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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

In dieser Arbeit werden zwei optimierte Protokolle für die Untersuchung von residenten und peripher abgeleiteten Immunzellen innerhalb des zentralen Nervensystems, einschließlich des Gehirns, des Rückenmarks und der Hirnhäute, vorgestellt. Jedes dieser Protokolle trägt dazu bei, die Funktion und Zusammensetzung der Zellen zu bestimmen, die diese Kompartimente unter stationären und entzündlichen Bedingungen besetzen.

Zusammenfassung

Das zentrale Nervensystem (ZNS) besteht aus Gehirn und Rückenmark und wird von den Hirnhäuten umhüllt, membranösen Schichten, die als Barriere zwischen der Peripherie und dem ZNS dienen. Das ZNS ist eine immunologisch spezialisierte Stelle, und unter stationären Bedingungen ist das Immunprivileg im ZNS-Parenchym am deutlichsten. Im Gegensatz dazu beherbergen die Hirnhäute eine Vielzahl von residenten Zellen, darunter angeborene und adaptive Immunzellen. Bei entzündlichen Erkrankungen, die durch ZNS-Verletzungen, Autoimmunitäten, Infektionen oder sogar Neurodegeneration ausgelöst werden, können peripher gewonnene Immunzellen in das Parenchym eindringen und sich in den Hirnhäuten einnisten. Es wird angenommen, dass diese Zellen während der Pathogenese der ZNS-Erkrankung sowohl nützliche als auch schädliche Wirkungen ausüben. Trotz dieses Wissens werden die Hirnhäute bei der Analyse des ZNS-Kompartiments oft übersehen, da herkömmliche ZNS-Gewebeextraktionsmethoden die Hirnhautschichten auslassen. Dieses Protokoll stellt zwei unterschiedliche Methoden für die schnelle Isolierung von murinem ZNS-Gewebe (d. h. Gehirn, Rückenmark und Hirnhäute) vor, die für die nachgeschaltete Analyse mittels Einzelzelltechniken, Immunhistochemie und In-situ-Hybridisierungsmethoden geeignet sind. Die beschriebenen Methoden bieten eine umfassende Analyse von ZNS-Geweben, ideal für die Beurteilung des Phänotyps, der Funktion und der Lokalisation von Zellen, die das ZNS-Kompartiment unter homöostatischen Bedingungen und während der Krankheitspathogenese besetzen.

Einleitung

Das Zentralnervensystem (ZNS) ist ein immunologisch spezialisiertes Zentrum. Das ZNS-Parenchym, mit Ausnahme des Liquorraums, der Hirnhäute und des Gefäßsystems, wird klassischerweise als immunprivilegierte Stelle angesehen 1,2,3,4,5 und ist unter homöostatischen Bedingungen relativ frei von Immunzellen 2,6,7. Im Gegensatz dazu sind die Hirnhäute, bestehend aus Dura-, Arachnoidal- und Pia-Schichten, entscheidende Bestandteile des ZNS-Kompartiments und nehmen aktiv an der homöostatischen Immunüberwachung und an Entzündungsprozessen während der Krankheitspathogenese teil 3,6,7,8. Unter stationären Bedingungen unterstützen die Hirnhäute zahlreiche Immunwächterzellen, darunter angeborene lymphatische Zellen (ILC), Makrophagen, dendritische Zellen (DC), Mastzellen, T-Zellen und in geringerem Maße B-Zellen 9,10,11.

Die Hirnhäute sind stark vaskularisierte Strukturen und enthalten Lymphgefäße, die eine lymphatische Verbindung zwischen dem ZNS und seiner Peripherie herstellen 8,12,13,14. Bei entzündlichen Erkrankungen, die durch ZNS-Verletzungen, Infektionen, Autoimmunität oder sogar Neurodegeneration hervorgerufen werden, infiltrieren peripher gewonnene Immunzellen das Parenchym und verändern die Immunlandschaft innerhalb der Hirnhäute. Nach der Zellinfiltration können die Hirnhäute eine funktionelle Nische für peripher gewonnene Immunzellen darstellen, die die Aggregation von Immunzellen, die lokale Aktivierung von Immunzellen und das langfristige Überleben im ZNS-Kompartiment fördern. Eine ausgeprägte meningeale Entzündung wird bei mehreren Erkrankungen des ZNS beobachtet, darunter Multiple Sklerose (MS)15,16,17,18,19, Schlaganfall 20,21, sterile Verletzung 22,23 (d. h. Rückenmarksverletzung und Schädel-Hirn-Trauma), Migräne 24 und mikrobielle Infektion 25,26.27,28,29. Daher ist die Charakterisierung von residenten Zellen und peripher abgeleiteten Immunzellen im meningealen Kompartiment essentiell für das Verständnis der Rolle dieser Zellen unter stationären Bedingungen und der Krankheitspathogenese.

Die Entnahme von Gehirn, Rückenmark und Hirnhäuten aus Schädel und Wirbelkörpern ist technisch anspruchsvoll und zeitaufwendig. Derzeit gibt es keine Techniken für die schnelle Entnahme des Gehirns, bei dem alle drei Hirnhautschichten intakt sind. Während die Laminektomie eine hervorragende Morphologie des Rückenmarksgewebes ergibt und die Hirnhautschichten erhält, ist sie sowohl extrem zeitaufwändig als auch kompliziert30,31. Umgekehrt erleichtern konventionellere Extraktionsmethoden wie die Entfernung des Gehirns aus dem Schädel und die hydraulische Extrusion des Rückenmarks die schnelle Entnahme des ZNS-Gewebes, aber sowohl die Arachnoidal- als auch die Duralhirnhäute gehen bei diesen Techniken verloren30,31. Der Verzicht auf Dura- und Arachnoidalschichten bei der konventionellen Isolierung von Hirn- und Rückenmarksgewebe führt zu einer unvollständigen Analyse der Zellen innerhalb des ZNS-Kompartiments. Daher ist die Identifizierung neuer Techniken, die sich auf die schnelle Extraktion von ZNS-Gewebe mit intakten Hirnhäuten konzentrieren, entscheidend für die optimale Analyse des ZNS-Kompartiments.

In diesem Manuskript werden zwei Methoden zur schnellen Extraktion von Gehirn, Rückenmark und Hirnhäuten aus Mäusen vorgestellt, die die nachgeschaltete Analyse von residenten Zellen und peripher abgeleiteten Immunzellen im ZNS-Parenchym und in den Hirnhäuten erleichtern. Diese optimierten Protokolle konzentrieren sich auf 1) die Isolierung von Einzelzellsuspensionen für die nachgelagerte Analyse und 2) die Vorbereitung des Gewebes für die histologische Verarbeitung. Die Gewinnung von Einzelzellsuspensionen aus dem Gehirn, dem Rückenmarksgewebe und den Dural- und Arachnoidalmenhäuten32 ermöglicht die gleichzeitige Analyse von Zellen, die sich sowohl im Parenchym- als auch im Meningealkompartiment befinden. Einzelzellsuspensionen können in verschiedenen Anwendungen eingesetzt werden, darunter Zellkulturassays zur Durchführung von In-vitro-Stimulation 33, Enzyme-Linked Immunospot (ELISpot)28,34,35, Durchflusszytometrie 36,33 und Einzelzell- 37 oder Bulk-Transkriptomik. Darüber hinaus ermöglicht das optimierte Protokoll zur Entkalkung ganzer Gehirne und Rückenmarks mit intakten Schädeln bzw. Wirbelsäulen eine schonende Entkalkung des umgebenden Knochens, wobei die Hirnhäute intakt bleiben und die Gewebemorphologie erhalten bleibt. Diese Methode ermöglicht die selektive Identifizierung von Proteinen oder RNA mittels Immunhistochemie (IHC) oder In-situ-Hybridisierung (ISH) sowohl im Parenchym- als auch im Meningealraum. Die Charakterisierung des Phänotyps, des Aktivierungszustands und der Lokalisation von residenten Zellen und peripher abgeleiteten Immunzellen innerhalb des ZNS kann Informationen liefern, die für das Verständnis unerlässlich sind, wie einzelne Zelltypen im ZNS-Kompartiment zur Homöostase und Krankheitspathogenese beitragen.

Protokoll

Für die gesamte Tierarbeit werden Protokolle verwendet, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Geisel School of Medicine in Dartmouth überprüft und genehmigt wurden.

