J. K., Brown, M. A. Group 3 innate lymphoid cells accumulate and exhibit disease-induced activation in the meninges in EAE. Cellular Immunology. 297 (2), 69-79 (2015).
  43. Molina Estevez, F. J., Mathews, T. D., Biffi, A., Peviani, M. Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods. Journal of Visualized Experiments. (153), e752 (2019).
  44. Herz, J., Louveau, A., Da Mesquita, S., Kipnis, J. Morphological and Functional Analysis of CNS-Associated Lymphatics. Methods in Molecular Biology. 1846, 141-151 (2018).
  45. Kwong, B., et al. T-bet-dependent NKp46(+) innate lymphoid cells regulate the onset of TH17-induced neuroinflammation. Nature Immunology. 18 (10), 1117-1127 (2017).
  46. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
  47. Nurkhametova, D., et al. Activation of P2X7 Receptors in Peritoneal and Meningeal Mast Cells Detected by Uptake of Organic Dyes: Possible Purinergic Triggers of Neuroinflammation in Meninges. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 45 (2019).
  48. Van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
  49. Czupalla, C. J., Yousef, H., Wyss-Coray, T., Butcher, E. C. Collagenase-based Single Cell Isolation of Primary Murine Brain Endothelial Cells Using Flow Cytometry. Bio-Protocol. 8 (22), 3092 (2018).
  50. Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons. Methods in Molecular Biology. 1656, 229-251 (2017).
  51. Eriksdotter-Nilsson, M., Björklund, H., Olson, L. Laminin immunohistochemistry: a simple method to visualize and quantitate vascular structures in the mammalian brain. Journal of Neuroscience Methods. 17 (4), 275-286 (1986).
  52. Cha, J. H., et al. Prompt meningeal reconstruction mediated by oxygen-sensitive AKAP12 scaffolding protein after central nervous system injury. Nature Communications. 5, 4952 (2014).
  53. Van Vliet, E., Melis, M., Foidart, J. M., Van Ewijk, W. Reticular fibroblasts in peripheral lymphoid organs identified by a monoclonal antibody. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (7), 883-890 (1986).
  54. Louveau, A., Filiano, A. J., Kipnis, J. Meningeal whole mount preparation and characterization of neural cells by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. 121 (1), (2018).
  55. Derecki, N., J, K. Mouse meninges isolation for FACS. Protocol Exchange. , (2014).
  56. Hedley, B. D., Keeney, M. Technical issues: flow cytometry and rare event analysis. International Journal of Laboratory Hematology. 35 (3), 344-350 (2013).

Reimpressões e Permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE

Solicitar Permissão

Explore Mais Artigos

Imunologia e Infec oEdi o 159meningessistema nervoso centraldescalcifica oimunohistoqu micasuspens o unicelularc lulas imunescamundongos

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Entre em contato

recomende à biblioteca

Newsletter

Pesquisa

Educação

Autores

Bibliotecários

SOBRE A JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados