JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، نقدم ونصف طريقة غير نشطة وغير فاشية لتقييم تخليق البروتين في الجسم الحي، وذلك باستخدام الخيطية Caenorhabditis elegans والانتعاش fluorescence بعد photobleaching (FRAP). ويمكن الجمع بين هذه الطريقة مع الشاشات الوراثية و / أو الدوائية لتحديد التعديلات الجديدة من تخليق البروتين.

Abstract

الحفاظ على البروتيوم صحية أمر ضروري للخلايا والكائنات الحية التوازن. إن االتوازن بين التحكم في البروتينات الترانسية وتدهورها يُحرّض على العديد من الأمراض المرتبطة بالعمر. ويعتبر تراجع آليات مراقبة الجودة في البروتوستاسيس سمة مميزة للشيخوخة. لا تزال الطرق الكيميائية الحيوية للكشف عن تخليق البروتينات من جديد محدودة ، ولها عيوب عديدة ولا يمكن تنفيذها في الخلايا الحية أو الحيوانات. Caenorhabditis elegans ، كونها شفافة وتعديلها وراثيا بسهولة ، هو نموذج ممتاز لرصد معدلات تخليق البروتين باستخدام تقنيات التصوير. هنا، نقدم ونصف طريقة لقياس تخليق البروتين في الجسم الحي باستخدام الفلوريسينت الانتعاش بعد photobleaching (FRAP). الحيوانات المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات الفلورية في خلايا أو أنسجة محددة هي المشعة من قبل مصدر الضوء القوي مما يؤدي إلى الفلورسينس photobleaching. بدوره, تقييم الفلوريسنس الانتعاش يدل على تخليق البروتين الجديد في الخلايا و / أو الأنسجة ذات الاهتمام. وبالتالي، فإن الجمع بين الديدان الخيطية المعدلة وراثيا، والتدخلات الوراثية و/ أو الدوائية جنبا إلى جنب مع التصوير الحي لمعدلات تخليق البروتين يمكن أن يلقي الضوء على آليات التوسط في انهيار البروتيوستا المعتمد على العمر.

Introduction

تخليق البروتين وتدهوره أمر ضروري للتحلل الكائنات الحية. وهناك العديد من الأمراض المرتبطة بالعمر بتحريض من إنتاج البروتين المعيب1,2. من أجل قياس معدلات ترجمة البروتين العالمية، وهناك تقنيات البيوكيميائية مثل التنميط الريبوسومي، الذي ينطوي على التسلسل العميق لشظايا الحمض النوويrna محمية الريبوسوم لرصد التعبير وكذلك تخليق البروتين رواية3. هذا الأسلوب، بالإضافة إلى كونه قراءة غير مباشرة لمعدلات الترجمة، كما زيادة رنا جمعية لا يعني بالضرورة زيادة الترجمة، لديها عيوب تقنية، مثل التكلفة العالية وشرط كمية كبيرة من المواد الأولية. من ناحية أخرى، الأساليب القائمة على البروتيوميكس تسمح لكمّ البروتين المباشر عن طريق التوصيف الأيضي النبضي متبوعاً بتحليل قياس الطيف الكتلي4،5. ومع ذلك، هذا هو نهج شبه كمية مع دقة زمنية محدودة التي لا يمكن استخدامها بسهولة في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يتم توزيع التوسيم للبروتين بشكل غير متساو في الحيوان/الأنسجة ذات الاهتمام. والأهم من ذلك، يمكن لكل من هاتين الطريقتين إخفاء اختلافات خاصة بالأنسجة أو الخلايا في معدلات ترجمة البروتين في الحيوانات أو الأنسجة بالكامل، على التوالي.

Caenorhabditis elegans هو كائن سهل الاستخدام نموذج يمكن زراعته في أعداد كبيرة6. بالإضافة إلى ذلك، تسمح قابلية الوراثية والشفافية للتصوير الحي في الجسم الحي. يصف هذا البروتوكول منهجية الكشف عن معدلات تخليق البروتين باستخدام استرداد الفلوريسنس بعد التحسس الضوئي (FRAP). نحن نستفيد من التعبير المعدلة وراثيا من البروتينات الفلورية، إما في الكائن الحي كله أو في أنسجة محددة / خلايا. ويمكن للحيوانات المحورة وراثيا إما أن تعبر عن GFP باستخدام مروج للجينات، التي يتم التعبير عنها على نطاق واسع/ على الصعيد العالمي أو مروج خاص بالأنسجة لاستهداف أنواع محددة من الخلايا. ويمكن توسيع هذه التقنية إلى المروج محددة لدراسة معدلات تخليق البروتين من بروتين معين.

Protocol

ملاحظة: يمكن استخدام كل من الإندماجات النسخية والترجمة إلى الفلوروفوريس لتقييم ترجمة البروتينات في العديد من الأنسجة. يمكن تقييم معدلات تخليق البروتين لعائلات بروتينية متعددة تُترجم في مقصورات خلوية مختلفة، بما في ذلك السيتوبلازم والميتوكوندرياونواست 7. وتستخدم السلالات التالية لرصد معدلات تخليق البروتين العالمي والخلايا العصبية, N2; السابقين[فife-2GFP, pRF4], ife-2(ok306); Ex[pife-2GFP, pRF4], N2; السابق[p-119GFP، pRF4]، edc-3 (ok1427)؛ السابقات[p-119GFP, pRF4], N2; السابق[فSOD-3GFP؛ pRF4]

1- صيانة وتزامن وإعداد الديدان الخيطية المعدلة وراثياً لرصد تخليق البروتينات من جديد

  1. استخدم منظار مجسم مُنشط لتشريحه لتقييم مراحل النمو ونمو النوع البري (wt) والنيمات الخيطية المتحولة وراثياً.
  2. اليوم 1: استخدام قطف دودة لتحديد ونقل 10 يرقات L4 من wt والحيوانات المتحولة وراثيا متحولة تحمل المراسل الفلورسنت المطلوب على Nematode نمو وسائل الإعلام (NGM) لوحات بذر مع Escherichia القولونية (OP50)(الجدول 1).
    1. جعل اختيار دودة عن طريق ربط سلك البلاتين في نهاية مدبب من ماصة باستور الزجاج عن طريق ذوبان الزجاج في موقع الاتصال على الموقد بونسن. ثم، تسطيح نهاية السلك البلاتيني في شكل ملعقة باستخدام أي أداة (على سبيل المثال، مطرقة خفيفة أو دبابيس).
    2. تلقيح مستعمرة واحدة من البكتيريا القولونية E. (OP50) في قارورة تحتوي على 50 مل من لوريا-بيرتاني (LB) السائل المتوسط وتنمو لمدة 10 ساعات في 37 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز (200 دورة في الدقيقة; الجدول 1). ثم، بذور لوحات NGM مع 200 ميكرولتر من الثقافة البكتيرية. احتضان لوحات بذر في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها للسماح لنمو الحديقة البكتيرية.
  3. احتضان وتنمو الديدان الخيطية في درجة الحرارة القياسية من 20 درجة مئوية.
  4. اليوم الخامس: تحتوي الأطباق على مجموعة مختلطة من الديدان المعدلة وراثياً. اختيار ونقل 15 يرقات L4 من كل سلالة على لوحات OP50-NGM المصنفة حديثا.
  5. اليوم 6: أداء مقايسة FRAP ومراقبة معدل تخليق البروتين في اليوم 1 من مرحلة البلوغ.
  6. إعداد واستخدام cycloheximide التي تحتوي على لوحات NGM كتحكم إيجابي:
    ملاحظة: إعداد محلول الأسهم من السيكلويكسيميد عن طريق تخفيف في الماء إلى تركيز 10 ملغ / مل. حافظ على حلول الأسهم عند 4 درجة مئوية.
    1. قتل البكتيريا عن طريق تعريض لوحات NGM المصنفة لمدة 15 دقيقة مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية (222 μW/cm2 شدة).
    2. أضف cycloheximide على رأس الألواح البكتيرية إلى 500 ميكروغرام / مل التركيز النهائي في حجم agar.
    3. السماح لتجف لوحات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    4. نقل الديدان الخيطية المعدلة وراثيا التي تعبر عن صsod-3GFP على السيارة واللوحات التي تحتوي على السيكلوهيكسميد.
    5. احتضان الحيوانات لمدة 2 ساعة في درجة الحرارة القياسية من 20 درجة مئوية.

2- مقايسة FRAP باستخدام محورة وراثياً تعبر عن مراسلي الأنسجة الجسدية pife-2GFP وpsod-3GFP

ملاحظة: مراقبة معدل تخليق البروتين العالمي في جسم الحيوان بأكمله. يقدم هؤلاء المراسلون النسخيون مستويات تعبير مختلفة ويعبرون عنها في كل مكان في أنسجة جسدية متعددة ، بما في ذلك الأمعاء والبلعوم وعضلات جدار الجسم.

  1. اختيار ونقل الحيوانات المعدلة وراثيا لمدة يوم واحد الكبار إلى لوحات NGM الفردية بذر مع 20 ميكرولتر OP50 قطرة في المركز.
  2. إزالة الغطاء ووضع كل لوحة تحت عدسة الهدف 20x من مجهر epifluorescence.
  3. التركيز والتقاط صورة مرجعية قبل photobleaching (قبل التبييض).
  4. Photobleach كل عينة لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: أوقف الاضاءة الضوئية عندما يتم إخماد إشارة الفلورسنت إلى 30 – 50٪ كثافة نسبة إلى صورة ما قبل التبييض. وينبغي تعديل شدة الضوء ومدة فترة التبييض وفقا لذلك بالنسبة للفلوروفور، ومرحلة الحيوان، والخلايا أو الأنسجة قيد الفحص. وينبغي أن تحدد تجريبياً المدة المناسبة للإشعاع اللازم للوصول إلى مدى كافٍ من الخفقان الضوئي، بالنسبة لعينات مختلفة.
  5. التقاط صورة بعد photobleaching (التبييض).
  6. إبقاء الحيوانات في لوحات NGM الفردية والسماح لهم لاسترداد.
  7. صورة وتسجيل الانتعاش من كل مراسل الفلورسنت كل 1 ساعة لمدة 6 ساعات على الأقل في مضان المجسم.
  8. بدلاً من ذلك، قم بإجراء تقييم الفلورسنت للاستعادة باستخدام مجهر الظهارة (على سبيل المثال AxioImager Z2).
  9. تقييم بعناية صحة الحيوان لكل من خلال رصد الحركة، والحساسية للمس، والقدرة الإنجابية والبقاء على قيد الحياة على مدى الأيام 3 المقبلة. واستبعدت من التحليلات الإضافية حالات النماتودا التي تظهر عليها علامات التلف بعد الاحتراق الضوئي.

3. تركيب العينات وأداء اختبار FRAP باستخدام النيماتودا المعدلة وراثيا التعبير عن عموم العصبية cytoplasmic GFP، فunc-119GFP

ملاحظة: مراقبة عموم العصبية تخليق البروتين عن طريق photobleaching المستهدفة في منطقة الرأس، حيث يقع حلقة العصب.

  1. إعداد 2٪ منصات agarose.
  2. أضف قطرة 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت M9 إلى مركز لوحة agarose.
  3. نقل 5 الديدان الخيطية المعدلة وراثيا التعبير عن عموم الخلايا العصبية سيتوبلازميك GFP في قطرة من M9 العازلة.
  4. استخدم رمشًا لنشر السائل.
    ملاحظة: الحيوانات تعرض حركات مخفضة خلال دقيقتين بسبب امتصاص M9 في agar.
  5. تغيير موضع الخيطية لتجنب التداخل باستخدام اختيار "رمش".
  6. ضع العينة تحت عدسة 40x الهدف من مجهر epifluorescence.
    ملاحظة: لا تستخدم غطاء.
  7. التركيز والتقاط صورة مرجعية (ما قبل التبييض).
  8. Photobleach المنطقة المستهدفة من الفائدة لمدة 90 ثانية.
    ملاحظة: أوقف الاضاءة الضوئية عندما يتم إخماد إشارة الفلورسنت إلى 30 – 50٪ كثافة نسبة إلى صورة ما قبل التبييض. وينبغي تعديل شدة الضوء ومدة فترة التبييض وفقا لذلك بالنسبة للفلوروفور، ومرحلة الحيوان، والخلايا أو الأنسجة قيد الفحص. وينبغي أن تحدد تجريبياً المدة المناسبة للإشعاع اللازم للوصول إلى مدى كافٍ من الخفقان الضوئي، بالنسبة لعينات مختلفة.
  9. التقاط صورة بعد photobleaching (التبييض).
  10. إضافة قطرة 10 ميكرولتر من M9 العازلة على الديدان الخيطية photobleached.
  11. دع الحيوانات تتعافى لمدة 5 دقائق.
  12. استخدام "رمش" أو ماصة لنقل الديدان الخيطية إلى لوحات NGM الفردية بذر مع 20 ميكرولتر OP50 قطرة في المركز.
  13. التقط صورة لكل عينة كل ساعة تحت منظار مُيكروسكوب epifluorescence.
    ملاحظة: عدد t = 0 لوقت الاسترداد بعد photobleaching.