1. Aufbereitung von Hirn- und Rückenmarksproben zur Entkalkung

  1. Isolierung von Gehirn- und Rückenmarksproben
    1. Euthanasie der Maus durch CO2 - Inhalation. Stellen Sie sicher, dass die CO2 - Durchflussmenge 10 % bis 30 % des Käfigvolumens pro Minute verdrängt.
    2. Heben Sie mit einer Pinzette den Processus xiphoideus an und schneiden Sie die Bauchdecke seitlich direkt unter dem Brustkorb mit einer Schere nach oben, um zu vermeiden, dass darunter liegende Blutgefäße oder Organe durchtrennt werden. Schneiden Sie seitlich durch das Zwerchfell.
    3. Schneiden Sie den Brustkorb entlang der seitlichen Ränder parallel zur Lunge bis zum Schlüsselbein. Heben Sie das Brustbein mit einer Pinzette an und klemmen Sie das Brustbein mit einem Hämostaten. Legen Sie das Hämostat über den Kopf, um den Brustkorb wegzuheben und das Herz freizulegen.
    4. Greife das Herz mit einer Zange in der Nähe seiner Spitze und mache einen Schnitt im rechten Vorhof des Herzens, um einen Auslass zu schaffen. Führen Sie eine 25-g-Nadel mit einer 10-ml-Spritze ein, um langsam 10 ml eiskalte 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in die linke Herzkammer zu verabreichen, um die Maus transkardial zu perfundieren.
      HINWEIS: Die Perfusion sollte über 4–5 Minuten erfolgen, bis die Leber von Blut befreit ist. Insgesamt 10 ml 1x PBS reichen in der Regel für die Durchblutung aus, aber bei Bedarf kann auch mehr verwendet werden. Eine reine Leber deutet in der Regel auf eine ausreichende Durchblutung hin.
    5. Entfernen Sie den Kopf mit einer scharfen Schere durch Enthauptung (Abbildung 1; 1). Machen Sie einen Mittellinienschnitt in der Haut (Abbildung 1; 2) und drehen Sie die Haut über die Augen, um den Schädel zu befreien.
    6. Durchtrennen Sie das Nasenbein, um den Unterkiefer vom Schädel zu lösen (Abbildung 1; 3). Entferne den Unterkiefer, die Zunge und die Augen. Schneiden Sie entlang der lateralen Aspekte des Schädels, um das Gewebe entlang des äußeren Gehörgangs freizusetzen (Abbildung 1; 4). Trimmen, um alle überschüssige Haut, Muskeln und Gewebe zu entfernen, die den Schädel überlagern.
    7. Trennen Sie den Brustkorb von der Wirbelsäule, indem Sie mit einer scharfen Schere parallel zur Wirbelsäule schneiden (Abbildung 1; 5 und 6). Machen Sie einen kleinen Schnitt im unteren Lendenwirbelbereich, um die Wirbelsäule zu isolieren (Abbildung 1; 7). Trimmen und entfernen Sie alle verbleibenden Muskeln entlang der Wirbelsäule, um die Wirbel freizulegen (Abbildung 1; 8).
      HINWEIS: Die Entfernung von überschüssigem Gewebe aus der Wirbelsäule und dem Schädel ist notwendig, um eine ausreichende Penetration von fixierendem Paraformaldehyd (PFA) und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Entkalkungspuffer zu erreichen.
  2. Nachfixierung, Entkalkung und Kryokonservierung
    1. Legen Sie das Gehirn mit einer Pinzette mit dem intakten Schädel oder der Wirbelsäule in ein konisches 15-ml-Röhrchen, das 10 ml 4% PFA enthält. Platzieren Sie die Röhrchen mindestens 48 Stunden lang bei 4 °C, um eine ausreichende Fixierung zu gewährleisten.
      HINWEIS: Um eine Überfixierung des Gewebes zu vermeiden, überschreiten Sie nicht die Fixierung von 72 Stunden. Die Fixierungszeiten verlängern sich bei Knochenproben vor der Entkalkung. Eine ausreichende Fixierung schützt das Gewebe vor den Auswirkungen der Entkalkung und sorgt für eine bessere Gewebemorphologie.
    2. Spülen Sie das Gehirn oder Rückenmark, indem Sie das Gewebe mit einer Pinzette aus dem 4%igen PFA entfernen und das Gewebe 5 Minuten lang in ein 14-ml-Einwegröhrchen mit 10 ml 1x PBS legen. Übertragen Sie das Gehirn oder Rückenmark in ein konisches 50-ml-Röhrchen mit 10 ml 10%igem EDTA (pH = 7,2–7,4).
      HINWEIS: Die Verwendung eines größeren Röhrchens mit 10 ml EDTA verleiht dem EDTA eine größere Kontaktfläche mit dem Gewebe und beschleunigt den Entkalkungsprozess.
    3. Prüfen Sie täglich, ob der Knochen weich und biegsam ist: Entfernen Sie das Gewebe mit einer Pinzette aus der EDTA-Lösung, legen Sie es auf eine Petrischale und testen Sie die Knochenweichheit vorsichtig mit einer 25-G-Nadel. Wenn die Nadel leicht in den Knochen eindringt, ist der Entkalkungsprozess abgeschlossen.
    4. Entfernen Sie das Gewebe aus der EDTA-Lösung und geben Sie das Gehirn oder Rückenmark in ein 14-ml-Einwegröhrchen, das 10 ml 1x PBS enthält, und waschen Sie es 10 Minuten lang. Wiederholen Sie den Waschgang.
      HINWEIS: Die Entkalkung dauert in der Regel 2-3 Tage. Die Lösung sollte alle 2–3 Tage gewechselt werden, wenn der Knochen noch nicht ausreichend entkalkt ist. Eine längere Inkubation in EDTA nach der Entkalkung des Knochens kann jedoch die Gewebemorphologie schädigen.
    5. Bereiten Sie 10 %, 20 % und 30 % Saccharoselösungen zu, indem Sie 1x PBS Saccharose hinzufügen. Für 10 % Saccharose fügen Sie beispielsweise 10 g Saccharose hinzu und bringen Sie das Volumen mit sterilem 1x PBS auf 100 ml. Lagern Sie die Lösung bis zu 1 Monat bei 4 °C.
      HINWEIS: Saccharoselösungen neigen zum Wachstum von Mikroorganismen, daher sollten Proben nicht über einen längeren Zeitraum in diesen Lösungen gelagert werden.
    6. Entnehmen Sie das Gewebe aus dem 1x PBS, legen Sie es in 10 ml 10%ige Saccharoselösung und lagern Sie es bei 4 °C. Lassen Sie das Gewebe 24 Stunden lang einwirken oder bis es auf den Boden des Röhrchens sinkt.
    7. Wiederholen Sie diesen Vorgang, indem Sie das Gewebe zuerst zu einer 20%igen Saccharoselösung und schließlich zu einer 30%igen Saccharoselösung bewegen. Lassen Sie das Gewebe in 30% Saccharose einsinken (mindestens 24 h) und fahren Sie mit der Gewebeeinbettung fort.
  3. Einbetten und Einfrieren von Gewebe
    1. Entfernen Sie mit einer Pinzette das Gewebe von der 30%igen Saccharose, legen Sie sie auf eine Petrischale und kippen Sie die Schale, um überschüssige Saccharoselösung auf dem Gewebe zu entfernen. Schneiden Sie das Gewebe mit einem Skalpell in die gewünschten Segmente.
    2. Stellen Sie eine dünne Schicht der OCT-Verbindung (Optimal Cutting Temperature) am Boden des Kryomolds her und legen Sie das/die Gewebestück(e) in die Form. Bedecken Sie das Gewebe vollständig mit der OCT-Verbindung und stellen Sie sicher, dass keine Blasen vorhanden sind.
    3. Frieren Sie die Blöcke schockgefrieren, indem Sie mit der Maus über flüssigen Stickstoff38 fahren oder die Blöcke auf eine 100%ige Isopropanol/Trockeneis-Aufschlämmung39 stellen, bis der Block undurchsichtig ist. Wickeln Sie die Kryoformen in Aluminiumfolie ein und lagern Sie die Blöcke bei -80 °C für eine langfristige Lagerung. Blöcke vor dem Trennen auf -20 °C stellen.
      HINWEIS: Beim Schneiden und Durchführen von histologischen Protokollen an entkalkten Gehirnen ist Vorsicht geboten, da die Schädel- und Hirnhautschichten bei grober Handhabung der Schnitte verloren gehen können.

2. Vorbereitung der Hirnhäute und des ZNS-Gewebes für die Durchflusszytometrie-Färbung

  1. Entnahme der Schädeldecke und des Gehirns
    1. Entfernen Sie den Kopf mit einer scharfen Schere durch Enthauptung (Abbildung 2A; 1). Machen Sie mit einer Schere einen Mittellinienschnitt in die Haut (Abbildung 2A; 2) und drehen Sie die Haut über die Augen, um den Schädel zu befreien.
    2. Platzieren Sie die Schere im Foramen magna und beginnen Sie, den Schädel seitlich entlang der Kortikalis in Richtung Riechkolben zu schneiden, wobei die Schnitte oberhalb des äußeren Gehörgangs und des Unterkiefers gehalten werden (Abbildung 2A; 3). Führen Sie die gleichen Schnitte auf der gegenüberliegenden Seite durch, wobei sich die Schnitte am Riechkolben treffen, um die Schädeldecke vom Gehirn zu befreien (Abbildung 2A; 3).
    3. Ziehen Sie die Schädelkappe mit einer Pinzette ab und legen Sie die Schädelkappe in ein konisches 15-ml-Röhrchen, das 5 ml kaltes RPMI-Medium enthält, ergänzt mit 25 mM HEPES. Halten Sie die Tube auf Eis.
    4. Platzieren Sie die Zange mit einer gebogenen Pinzette unter der Basis des Gehirns und heben Sie sie an, um das Gehirn von der Schädeldecke zu befreien. Legen Sie das Gehirn in ein konisches 15-ml-Röhrchen, das 5 ml kaltes RPMI enthält, ergänzt mit 25 mM HEPES. Halten Sie das Röhrchen bis zur Verarbeitung auf Eis.
  2. Entnahme des Wirbelsäulen- und Rückenmarksgewebes
    1. Trennen Sie mit einer Pinzette und einer scharfen Schere den Brustkorb von der Wirbelsäule, indem Sie parallel zur Wirbelsäule schneiden (Abbildung 2A; 4 und 5). Machen Sie einen kleinen Schnitt im unteren Lendenwirbelbereich, um die Wirbelsäule zu isolieren (Abbildung 2A; 6). Trimmen und entfernen Sie alle verbleibenden Muskeln entlang der Wirbelsäule, um die Wirbel freizulegen (Abbildung 2A; 7).
    2. Setzen Sie die extra feine chirurgische Schere in die Wirbelsäule ein und schneiden Sie entlang der seitlichen Kante der Wirbelsäule (Abbildung 2C). Schneiden Sie den gegenüberliegenden Seitenrand vollständig ab, um die Wirbelsäule in einen vorderen und einen hinteren Teil zu unterteilen.
      HINWEIS: Das Rückenmark bleibt mit der Wirbelsäule verbunden.
    3. Ziehen Sie mit einer Pinzette langsam und vorsichtig das Rückenmark von der Wirbelsäule ab und legen Sie das Gewebe in ein konisches 15-ml-Röhrchen, das 5 ml kaltes RPMI mit 25 mM HEPES enthält. Übertragen Sie den vorderen und hinteren Teil der Wirbelsäule in ein konisches 15-ml-Röhrchen, das 5 ml kaltes RPMI mit 25 mM HEPES enthält.
  3. Entfernung der Hirnhäute zur Herstellung von einzelligen Suspensionen
    1. Entferne die Schädeldecke mit einer Pinzette vom RPMI-Medium. Mit einer scharfen Pinzette (#7 Pinzette; Materialtabelle), um den äußeren Rand der Schädeldecke einritzen (Abbildung 2B) und die Hirnhäute vom Rand der Schädeldecke abziehen, indem sie die Dural- und Arachnoidalhäute entfernen. Die Hirnhäute auf eine Petrischale legen.
      HINWEIS: Die Entfernung der Hirnhäute aus dem Gehirn und dem Rückenmark erfordert Übung. Wenn der Benutzer Schwierigkeiten hat, die Hirnhäute zu extrahieren, verwenden Sie ein Präpariermikroskop, um die Entfernung zu unterstützen.
    2. Entfernen Sie die Wirbelsäule aus dem Tubus. Ritzen Sie mit einer scharfen Pinzette an den Rändern der Wirbelsäule ein, um die Hirnhäute zu befreien, und ziehen Sie die Hirnhäute mit einer gebogenen Zange vom Rand des Wirbels ab. Die Hirnhäute auf eine Petrischale legen.
    3. Legen Sie ein Nylongewebesieb in ein konisches 50-ml-Röhrchen. Legen Sie die Hirnhäute in das Sieb und fügen Sie 3 ml RPMI hinzu, ergänzt mit 25 mM HEPES. Zerkleinern Sie das Gewebe und das Medium mit dem Kolben einer 5-ml-Spritze durch das Sieb.
    4. Waschen Sie das Sieb mit einer serologischen 5-ml-Pipette mit zusätzlichen 2 bis 3 ml RPMI/HEPES-Medien, bis das gesamte sichtbare Gewebe durch das Sieb gedrungen ist.
      HINWEIS: Um eine ausreichende Zellzahl für die durchflusszytometrische Analyse zu erhalten, müssen möglicherweise Hirnhäute von mehreren Tieren zusammengefasst werden. In diesem Experiment (Abbildung 3 und Abbildung 4) wurden die Hirnhäute des Gehirns und des Rückenmarks von 4–5 Mäusen zusammengeführt. Wenn die Proben gepoolt werden, sind zusätzliche Medien erforderlich, um das Gewebe durch das Nylongewebesieb zu schleifen, um eine Überhitzung des Gewebes zu verhindern.
    5. Mit einer serologischen 10-ml-Pipette werden die Zellen und Medien in ein frisches konisches 15-ml-Röhrchen überführt. Waschen Sie das konische 50-ml-Röhrchen mit einer serologischen 10-ml-Pipette mit 5 ml Medium, um alle verbleibenden Zellen zu sammeln. Bei 450 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren, um die Zellen zu pelletieren.
    6. Mit einer Pasteurpipette mit Vakuum wird der Überstand abgesaugt, wobei darauf geachtet wird, das Zellpellet zu vermeiden, und die Zellen in einem geeigneten Volumen und Puffer resuspendiert.
    7. Um die Einzelzellsuspension zu zählen, wird ein kleines Volumen der Zellen (d. h. 5–10 μl) mit Trypanblau-Ausschlussfarbstoff (1:10-Verdünnung) und RPMI verdünnt. Geben Sie 10 μl der Verdünnung in das Hämozytometer.
    8. Zählen Sie die Zellen wie zuvor beschrieben40,41 und bilden Sie den Durchschnitt von mindestens zwei 16-Quadrat-Gittern, um die Genauigkeit zu erhöhen.
      HINWEIS: In Abbildung 3 wurden z. B. gepoolte, pelletierte Zellen aus den Hirnhäuten in 250 μl Puffer für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) (1x PBS mit 1 % FBS) für die nachgeschaltete Oberflächenfärbung resuspendiert. Die Zellen wurden für die Zählung 1:10 verdünnt (5 μl Zellen, 5 μl Trypanblau, 40 μl RPMI). Diese Verdünnung ergab zwischen 50 und 100 Zellen pro 16 Quadratraster, was eine genauere Zellzählung gewährleistet, da die Zellen weder zu dicht und überlappend noch zu dünn sind. Die Anzahl der kernhaltigen Zellen aus gepoolten Hirn- und Rückenmark-Hirnhäuten pro Maus war wie folgt: Für Hirnhäute von Scheinbehandlungsmäusen = 100.000–150.000 Zellen und für Hirnhäute von Mäusen der murinen Enzephalomyelitis-Virus-induzierten demyelinisierenden Krankheit (TMEV-IDD) = 300.000–350.000 Zellen. Die Zellzahl variiert je nach Präzision der Entnahme, Verarbeitung und ob eine meningeale Entzündung vorliegt.
    9. Fahren Sie mit der gewünschten Einzelzelltechnik fort, wie z. B. einer FACS-Oberfläche (Abbildung 3)14,36,42,43,44, intrazellulären Färbeprotokollen 33,45, In-vitro-Stimulation, Zellkultur-Assays 33,46,47, ELISPOT-Assay 28,34,35 und Bulk- oder Einzelzell-Assays Transkriptomik37,48.
      HINWEIS: Halten Sie alle Röhrchen zwischen den Verarbeitungsschritten auf Eis.
  4. Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus Hirn- und Rückenmarksgewebe
    1. Übertragen Sie das Gehirn oder Rückenmarksgewebe mit Medien auf die Oberseite der 100-mm-Petrischale, indem Sie das Gewebe und die Medien aus dem Röhrchen gießen. Bewegen Sie das Gewebe mit einer Pinzette auf den Boden der Petrischale. Zerkleinern Sie das Gehirn oder Rückenmark mit einer sterilen Rasierklinge. Bewegen Sie das Hackfleisch mit der Rasierklinge auf den Boden der Platte, indem Sie es abkratzen, um das Gewebe zu sammeln.
      HINWEIS: Für das unten stehende enzymatische Verdauungsprotokoll können bis zu zwei Rückenmarks zur Verarbeitung zusammengefasst werden. Gehirne sollten einzeln verarbeitet werden.
    2. Geben Sie mit einer serologischen 5-ml-Pipette 3 ml RPMI, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FCS), in die Petrischale. Pipettieren Sie mit einer serologischen 10-ml-Pipette auf und ab, um das Gewebe im Medium zu resuspendieren und in ein konisches 15-ml-Röhrchen zu übertragen.
      HINWEIS: Wenn es sich bei der Downstream-Anwendung um Einzelzell- oder Massen-RNA-Sequenzierungsanalysen oder Zellkulturen handelt, sollten FCS-Chargen getestet werden, um sicherzustellen, dass die Zellen vor der Analyse nicht aktiviert werden. Alternativ können die Zellen mit 1x PBS mit 0,04 % BSA anstelle von RPMI mit 10 % FCS verarbeitet werden.
    3. Waschen Sie die Petrischale mit einer serologischen 10-ml-Pipette mit zusätzlichen 2 ml Medium, um Restgewebe zu sammeln, und geben Sie sie in ein konisches Röhrchen, um ein Gesamtvolumen von 5 ml zu erhalten. Halten Sie die Röhrchen zwischen den Verarbeitungsschritten auf Eis.
    4. Resuspendieren Sie das Kollagenase-I-Pulver mit einer Pipette in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)-Medien, um die gewünschte Konzentration (d. h. 100 mg/ml) zu erhalten. Kollagenase Typ I in das konische Röhrchen mit der zerkleinerten Gewebeprobe geben, um die gewünschte Endkonzentration zu erhalten (d. h. 50 μl für 1 mg/ml).
      HINWEIS: Höhere Konzentrationen von Kollagenase erhöhen die Zellausbeute, können aber Zelloberflächenmarker spalten. Daher sollten Kollagenase-I-Chargen titriert werden, um die optimale Konzentration zu bestimmen, die erforderlich ist, um die höchste Anzahl lebensfähiger Zellen mit allen erforderlichen Zelloberflächenmarkern zu erhalten. Zum Beispiel wurde Kollagenase I in Endkonzentrationen von 0,5 mg/ml, 1 mg/ml und 2 mg/ml an einzelnen Gehirn- oder Rückenmarkproben getestet. Die Zellviabilität wurde mit der Trypanblau-Ausschlussmethode bestimmt und die Zelloberflächenmarker CD45, CD19 und CD4 wurden mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Eine Konzentration von 1 mg/ml Kollagenase I ergab die höchste Anzahl lebender Zellen unter Beibehaltung aller interessierenden Zelloberflächenmarker. Daher wurde diese Konzentration für weitere Experimente zur Untersuchung dieser Zelltypen verwendet.
    5. DNase I-Pulver vorsichtig mit 0,15 M Natriumchlorid auf die gewünschte Stammkonzentration resuspendieren. Die resuspendierte DNase I wird in das konische Röhrchen mit der zerkleinerten Gewebeprobe gegeben, um eine Endkonzentration von 20 U/ml zu erhalten.
      HINWEIS: DNase I-Chargen variieren je nach Aktivitätseinheiten pro ml. Die Konzentration, die der Gewebeprobe zugesetzt werden soll, ändert sich basierend auf den Aktivitätseinheiten des Stammfläschchens pro Milliliter. Die endgültige gewünschte Konzentration pro Probe beträgt 20 U/ml.
    6. Die Röhrchen in ein Röhrchengestell in ein 37 °C warmes Wasserbad geben und 40 Minuten inkubieren. Drehen Sie die Röhrchen alle 15 Minuten um, um das Gewebe gründlich mit den Enzymen zu vermischen. Nach der Inkubation werden 500 μl 0,1 M EDTA (pH = 7,2) in jedes Röhrchen gegeben, um eine Endkonzentration von 0,01 M EDTA zu erreichen, und weitere 5 Minuten inkubieren, um die Kollagenase zu inaktivieren.
    7. Geben Sie mit einer serologischen 10-ml-Pipette 9 ml RPMI, ergänzt mit 10 % FCS, in jedes Röhrchen, um das Volumen jedes Röhrchens auf ~14,5 ml zu bringen. Bei 450 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Saugen Sie mit einer Pasteurpipette mit Vakuum den Überstand an und achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu berühren.
    8. Geben Sie mit einer serologischen 5-ml-Pipette 3 ml 100%ige isotonische Dichtegradientenlösung in das Röhrchen mit dem Zellpellet. Fügen Sie mit einer serologischen 10-ml-Pipette zusätzliche RPMI-10%ige FCS-Medien hinzu, um das Endvolumen auf 10 ml zu bringen, und resuspendieren Sie das Zellpellet, um eine 30%ige isotonische Dichtegradientenlösungsschicht zu erzeugen.
      HINWEIS: Bereiten Sie das isotonische Dichtegradientenmedium zu 100 % im Voraus aliquot vor und lagern Sie es bis zu 3 Monate lang bei 4 °C. Zur Herstellung der 100%igen isotonischen Dichtegradientenlösung wird das Dichtegradientenmedium (Materialtabelle) mit dem Verdünnungspuffer des Dichtegradientenmediums verdünnt. Den Verdünnungspuffer für Dichtegradientenmedien (80,0 g/L NaCl, 3,0 g/L KCl; 0,73 g/L Na2 HP04, 0,20 g/L KH2HP04; 20,0 g/L Glukose) vorbereiten und mit einem Vakuumfiltersystem sterilisieren. Stellen Sie die 100%ige isotonische Dichtegradientenlösung her, indem Sie 1 Teil Dichtegradientenverdünnungspuffer und 9 Teile Dichtegradientenmedien mischen. Gut mischen.
    9. Invertieren und mischen Sie jedes Röhrchen gut, bevor Sie die 70%ige isotonische Dichtegradientenunterlage hinzufügen. Führen Sie eine serologische Pipette mit 1 ml 70%iger isotonischer Dichtegradientenlösung in den Boden des Röhrchens ein. 1 ml der Lösung langsam unterlegen, dabei darauf achten, keine Blasen zu bilden. Nehmen Sie die serologische Pipette langsam aus dem Röhrchen und achten Sie darauf, den Gradienten nicht zu stören.
      HINWEIS: Für die 70%ige Unterlage sollte die 100%ige isotonische Dichtegradientenlösung mit RPMI-Medien auf 70% verdünnt werden (d. h. 7 ml 100%ige isotonische Dichtegradientenlösung und 3 ml RPMI-Medien gemischt). Darüber hinaus ist die Herstellung einer sauberen, ungestörten 70%igen Unterlage für die Entfernung von Myelintrümmern und für die Gewinnung reiner Einzelzellsuspensionen an der Gradientengrenzfläche nach der Zentrifugation unerlässlich.
    10. Bei 800 x g 30 min bei 4 °C ohne Unterbrechung zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand, einschließlich der Myelin-Trümmerschicht, an, bis 2–3 ml im Röhrchen verbleiben, wobei Sie darauf achten müssen, die Zellschicht nicht zu stören. Entnehmen Sie die Zellschicht zwischen dem 30/70%igen Dichtegradienten mit einer 1-ml-Pipette und übertragen Sie sie in ein neues konisches 15-ml-Röhrchen.
    11. Geben Sie mit einer serologischen 10-ml-Pipette RPMI 10 % FCS-Medien hinzu, um das Endvolumen auf 15 ml zu bringen. 450 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
      HINWEIS: In diesem Schritt können bei Bedarf Zellschichten aus zwei Röhrchen gepoolt werden. Poolen Sie nicht mehr als zwei Röhrchen, da die Zellen sonst aufgrund der Medienkonzentration mit hoher Dichte nicht pelletieren.
    12. Saugen Sie den Überstand vorsichtig an, um das Zellpellet nicht zu stören. Resuspendieren Sie die Zellen in einem geeigneten Volumen/Puffer, um die Zellen mit einem Hämozytometer zu zählen (z. B. resuspendieren Sie ein einzelnes Rückenmark in 250 μl FACS-Puffer für die nachgeschaltete Oberflächenfärbung) (Abbildung 3).
    13. Übertragen Sie die Zellsuspensionen mit einer 1-ml-Pipette auf die Oberseite eines Filterröhrchens (Materialtabelle) und lassen Sie die Zellen bis zum Boden des Röhrchens filtrieren, um verbleibende Myelinablagerungen zu entfernen.
    14. Unter Verwendung des Trypanblau-Ausschlussfarbstoffs werden die Zellen auf einem Hämozytometer verdünnt und gezählt, indem mindestens zwei 16-Quadrat-Gitter mit einer Genauigkeitvon 40,41 gemittelt werden.
    15. Fahren Sie mit der gewünschten Einzelzellanalysetechnik fort.
      ANMERKUNG: Mit verschiedenen Formen von Kollagenase (d. h. D, Typ I, Typ II, Typ IV) können Immunzellen, Mikroglia (Abbildung 3), Astrozyten, Perizyten, Endothelzellen49 und Neuronen50 effizient isoliert werden. Die für die Ergebnisse erhaltenen kernhaltigen Zellzahlen waren wie folgt unter Verwendung des titrierten Kollagenase-I-Enzyms: Gesamtes scheinbehandeltes Gehirn = 500.000–600.000 Zellen; Gesamtes TMEV-IDD-Gehirn = 800.000–1.000.000 Zellen; Ganzes scheinbehandeltes Rückenmark = 150.000–200.000 Zellen; Gesamtes TMEV-IDD-Rückenmark = 300.000–400.000. Die Zellzahl variiert je nach Präzision der Entnahme, Verarbeitung und ob eine ZNS-Entzündung vorliegt.

Ergebnisse

Dieses repräsentative Experiment zielte darauf ab, B- und T-Zellen zu quantifizieren und die Lokalisation von B- und T-Zellen in den meningealen und parenchymalen ZNS-Kompartimenten unter homöostatischen Bedingungen sowie in einem murinen progredienten MS-Modell (d.h. TMEV-IDD) zu beschreiben. TMEV-IDD wurde in 5 Wochen alten weiblichen SJL-Mäusen durch intrakranielle Infektion mit 5 x 106 plaquebildenden Einheiten (PFU) von TMEV BeAn induziert, wie zuvor beschrieben29.

Diskussion

Methoden zur Bewertung der zellulären Zusammensetzung im ZNS-Kompartiment während der Homöostase und Krankheit sind essentiell für das Verständnis der physiologischen und pathologischen Zustände des ZNS. Obwohl sie als wichtige Barriere im ZNS dienen und eine Vielzahl von Immunzellen beherbergen, werden die Hirnhäute oft von der Analyse ausgeschlossen, da viele herkömmliche Gewebeentnahmemethoden für Gehirn und Rückenmark die Entnahme dieser Membranen nicht zulassen. Diese Auslassung ist eine entscheidende Eins...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Die Autoren danken den Mitarbeitern des Center for Comparative Medicine and Research (CCMR) in Dartmouth für die fachkundige Betreuung der Mäuse, die für diese Studien verwendet wurden. Der Bornstein Forschungsfonds förderte diese Forschung.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Aluminum foilanyN/A
Bovine Serum AlbuminThermoFisher Scientific37002D
CentrifugeBeckman CoulterAllegra X-12R centrifuge
Collagenase IWorthingtonLS004196
Conical tube, 15 mLVWR525-1069
Conical tube, 50 mLVWR89039-658
Cover glassHauser Scientific5000
CryomoldVWR18000-128
Curved forcepsFine Science Tools11003-14
Disposable polystyrene tube, 14 mLFisher Scientific14-959-1B
Disposable ScalpelFisher ScientificNC0595256
DNAse IWorthingtonLS002139
Dry iceAirgasN/A
Durmont #7ForcepsFine Science Tools11271-30
EDTA disodium salt dihydrateAmresco0105-500g
Ethanol, 100%anyN/A
Fetal Bovine Serum (FBS)HycloneSH30910.03
Filter top tube, 5 mLVWR352235
Fixable viability stain 780Becton Dickinson565388
Flow cytometerBeckman CoulterGallios
GlucoseFisher ChemicalD16-500
Goat anti-mouse IgG (488 conjugate)Jackson immunoresearch115-546-146
Goat anti-mouse IgG (594 conjugate)Jackson immunoresearch115-586-146
Goat anti-rabbit 488Jackson immunoresearch111-545-144
Goat anti-rat 594Jackson immunoresearch112-585-167
Goat anti-rat 650Jackson immunoresearch112-605-167
Hank's Balnced Salt Solution (HBSS)Corning21-020-CV
HemacytometerAndwin Scientific02-671-51B
HemostatFine Science Tools13004-14
HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid)ThermoFisher Scientific15630080
KClFisher chemicalBP366-500
KH2PO4 (anhydrous)Sigma AldrichP5655-100G
Liquid NitrogenAirgasN/A
Mouse FC block (CD16/32)Becton Dickinson553141
Na2HP04 (anhydrous)Fisher ChemicalS374-500
NaClFisher chemicalS671-500
Needle, 25 gaugeBecton Dickinson305122
Normal mouse serumThermoFisher Scientific31881
Nylon mesh strainerVWR352350
OCTSakura4583
Paraformaldehyde, 20%Electron Microscopy Sciences15713-SDiluted to 4% using 1 x PBS
Pasteur pipette, 9 inch, unpluggedFisher Scientific13-678-20C
PBS (1x)Corning21-040-CV
PE Rat Anti-Mouse CD4Becton Dickinson553730
PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19Becton Dickinson562329
Percoll density gradient mediaGE healthcare17-0891-01
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45Becton Dickinson550994
Petri dish, 100 mmVWR353003
pH meterFisher Scientific13-636-AB150
Pipet-AidDrummond Scientific Corporation4-000-101
Pipette 200 µlGilsonFA10005M
Pipette tips, 1 mLUSA Scientific1111-2831
Pipette tips, 200 µlUSA Scientific1111-1816
Pipette, 1 mLGilsonFA10006M
Prolong Diamond mountant with DAPIThermoFisher ScientificP36962
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32Becton Dickinson553141
Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone)Abcamab16669
Rabbit anti-mouse lamininAbcamab11575
Rat anti-mouse ERT-R7Abcamab51824
RPMI 1640Corning10-040-CV
Serological pipet, 1 mLVWR357521
Serological pipet, 10 mLVWR357551
Serological pipet, 5 mLVWR357543
Sodium hydroxideFisher ScientificS318-100
SucroseFisher chemicalS5-500
Surgical scissorsFine Science Tools14001-16
Surgical scissors, extra fineRobozRS-5882
Syringe, 10 mLBecton Dickinson302995
Syringe, 5 mLBecton Dickinson309646
Trypan blueGibco15250-061
Vacuum filter systemMillipore20207749
Vacuum flaskThomas Scientific5340-2L
Vacuum in-line filterPall Corporation4402
Vacuum lineCole PalmerEW-06414-20
Water bathThermoFisher ScientificVersa bath

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