Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Method Article
Bu makale, beyin, omurilik ve meninksler dahil olmak üzere merkezi sinir sistemi içindeki yerleşik ve periferik olarak türetilmiş bağışıklık hücrelerini incelemek için optimize edilmiş iki protokol sunmaktadır. Bu protokollerin her biri, kararlı durum ve enflamatuar koşullar altında bu bölmeleri işgal eden hücrelerin işlevini ve bileşimini belirlemeye yardımcı olur.
Merkezi sinir sistemi (MSS) beyin ve omurilikten oluşur ve çevre ile CNS arasında bir bariyer görevi gören zarlı tabakalar olan meninksler tarafından sarılır. CNS, immünolojik olarak uzmanlaşmış bir bölgedir ve kararlı durum koşullarında, bağışıklık ayrıcalığı en çok CNS parankiminde belirgindir. Buna karşılık, meninksler, doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere çok çeşitli yerleşik hücreler barındırır. CNS hasarı, otoimmünite, enfeksiyon ve hatta nörodejenerasyon ile tetiklenen enflamatuar durumlar sırasında, periferik olarak türetilmiş bağışıklık hücreleri parankima girebilir ve meninksler içinde ikamet edebilir. Bu hücrelerin CNS hastalığı patogenezi sırasında hem yararlı hem de zararlı eylemler gerçekleştirdiği düşünülmektedir. Bu bilgiye rağmen, CNS bölmesini analiz ederken meninksler genellikle göz ardı edilir, çünkü geleneksel CNS doku ekstraksiyon yöntemleri meningeal tabakaları atlar. Bu protokol, tek hücreli teknikler, immünohistokimya ve in situ hibridizasyon yöntemleri ile aşağı akış analizi için uygun olan murin CNS dokularının (yani beyin, omurilik ve meninksler) hızlı izolasyonu için iki farklı yöntem sunar. Açıklanan yöntemler, homeostatik koşullar altında ve hastalık patogenezi sırasında CNS bölmesini işgal eden hücrelerin fenotipini, işlevini ve lokalizasyonunu değerlendirmek için ideal olan CNS dokularının kapsamlı bir analizini sağlar.
Merkezi sinir sistemi (CNS) immünolojik olarak özelleşmiş bir bölgedir. CNS parankimi, BOS boşluğu, meninksler ve vaskülatür hariç, klasik olarak bağışıklık ayrıcalıklı bir bölge 1,2,3,4,5 olarak görülür ve homeostatik koşullar 2,6,7 sırasında nispeten bağışıklık hücrelerinden yoksundur. Buna karşılık, dura, araknoid ve pia tabakalarından oluşan meninksler, hastalık patogenezisırasında homeostatik immün sürveyans ve enflamatuar süreçlere aktif olarak katılan CNS bölmesinin önemli bileşenleridir 3,6,7,8. Kararlı durum koşulları sırasında, meninksler, doğuştan gelen lenfoid hücreler (ILC), makrofajlar, dendritik hücreler (DC), mast hücreleri, T hücreleri ve daha az ölçüde B hücreleri 9,10,11 dahil olmak üzere çok sayıda immün sentinel hücreyi destekler.
Meninksler oldukça vaskülarize yapılardır ve CNS ile çevresi arasında lenfatik bir bağlantı sağlayan lenfatik damarlar içerir 8,12,13,14. CNS hasarı, enfeksiyonlar, otoimmünite ve hatta nörodejenerasyonun neden olduğu enflamatuar durumlarda, periferik olarak türetilmiş bağışıklık hücreleri parankimmaya sızar ve meninksler içindeki bağışıklık manzarasını değiştirir. Hücre infiltrasyonunu takiben, meninksler, periferik olarak türetilmiş bağışıklık hücreleri için fonksiyonel bir nişi temsil edebilir, bağışıklık hücresi agregasyonunu, lokal bağışıklık hücresi aktivasyonunu ve CNS bölmesinde uzun süreli sağkalımı teşvik edebilir. Multipl skleroz (MS) dahil olmak üzere CNS'yi etkileyen birçok hastalıkta belirgin meningeal inflamasyon gözlenir.15,16,17,18,19, inme 20,21, steril yaralanma 22,23 (yani, omurilik yaralanması ve travmatik beyin hasarı), migren 24 ve mikrobiyal enfeksiyon 25,26,27,28,29. Bu nedenle, meningeal kompartmandaki yerleşik hücrelerin ve periferik olarak türetilmiş immün hücrelerin karakterizasyonu, bu hücrelerin kararlı durum koşulları ve hastalık patogenezi sırasındaki rolünü anlamak için gereklidir.
Kafatası ve omur gövdelerinden beyin, omurilik ve meninkslerin çıkarılması teknik olarak zor ve zaman alıcıdır. Şu anda, üç meningeal tabakanın tümü bozulmadan beynin hızlı bir şekilde çıkarılması için herhangi bir teknik bulunmamaktadır. Laminektomi mükemmel omurilik dokusu morfolojisi sağlarken ve meningeal tabakaları korurken, hem son derece zaman alıcı hem de karmaşıktır30,31. Tersine, beynin kafatasından çıkarılması ve omuriliğin hidrolik ekstrüzyonu gibi daha geleneksel ekstraksiyon yöntemleri, CNS dokusunun hızlı bir şekilde çıkarılmasını kolaylaştırır, ancak bu tekniklerle hem araknoid hem de dural meninksler kaybolur30,31. Beyin ve omurilik dokularının konvansiyonel izolasyonu sırasında dura ve araknoid tabakaların ihmal edilmesi, CNS bölmesindeki hücrelerin eksik bir analizine neden olur. Bu nedenle, sağlam meninksli CNS dokularının hızlı ekstraksiyonuna odaklanan yeni tekniklerin tanımlanması, CNS bölmesinin optimal analizi için çok önemlidir.
Bu el yazması, farelerden beyin, omurilik ve meninkslerin hızlı bir şekilde çıkarılması için iki yöntem sunarak, CNS parankimi ve meninkslerinde yerleşik hücrelerin ve periferik olarak türetilmiş bağışıklık hücrelerinin aşağı akış analizini kolaylaştırır. Bu optimize edilmiş protokoller, 1) aşağı akış analizi için tek hücreli süspansiyonların izole edilmesine ve 2) dokuların histolojik işleme için hazırlanmasına odaklanır. Beyinden, omurilik dokusundan ve dural ve araknoid meninkslerden tek hücreli süspansiyonların elde edilmesi32, hem parankimal hem de meningeal bölmelerde bulunan hücrelerin aynı anda analizine izin verir. Tek hücreli süspansiyonlar, in vitro stimülasyon 33, enzime bağlı immünospot (ELISpot)28,34,35, akış sitometrisi 36,33 ve tek hücreli 37 veya toplu transkriptomik gerçekleştirmek için hücre kültürü testleri dahil olmak üzere farklı uygulamalarda kullanılabilir. Ek olarak, sırasıyla sağlam kafatasları veya vertebral sütunlarla tüm beyinlerin ve omuriliklerin dekalsifikasyonu için optimize edilmiş protokol, meninksleri sağlam bırakarak ve doku morfolojisini koruyarak çevredeki kemiğin nazikçe dekalsifikasyonuna izin verir. Bu yöntem, hem parankimal hem de meningeal boşluklarda immünohistokimya (IHC) veya in situ hibridizasyon (ISH) teknikleri kullanılarak proteinlerin veya RNA'nın seçici olarak tanımlanmasına izin verir. CNS içindeki yerleşik hücrelerin ve periferik olarak türetilmiş bağışıklık hücrelerinin fenotipinin, aktivasyon durumunun ve lokalizasyonunun karakterizasyonu, CNS bölmesindeki bireysel hücre tiplerinin homeostaz ve hastalık patogenezine nasıl katkıda bulunduğunu anlamak için gerekli bilgileri sağlayabilir.
Tüm hayvan çalışmaları, Dartmouth'daki Geisel Tıp Okulu'ndaki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından gözden geçirilen ve onaylanan protokolleri kullanır.
1. Dekalsifikasyon için beyin ve omurilik örneklerinin işlenmesi
2. Akım sitometri boyaması için meninkslerin ve CNS dokularının hazırlanması
Bu temsili deney, B ve T hücrelerini ölçmeyi ve homeostatik koşullarda meningeal ve parankimal CNS kompartmanlarında B ve T hücresi lokalizasyonunu tanımlamayı ve ayrıca bir murin progresif MS modelinde (yani, TMEV-IDD) tanımlamayı amaçladı. TMEV-IDD, 5 haftalık dişi SJL farelerinde, daha önce tarif edildiği gibi TMEV BeAn'ın 5 x 106 plak oluşturan birimi (PFU) ile intrakraniyal enfeksiyon ile indüklenmiştir29.
Bu çalışmada, enfeksiyon...
Homeostaz ve hastalık sırasında CNS bölmesindeki hücresel bileşimi değerlendirme yöntemleri, CNS'nin fizyolojik ve patolojik durumlarını anlamak için gereklidir. Bununla birlikte, CNS'de önemli bir bariyer görevi görmesine ve çeşitli bağışıklık hücrelerini barındırmasına rağmen, beyin ve omurilik için birçok geleneksel doku ekstraksiyon yöntemi bu zarların toplanmasına izin vermediğinden, meninksler genellikle analizden çıkarılır. Bu ihmal, meninkslerin hücresel bileşimi ve işlevi i...