4- تحليل البيانات عن التقاط الصور أثناء عملية تقييم الموارد الحرجية من أجل حماية الغابات

  1. تحليل الصور المكتسبة باستخدام البرمجيات (مثل فيجي).
  2. فتح الصور مع البرنامج.
  3. حدد الأمر تقسيم القنوات عبر القائمة المنسدلة الصورة والألوان.
    ملاحظة: احتفظ بصورة القناة الخضراء.
  4. استخدم أداة التحديد اليدوي لتعيين منطقة الفلورسنت ذات الاهتمام (على سبيل المثال، الجسم بأكمله، الرأس، الأمعاء).
  5. حدد الأمر القياس عبر القائمة المنسدلة تحليل لقياس متوسط كثافة البيكسل للمنطقة التي تهم لكل نقطة زمنية.
    ملاحظة: يتم حساب النسبة المئوية لاسترداد الفلوريسين باستخدام الصور المرجعية التي تم التقاطها بعد التحسس الضوئي.

5 - تقرير التحليل الإحصائي

  1. استخدام ما لا يقل عن 20 - 25 الديدان الخيطية من كل سلالة و / أو شرط.
    ملاحظة: يجب إجراء ثلاثة النسخ المتماثلة البيولوجية.
  2. إجراء اختبار t-الطالب(مقارنة بين مجموعتين) أو ANOVA (مقارنة بين مجموعات متعددة) للتحليل الإحصائي مع P < 0.05 كـ الهامة باستخدام برنامج التحليل الإحصائي.

النتائج

باستخدام الإجراء المعروض هنا، تم استخدام النوع البري والنيمات الخيطية المتحولة المتحولة المتحولة التي تعبر عن المراسلين الجسديين التاليين، pife-22GFP، psod-3GFP وpunc-119GFP، لتقييم معدلات تخليق البروتين وفقًا للبروتوكولات ذات الصلة.sod على وجه ا...

Discussion

البروتين التوليف التشكيل ضروري للجسم المثلي الكائنات الحية. أثناء الشيخوخة، العالمية وكذلك تخليق البروتين محددة هو مضطرب. وتكشف الدراسات الحديثة عن حقيقة أن توازن ترجمة البروتين يتحكم مباشرة في الشيخوخة والشيخوخة ليس مجرد نتيجة ثانوية لعملية الشيخوخة. على وجه الخصوص، المكونات الأساسية...

Disclosures

ولا يعلن أصحاب البلاغ عن أي مصالح متنافسة.

Acknowledgements

نشكر تشانيوتاكيس م. وكوناكيس ك. لتسجيل الفيديو وتحريره. يتم تمويل شركة K.P. من منحة من المؤسسة اليونانية للبحث والابتكار والأمانة العامة للبحوث والتكنولوجيا (GSRT). يتم تمويل N.T. من خلال منح من مجلس البحوث الأوروبي (ERC - GA695190 - MANNA) ، وبرامج إطار عمل المفوضية الأوروبية ، ووزارة التعليم اليونانية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AgarSigma-Aldrich5040
AgaroseBiozym8,40,004
Agarose pads 2%
Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O)Sigma-AldrichC5080
CholesterolSERVA Electrophoresis17101.01
cycloheximideSigma-AldrichC-7698
Dissecting stereomicroscopeNikon CorporationSMZ645
edc-3(ok1427);Ex[punc-119GFP, pRF4]Tavernarakis labMaintain animals at 20 °C
Epifluorescence microscopeZeissAxio Imager Z2
Escherichia coli OP50 strainCaenorhabditis Genetics Center (CGC)
Fluorescence dissecting stereomicroscopeZeissSteREO Lumar V12
Greiner Petri dishes (60 x 15 mm)Sigma-AldrichP5237
ife-2(ok306);Ex[pife-2GFP, pRF4]Tavernarakis labMaintain animals at 20 °C
image analysis softwareFijihttps://fiji.sc
KH2PO4EMD Millipore1,37,010
K2HPO4EMD Millipore1,04,873
LB liquid medium
M9 buffer
Magnesium sulfate (MgSO4)Sigma-AldrichM7506
Microscope slides (75 x 25 x 1 mm)Marienfeld, Lauda-Koenigshofen10 006 12
Microsoft Office 2011 Excel software packageMicrosoft Corporation, Redmond, USA
N2;Ex[pife-2GFP; pRF4]Tavernarakis labMaintain animals at 20 °C
N2;Ex[psod-3GFP; pRF4]Tavernarakis labMaintain animals at 20 °C
N2;Ex[punc-119GFP; pRF4]Tavernarakis labMaintain animals at 20 °C
Na2HPO4EMD Millipore1,06,586
Nematode growth medium (NGM) agar plates
Nystatin stock solutionSigma-AldrichN3503
PeptoneBD, Bacto211677
Phosphate buffer
Sodium chloride (NaCl)EMD Millipore1,06,40,41,000
Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.)
Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.).
statistical analysis softwareGraphPad Software Inc., San Diego, USAGraphPad Prism software package
StreptomycinSigma-AldrichS6501
UV CrosslinkerVilber Lourmat BIO-LINK BLX 254
Worm pick

References

  1. Syntichaki, P., Troulinaki, K., Tavernarakis, N. eIF4E function in somatic cells modulates ageing in Caenorhabditis elegans. Nature. 445 (7130), 922-926 (2007).
  2. Charmpilas, N., Daskalaki, I., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. Protein synthesis as an integral quality control mechanism during ageing. Ageing Research Reviews. 23, 75-89 (2015).
  3. Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources. Cell. 157 (3), 624-635 (2014).
  4. Dermit, M., Dodel, M., Mardakheh, F. K. Methods for monitoring and measurement of protein translation in time and space. Molecular Biosystems. 13 (12), 2477-2488 (2017).
  5. Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The Growing Toolbox for Protein Synthesis Studies. Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 612-624 (2017).
  6. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
  7. Kourtis, N., Tavernarakis, N. Cell-specific monitoring of protein synthesis in vivo. PLoS One. 4 (2), 4547 (2009).
  8. Parker, R., Sheth, U. P bodies and the control of mRNA translation and degradation. Molecular Cell. 25 (5), 635-646 (2007).
  9. Rieckher, M., Markaki, M., Princz, A., Schumacher, B., Tavernarakis, N. Maintenance of Proteostasis by P Body-Mediated Regulation of eIF4E Availability during Aging in Caenorhabditis elegans. Cell Reports. 25 (1), 199-211 (2018).
  10. Reits, E. A., Neefjes, J. J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nature Cell Biology. 3 (6), 145-147 (2001).
  11. Keith, S. A., et al. Graded Proteasome Dysfunction in Caenorhabditis elegans Activates an Adaptive Response Involving the Conserved SKN-1 and ELT-2 Transcription Factors and the Autophagy-Lysosome Pathway. PLoS Genetics. 12 (2), 1005823 (2016).
  12. Kumsta, C., et al. The autophagy receptor p62/SQST-1 promotes proteostasis and longevity in C. elegans by inducing autophagy. Nature Communications. 10 (1), 5648 (2019).
  13. Gregersen, N., Bolund, L., Bross, P. Protein misfolding, aggregation, and degradation in disease. Molecular Biotechnology. 31 (2), 141-150 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

163 FRAP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved