Valutazione dei tassi di sintesi proteica de novo in Caenorhabditis elegans

Riepilogo

Qui, introduciamo e descriviamo un metodo nonradioattivo e non invasivo per valutare la sintesi proteica de novo in vivo, utilizzando il nematode Caenorhabditis elegans e il recupero della fluorescenza dopo il fotobleaching (FRAP). Questo metodo può essere combinato con schermi genetici e/o farmacologici per identificare nuovi modulatori della sintesi proteica.

Abstract

Mantenere un proteoma sano è essenziale per l'omeostasi cellulare e organismosa. La perturbazione dell'equilibrio tra il controllo traslazione proteica e la degradazione istiga una moltitudine di malattie legate all'età. Il declino dei meccanismi di controllo della qualità della proteostasi è un segno distintivo dell'invecchiamento. I metodi biochimici per rilevare la sintesi proteica de novo sono ancora limitati, presentano diversi svantaggi e non possono essere eseguiti in cellule o animali vivi. Caenorhabditis elegans, essendo trasparente e facilmente geneticamente modificato, è un ottimo modello per monitorare i tassi di sintesi delle proteine utilizzando tecniche di imaging. Qui, introduciamo e descriviamo un metodo per misurare la sintesi proteica de novo in vivo utilizzando il recupero della fluorescenza dopo il fotobleaching (FRAP). Gli animali transgenici che esprimono proteine fluorescenti in cellule o tessuti specifici sono irradiati da una potente fonte di luce con conseguente fotobleaching della fluorescenza. A sua volta, la valutazione del recupero della fluorescenza significa nuova sintesi proteica nelle cellule e/o nei tessuti di interesse. Pertanto, la combinazione di nematodi transgenici, interventi genetici e/o farmacologici insieme all'imaging dal vivo dei tassi di sintesi proteica può far luce sui meccanismi che mediano il collasso della proteostasi dipendente dall'età.

Introduzione

La sintesi e la degradazione delle proteine sono essenziali per l'omeostasi dell'organismo. Una moltitudine di malattie legate all'età sono istigate dalla produzione di proteine^{difettose 1,2}. Al fine di misurare i tassi di traduzione globale delle proteine, esistono tecniche biochimiche come la profilazione ribosomica, che prevede il sequenziamento profondo dei frammenti di mRNA protetti da riboso per monitorare l'espressione e la sintesi delle proteine^3. Questo metodo, oltre ad essere una lettura indiretta dei tassi di traslazione, poiché una maggiore associazione dell'RNA ai ribosomi non significa necessariamente una maggiore traduzione, presenta svantaggi tecnici, come l'alto costo e il requisito di una grande quantità di materiale iniziale. D'altra parte, i metodi basati sulla proteomica consentono la quantificazione diretta delle proteine mediante profilazione metabolica dell'impulso seguita dall'analisi della spettrometria^{di massa 4,5}. Tuttavia, si tratta di un approccio semi-quantitativo con risoluzione temporale limitata che non può essere facilmente utilizzato in vivo. Inoltre, l'etichettatura della proteina può essere distribuita in modo ineguale nell'animale/tessuto di interesse. È importante sottolineare che entrambi questi metodi possono nascondere variazioni specifiche del tessuto o delle cellule nei tassi di conversione delle proteine rispettivamente in animali o tessuti interi.

Caenorhabditis elegans è un organismo modello facile da usare che può essere coltivato in grandi numeri⁶. Inoltre, la sua capacità genetica e la trasparenza consentono l'imaging dal vivo in vivo. Questo protocollo descrive la metodologia per rilevare i tassi di sintesi proteica utilizzando il recupero della fluorescenza dopo il fotobleaching (FRAP). Approfittiamo dell'espressione transgenica delle proteine fluorescenti, sia nell'intero organismo che in tessuti/cellule specifici. Gli animali transgenici possono esprimere GFP usando il promotore di un gene, che è ampiamente/globalmente espresso o un promotore specifico del tessuto per colpire tipi di cellule specifiche. Questa tecnica può essere estesa a un promotore specifico per esaminare i tassi di sintesi proteica di una proteina specifica.

Protocollo

NOTA: Sia le fusioni trascrizionali che trassuali in fluorofori possono essere utilizzate per valutare la traslazione delle proteine de novo in diversi tessuti. I tassi di sintesi proteica possono essere valutati per più famiglie di proteine localizzate in diversi compartimenti cellulari, tra cui citoplasma, mitocondri e nucleo⁷. I seguenti ceppi sono utilizzati per monitorare i tassi di sintesi proteica globale e neuronale, N2; Ex[p_ife-2GFP, pRF4], ife-2(ok306); Ex[p_ife-2GFP, pRF4], N2; Ex[p_unc-119GFP, pRF4], edc-3(ok1427); Ex[p_unc-119GFP, pRF4], N2; Ex[p_sod-3GFP; pRF4]

1. Manutenzione, sincronizzazione e preparazione di nematodi transgenici per il monitoraggio della sintesi proteica de novo

1. Utilizzare uno stereomicroscopio sezionante per valutare le fasi di sviluppo e la crescita di tipo selvaggio (wt) e nematodi transgenici mutanti.
2. Giorno 1: Utilizzare un getto di verme per selezionare e trasferire 10 larve L4 di animali transgenici wt e mutanti che trasportano il reporter fluorescente desiderato su piastre Nematode Growth Media (NGM) semitette con Escherichia coli (OP50) (Tabella 1).
   1. Fare un prelievo di verme attaccando un filo di platino nell'estremità affusolata di una pipetta Pasteur di vetro fondendo il vetro nel sito di contatto su un bruciatore Bunsen. Quindi, appiattire l'estremità del filo di platino in una forma spatola utilizzando qualsiasi strumento (ad esempio, pincer o martello leggero).
   2. Inoculare una singola colonia di batteri E. coli (OP50) in una fiaschetta contenente 50 mL di mezzo liquido Luria-Bertani (LB) e crescere per 10 ore a 37 gradi centigradi in un'incubatrice di agitazione (200 giri/min; Tabella 1. Poi, semina piastre NGM con 200 L di coltura batterica. Incubare le piastre di semi a temperatura ambiente durante la notte per consentire la crescita del prato batterico.
3. Incubare e far crescere i nematodi alla temperatura standard di 20 gradi centigradi.
4. Giorno 5: Le piastre contengono una popolazione mista di vermi transgenici. Selezionare e trasferire 15 larve L4 di ogni ceppo su piastre OP50-NGM appena semite.
5. Giorno 6: Eseguire il test FRAP e monitorare il tasso di sintesi proteica nel primo giorno dell'età adulta.
6. Preparare e utilizzare cicloheximide contenente piastre NGM come controllo positivo:
   NOTA: Preparare una soluzione di stock di cicloheximide diluindo in acqua ad una concentrazione di 10 mg/mL. Mantenere la soluzione di magazzino a 4 gradi centigradi.
   1. Uccidere i batteri esponendo le piastre NGM semi per 15 minuti con la luce UV (intensità 222W/cm^2).
   2. Aggiungere la cicloheximide sopra le piastre batteriche a 500 g/mL concentrazione finale nel volume dell'agar.
   3. Lasciare asciugare le piastre a temperatura ambiente per 30 minuti.
   4. Trasferire nematodi transgenici che esprimono p_sod-3GFP su piastre contenenti veicoli e cicloheximide.
   5. Incubare gli animali per 2 h alla temperatura standard di 20 gradi centigradi.

2. Analisi FRAP con animali transgenici che esprimono giornalisti di tessuti somatici p_ife-2GFP e p_sod-3GFP

NOTA: monitorare il tasso di sintesi proteica globale in tutto il corpo animale. Questi reporter trascrizionali presentano diversi livelli di espressione e sono onnipresenti espressi in più tessuti somatici, tra cui l'intestino, pharynx e muscoli della parete del corpo.

1. Raccogliere e trasferire animali transgenici adulti di 1 giorno a singole piastre NGM con una goccia di 20 L OP50 al centro.
2. Rimuovere il coperchio e posizionare ogni piastra sotto una lente obiettivo 20x di un microscopio epifluorescenza.
3. Mettere a fuoco e acquisire un'immagine di riferimento prima della fotobleaching (pre-bleach).
4. Fotobleach ogni campione per 10 minuti.
   NOTA: Interrompere il fotobleaching quando il segnale fluorescente viene spento al 30 – 50% di intensità rispetto all'immagine pre-sbiancante. L'intensità della luce e la durata del periodo di sbiancamento devono essere regolate di conseguenza per il fluorforo specifico, lo stadio animale e la cellula o il tessuto in esame. Deve essere determinata sperimentalmente la durata appropriata dell'irradiazione necessaria per raggiungere un'adeguata estensione del fotobleaching, per i diversi campioni.
5. Acquisire un'immagine dopo la fotobiancatura (candeggina).
6. Tenere gli animali in singole piastre NGM e lasciarli recuperare.
7. Immagine e registrazione del recupero di ogni reporter fluorescente ogni 1 ora per almeno 6 ore in uno stereomicroscopio a fluorescenza.
8. In alternativa, eseguire la valutazione del recupero fluorescente utilizzando un microscopio epifluorescenza (ad esempio, AxioImager n. 2).
9. Valutare attentamente la salute degli animali per animale monitorando la loro locomozione, la sensibilità al tatto, la capacità riproduttiva e la sopravvivenza nei prossimi 3 giorni. I nematodi che mostrano segni di danni dopo il fotobleaching sono stati esclusi da ulteriori analisi.

3. Montare i campioni ed eseguire il test FRAP utilizzando nematodi transgenici che esprimono GFP pan-neuronally citoplasmic, p_unc-119GFP

NOTA: Monitorare la sintesi delle proteine pan-neuronali mediante fotobleaching mirato nella regione della testa, dove si trova l'anello nervoso.

1. Preparare 2% pastiglie di agarose.
2. Aggiungere una goccia di 10 L di buffer M9 al centro del pad di agarose.
3. Trasferire 5 nematodi transgenici che esprimono GFP pan-neuronamica citoplasmica in una goccia di buffer M9.
4. Utilizzare una ciglia per diffondere il liquido.
   NOTA: Gli animali mostrano movimenti ridotti entro 2 minuti a causa dell'assorbimento M9 nell'agar.
5. Modificare la posizione del nematode per evitare la sovrapposizione utilizzando un prelievo "occhio".
6. Posizionare il campione sotto una lente obiettivo 40x di un microscopio epifluorescenza.
   NOTA: non utilizzare un coverslip.
7. Mettere a fuoco e acquisire un'immagine di riferimento (pre-candeggina).
8. Fotobleach l'area di interesse mirata per 90 secondi.
   NOTA: Interrompere il fotobleaching quando il segnale fluorescente viene spento al 30 – 50% di intensità rispetto all'immagine pre-sbiancante. L'intensità della luce e la durata del periodo di sbiancamento devono essere regolate di conseguenza per il fluorforo specifico, lo stadio animale e la cellula o il tessuto in esame. Deve essere determinata sperimentalmente la durata appropriata dell'irradiazione necessaria per raggiungere un'adeguata estensione del fotobleaching, per i diversi campioni.
9. Acquisire un'immagine dopo la fotobiancatura (candeggina).
10. Aggiungere una goccia di 10 L di buffer M9 sui nematodi fotobleached.
11. Lasciare che gli animali si riprendano per 5 minuti.
12. Utilizzare il pick "eyelash" o una pipetta per trasferire i nematodi alle singole piastre NGM semitette con 20 L OP50 goccia al centro.
13. Cattura un'immagine di ogni campione ogni 1 ora sotto uno stereomicroscopio di epifluorescenza.
    NOTA: contare il t-0 per il tempo di recupero dopo la fotobleaching.

4. Analisi dei dati di cattura delle immagini durante l'analisi del FRAP

1. Analizzare le immagini acquisite utilizzando un software (ad esempio, Fiji).
2. Aprire le immagini con il software.
3. Selezionare il comando Dividi canali tramite il menu a discesa Immagine e colore.
   NOTA: mantenere l'immagine del canale verde.
4. Utilizzare lo strumento Selezione a mano libera per impostare manualmente la regione fluorescente di interesse (ad esempio, tutto il corpo, la testa, l'intestino).
5. Selezionate il comando Misurazione dal menu a discesa Analizza per misurare l'intensità media dei pixel dell'area di interesse per ogni punto di tempo.
   NOTA: la percentuale di recupero della fluorescenza viene calcolata utilizzando le immagini di riferimento acquisite dopo la fotobleaching.

5. Segnalare l'analisi statistica

1. Utilizzare almeno 20 – 25 nematodi di ogni ceppo e/o condizione.
   NOTA: devono essere eseguite tre repliche biologiche.
2. Eseguire il test t-degli studenti (confronto tra due gruppi) o ANOVA (confronto tra più gruppi) per l'analisi statistica con P < 0.05 come significativo utilizzando software di analisi statistica.

Risultati

Utilizzando la procedura qui presentata, i nematodi transgenici di tipo selvaggio e mutante che esprimono i seguenti reporter somatici, p_ife-2GFP, p_sod-3GFP e p_unc-119GFP, sono stati utilizzati per valutare i tassi di sintesi delle proteine in base ai rispettivi protocolli. In particolare, i vermi mutanti di tipo selvaggio e ife-2 che esprimono GFP citoplasmico in tutti i loro tessuti somatici utilizzando il p...

Discussione

La modulazione della sintesi proteica è essenziale per l'omeostasi organismosa. Durante l'invecchiamento, la sintesi proteica globale e specifica è perturbata. Recenti studi rivelano che l'equilibrio della traduzione delle proteine controlla direttamente la senescenza e l'invecchiamento non è solo un sottoprodotto del processo di invecchiamento. In particolare, componenti fondamentali del macchinario di traduzione come il fattore di iniziazione eucariotica 4E (eIF4E), che facilita il limite dell'mRNA durante l'iniziaz...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Sigma-Aldrich	5040
Agarose	Biozym	8,40,004
Agarose pads 2%
Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O)	Sigma-Aldrich	C5080
Cholesterol	SERVA Electrophoresis	17101.01
cycloheximide	Sigma-Aldrich	C-7698
Dissecting stereomicroscope	Nikon Corporation		SMZ645
edc-3(ok1427);Ex[punc-119GFP, pRF4]	Tavernarakis lab		Maintain animals at 20 °C
Epifluorescence microscope	Zeiss		Axio Imager Z2
Escherichia coli OP50 strain	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Fluorescence dissecting stereomicroscope	Zeiss		SteREO Lumar V12
Greiner Petri dishes (60 x 15 mm)	Sigma-Aldrich	P5237
ife-2(ok306);Ex[pife-2GFP, pRF4]	Tavernarakis lab		Maintain animals at 20 °C
image analysis software	Fiji		https://fiji.sc
KH2PO4	EMD Millipore	1,37,010
K2HPO4	EMD Millipore	1,04,873
LB liquid medium
M9 buffer
Magnesium sulfate (MgSO4)	Sigma-Aldrich	M7506
Microscope slides (75 x 25 x 1 mm)	Marienfeld, Lauda-Koenigshofen	10 006 12
Microsoft Office 2011 Excel software package	Microsoft Corporation, Redmond, USA
N2;Ex[pife-2GFP; pRF4]	Tavernarakis lab		Maintain animals at 20 °C
N2;Ex[psod-3GFP; pRF4]	Tavernarakis lab		Maintain animals at 20 °C
N2;Ex[punc-119GFP; pRF4]	Tavernarakis lab		Maintain animals at 20 °C
Na2HPO4	EMD Millipore	1,06,586
Nematode growth medium (NGM) agar plates
Nystatin stock solution	Sigma-Aldrich	N3503
Peptone	BD, Bacto	211677
Phosphate buffer
Sodium chloride (NaCl)	EMD Millipore	1,06,40,41,000
Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.)
Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.).
statistical analysis software	GraphPad Software Inc., San Diego, USA		GraphPad Prism software package
Streptomycin	Sigma-Aldrich	S6501
UV Crosslinker	Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254
Worm pick