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Yazarlar, Dartmouth'daki Karşılaştırmalı Tıp ve Araştırma Merkezi (CCMR) personeline, bu çalışmalar için kullanılan farelere gösterdikleri uzman bakım için teşekkür eder. Bornstein Araştırma Fonu bu araştırmayı finanse etti.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Aluminum foil | any | N/A | |
Bovine Serum Albumin | ThermoFisher Scientific | 37002D | |
Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-12R centrifuge | |
Collagenase I | Worthington | LS004196 | |
Conical tube, 15 mL | VWR | 525-1069 | |
Conical tube, 50 mL | VWR | 89039-658 | |
Cover glass | Hauser Scientific | 5000 | |
Cryomold | VWR | 18000-128 | |
Curved forceps | Fine Science Tools | 11003-14 | |
Disposable polystyrene tube, 14 mL | Fisher Scientific | 14-959-1B | |
Disposable Scalpel | Fisher Scientific | NC0595256 | |
DNAse I | Worthington | LS002139 | |
Dry ice | Airgas | N/A | |
Durmont #7Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | |
EDTA disodium salt dihydrate | Amresco | 0105-500g | |
Ethanol, 100% | any | N/A | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | |
Filter top tube, 5 mL | VWR | 352235 | |
Fixable viability stain 780 | Becton Dickinson | 565388 | |
Flow cytometer | Beckman Coulter | Gallios | |
Glucose | Fisher Chemical | D16-500 | |
Goat anti-mouse IgG (488 conjugate) | Jackson immunoresearch | 115-546-146 | |
Goat anti-mouse IgG (594 conjugate) | Jackson immunoresearch | 115-586-146 | |
Goat anti-rabbit 488 | Jackson immunoresearch | 111-545-144 | |
Goat anti-rat 594 | Jackson immunoresearch | 112-585-167 | |
Goat anti-rat 650 | Jackson immunoresearch | 112-605-167 | |
Hank's Balnced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-020-CV | |
Hemacytometer | Andwin Scientific | 02-671-51B | |
Hemostat | Fine Science Tools | 13004-14 | |
HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid) | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
KCl | Fisher chemical | BP366-500 | |
KH2PO4 (anhydrous) | Sigma Aldrich | P5655-100G | |
Liquid Nitrogen | Airgas | N/A | |
Mouse FC block (CD16/32) | Becton Dickinson | 553141 | |
Na2HP04 (anhydrous) | Fisher Chemical | S374-500 | |
NaCl | Fisher chemical | S671-500 | |
Needle, 25 gauge | Becton Dickinson | 305122 | |
Normal mouse serum | ThermoFisher Scientific | 31881 | |
Nylon mesh strainer | VWR | 352350 | |
OCT | Sakura | 4583 | |
Paraformaldehyde, 20% | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | Diluted to 4% using 1 x PBS |
Pasteur pipette, 9 inch, unplugged | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
PBS (1x) | Corning | 21-040-CV | |
PE Rat Anti-Mouse CD4 | Becton Dickinson | 553730 | |
PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19 | Becton Dickinson | 562329 | |
Percoll density gradient media | GE healthcare | 17-0891-01 | |
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45 | Becton Dickinson | 550994 | |
Petri dish, 100 mm | VWR | 353003 | |
pH meter | Fisher Scientific | 13-636-AB150 | |
Pipet-Aid | Drummond Scientific Corporation | 4-000-101 | |
Pipette 200 µl | Gilson | FA10005M | |
Pipette tips, 1 mL | USA Scientific | 1111-2831 | |
Pipette tips, 200 µl | USA Scientific | 1111-1816 | |
Pipette, 1 mL | Gilson | FA10006M | |
Prolong Diamond mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36962 | |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | Becton Dickinson | 553141 | |
Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone) | Abcam | ab16669 | |
Rabbit anti-mouse laminin | Abcam | ab11575 | |
Rat anti-mouse ERT-R7 | Abcam | ab51824 | |
RPMI 1640 | Corning | 10-040-CV | |
Serological pipet, 1 mL | VWR | 357521 | |
Serological pipet, 10 mL | VWR | 357551 | |
Serological pipet, 5 mL | VWR | 357543 | |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | |
Sucrose | Fisher chemical | S5-500 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-16 | |
Surgical scissors, extra fine | Roboz | RS-5882 | |
Syringe, 10 mL | Becton Dickinson | 302995 | |
Syringe, 5 mL | Becton Dickinson | 309646 | |
Trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
Vacuum filter system | Millipore | 20207749 | |
Vacuum flask | Thomas Scientific | 5340-2L | |
Vacuum in-line filter | Pall Corporation | 4402 | |
Vacuum line | Cole Palmer | EW-06414-20 | |
Water bath | ThermoFisher Scientific | Versa bath |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır