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要約

ここでは、光漂白後の線虫 カエノールハブディティス・エレガン スおよび蛍光回復(FRAP)を利用して、インビボでのデノボタンパク合成を評価するための非放射性および非侵襲的な方法を紹介し、説明する。この方法は、タンパク質合成の新しいモジュレーターを識別するために、遺伝的および/または薬理学的スクリーンと組み合わせることができます。

要約

細胞および体性恒常性に不可欠なタンパク質を維持することは、健康なプロテオームを維持する必要があります。タンパク質の翻訳対照と分解のバランスの摂動は、多くの年齢関連疾患を引き起こします。プロテオスタシスの品質管理機構の低下は老化の特徴である。デノボタンパク質合成を検出する生化学的方法は依然として限定的であり、いくつかの欠点を有し、生きた細胞または動物では行うことができない。 カエノハブディティス・エレガンスは、 透明で遺伝子組み換えが容易であり、イメージング技術を用いてタンパク質合成速度を監視する優れたモデルです。ここでは、光漂白後の蛍光回収(FRAP)を利用した生体内でのデノボタンパク質合成を測定する方法について紹介する。特定の細胞または組織で蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック動物は、蛍光光化をもたらす強力な光源によって照射される。次に、蛍光回復の評価は、目的の細胞および/または組織における新しいタンパク質合成を意味します。したがって、遺伝子導入線種、遺伝的および/または薬理学的介入とタンパク質合成速度の生画像化の組み合わせは、年齢依存性プロテオスタシス崩壊を媒介するメカニズムに光を当てることができる。

概要

タンパク質合成と分解は、生体恒常性に不可欠です。多数の年齢関連疾患が、欠陥タンパク質産生11,22によって引き起こされている。世界的なタンパク質翻訳速度を測定するために、リボソームプロファイリングなどの生化学的手法があり、リボソーム保護されたmRNA断片の深いシーケンシングを伴い、発現をモニタリングし、新しいタンパク質合成3を監視する。この方法は、翻訳速度の間接読み出しであることに加え、リボソームへのRNA関連の増加は必ずしも翻訳の増加を意味するわけではないので、高コストおよび大量の出発材料の要件などの技術的な欠点を有する。一方、プロテオミクスベースの方法は、パルス代謝プロファイリングによる直接タンパク質定量を可能にし、続いて質量分析分析44、55を行う。しかし、これは、生体内で簡単に使用できない限られた時間分解能を持つ半定量的なアプローチです。さらに、タンパク質の標識は、対象の動物/組織に不均等に分布することができる。重要なことに、これらの方法は、それぞれ動物全体または組織におけるタンパク質翻訳速度における組織特異的または細胞特異的な変動を隠すことができる。

カエノハブディティス・エレガンス は、6個の数で成長させることができる使いやすいモデル生物です。さらに、その遺伝的異常性および透明性は、生体内での生画像化を可能にする。このプロトコルは、光漂白後の蛍光回復(FRAP)を用いてタンパク質合成速度を検出する方法論を説明する。私たちは、生物全体または特定の組織/細胞における蛍光タンパク質のトランスジェニック発現を利用します。トランスジェニック動物は、遺伝子のプロモーターを用いてGFPを発現するか、特定の細胞タイプを標的とする組織特異的プロモーターを発現させる。この技術は、特定のタンパク質のタンパク質合成速度を調べるために特定のプロモーターに拡張することができる。

プロトコル

注:蛍光体への転写および翻訳融合の両方を使用して、いくつかの組織におけるデノボタンパク質翻訳を評価することができます。タンパク質合成速度は、細胞質、ミトコンドリアおよび核7を含む異なる細胞コンパートメントに局在する複数のタンパク質ファミリーについて評価することができる。次の株は、グローバルおよび神経タンパク質合成速度を監視するために使用されます, N2;Ex[pife-2GFP,pRF4]、ife-2(ok306) ife-2(ok306)元[pife-2GFP, pRF4], N2;Ex[punc-119GFP, pRF4]、 edc-3 (ok1427)。元[punc-119GFP, pRF4], N2;元[psod-3GFP; pRF4]

1. デノボタンパク質合成をモニタリングするためのトランスジェニック線虫の維持、同期および調製

  1. 解剖用実体顕微鏡を用いて、野生型(wt)および変異型トランスジェニック線虫の発生段階および成長を評価する。
  2. 1日目:望ましい蛍光レポーターを運ぶwtおよび変異型トランスジェニック動物の10L4幼虫を、エシェリヒア・コリ(OP50)を播種したプレートに選択して移送するワームピックを使用する(表1)。
    1. ブンゼンバーナーの接触部位でガラスを溶かして、ガラス製のパスツールピペットの先細り端にプラチナワイヤーを取り付けて、ワームピックを行います。次に、任意の工具(例えば、ピンサーまたはライトハンマー)を使用して、白金線の端部をヘラ状に平らにする。
    2. 大 腸菌 (OP50)の単一コロニーを、ルリア・ベルタニ(LB)液体培地50mLを含むフラスコに接種し、37°Cで10時間、揺れインキュベーター(200rpm)で増殖する。 表 1)。次いで、細菌培養の200 μLでNGMプレートをシードします。細菌の芝生の成長を可能にするために、室温で一晩で播種プレートをインキュベートします。
  3. 線虫を20°Cの標準温度でインキュベートし、成長させる。
  4. 5日目:プレートには、トランスジェニックワームの混合集団が含まれています。選択し、新しく播種OP50-NGMプレート上の各株の15 L4幼虫を転送します。
  5. 6日目:成人期の1日目にFRAPアッセイを行い、タンパク質合成率を監視する。
  6. 正のコントロールとしてNGMプレートを含むシクロヘキシミドを準備し、使用します。
    注:水に希釈して10mg/mLの濃度に希釈することにより、シクロヘキシミドのストック溶液を調製してください。ストック液を4°Cに保つ。
    1. 播種したNGMプレートをUV光(222 μW/cm2 強度)で15分間曝露して細菌を殺す。
    2. 細菌種プレートの上にシクロヘキシミドを加えて、寒天体積の500 μg/mLの最終濃度にします。
    3. プレートを室温で30分間乾燥させます。
    4. 車載およびシクロヘキシミド含有プレート上でpsod-3GFP を発現するトランスジェニック線虫を転写する。
    5. 20°Cの標準温度で2時間の動物をインキュベートする。

2. 体細胞組織レポーターpie-2GFPおよびpsod-3GFPを発現するトランスジェニック動物を用いたFRAPアッセイ

注:動物の体全体のグローバルタンパク質合成速度を監視します。これらの転写レポーターは、異なる発現レベルを提示し、腸、咽頭および体壁筋肉を含む複数の体細胞組織で遍在的に発現している。

  1. 1日成のトランスジェニック動物を、中央に20 μL OP50ドロップで播種した個々のNGMプレートに移します。
  2. 蓋を取り外し、各プレートを20倍の対物レンズの下に置きます。
  3. フォトブリーチ(プレ漂白)の前に、参照画像に焦点を当ててキャプチャします。
  4. 各サンプルを10分間フォトブリーチします。
    注:蛍光シグナルが、漂白前画像に対して30~50%の強度に消光した場合は、フォトブラチを停止します。光強度と漂白期間の期間は、検査中の特定のフルオロフォア、動物のステージおよび細胞または組織に応じて調整する必要があります。適切な光漂白の範囲に達するために必要な照射の適切な持続時間は、異なる標本のために、実験的に決定されるべきである。
  5. フォトブリーチ(漂白)後に画像をキャプチャします。
  6. 動物を個々のNGMプレートに保管し、回復させます。
  7. 蛍光体顕微鏡で1時間毎に1時間毎に各蛍光レポーターの回収を画像化し記録する。
  8. あるいは、蛍光顕微鏡(例えば、AxioImager Z2)を用いて蛍光回収評価を行う。
  9. 動物の移動、触接感度、生殖能力、生存期間を次の3日間にわたって監視することで、動物一人当たりの動物の健康状態を慎重に評価します。光漂白後の損傷の兆候を示す線虫は、さらなる分析から除外された。

3. サンプルを取り付け、汎神経細胞質GFP、punc-119GFPを発現するトランスジェニック線虫を用いてFRAPアッセイを行う

注:神経環が位置するヘッド領域で標的フォトブリーチすることにより、汎神経細胞タンパク質合成を監視します。

  1. 2%アガロースパッドを準備します。
  2. アガロースパッドの中央にM9バッファの10 μLのドロップを追加します。
  3. 汎ニューロン細胞質GFPを発現する5つのトランスジェニック線虫をM9バッファーの低下に移す。
  4. まつげを使って液体を広げます。
    注:動物は寒天へのM9吸光度のために2分以内に動きを減らします。
  5. 「まつげ」ピックを使用して重なり合わないように線虫の位置を変更します。
  6. このサンプルを、蛍光顕微鏡の40倍の対物レンズの下に置きます。
    注: カバースリップは使用しないでください。
  7. 参照画像(プレ漂白剤)に焦点を合わせ、キャプチャします。
  8. 対象となる対象領域を 90 秒間フォトブリュチします。
    注:蛍光シグナルが、漂白前画像に対して30~50%の強度に消光した場合は、フォトブラチを停止します。光強度と漂白期間の期間は、検査中の特定のフルオロフォア、動物のステージおよび細胞または組織に応じて調整する必要があります。適切な光漂白の範囲に達するために必要な照射の適切な持続時間は、異なる標本のために、実験的に決定されるべきである。
  9. フォトブリーチ(漂白)後に画像をキャプチャします。
  10. フォトブリーチ線虫にM9バッファを10μLドロップします。
  11. 動物は5分間回復しましょう。
  12. 「まつげ」ピックまたはピペットを使用して、ネマトデスを中央に20 μL OP50ドロップで播種した個々のNGMプレートに移します。
  13. 各サンプルの画像を、1時間ごとに、蛍光体型顕微鏡で撮影します。
    メモ:フォトブリーチ後の回復時間として t=0 をカウントします。

4. FRAPアッセイ中に撮影した画像のデータ解析

  1. 取得した画像をソフトウェア(フィジーなど)を使用して分析します。
  2. ソフトウェアで画像を開きます。
  3. [画像と色] ドロップダウン メニューから [チャンネルの分割] コマンドを選択します。
    注: 緑色のチャンネルイメージを保持します。
  4. フリーハンド選択ツールを使用して、対象の蛍光領域(全身、頭部、腸など)を手動で設定します。
  5. [分析]ドロップダウン メニューから[計測]コマンドを選択して、各時間ポイントの対象領域の平均ピクセル強度を測定します。
    注:蛍光回復の割合は、光漂白後に撮影した参照画像を使用して計算されます。

5. 統計分析の報告

  1. 各株および/または条件の少なくとも20 - 25線虫を使用してください。
    注: 3 つの生物学的複製を実行する必要があります。
  2. 統計的解析ソフトウェアを使用して有意なP< 0.05を用いた統計分析のために、P学生t-検定(2つのグループ間の比較)またはANOVA(複数グループ間の比較)を実行します。

結果

ここで示した手順を用いて、以下の体細胞レポーターを発現する野生型および変異型トランスジェニック線虫、pife-22GFP、psodsod-3GFPおよびpunc-119GFPを、それぞれのプロトコルに従ってタンパク質合成率を評価するために使用した。特に、ヒス2プロモーターを用いて体細胞組織全体に細胞質GFPを発現する野生型お?...

ディスカッション

タンパク質合成変調は、生体恒常性に不可欠です。老化の間に, グローバルだけでなく、特定のタンパク質の合成が摂動されます。.最近の研究では、タンパク質翻訳バランスが老化と老化を直接制御することは、単なる老化過程の副産物ではないことが明らかになっている。特に、真核生物開始因子4E(eIF4E)のような翻訳機械のコア成分は、翻訳開始時にmRNAキャッピングを容易にし、したがっ...

開示事項

著者らは競合する利益を宣言しない。

謝辞

チャニオタキス・Mとクナキス・Kのビデオ録画と編集に感謝します。K.P.は、ギリシャ研究イノベーション財団(HFRI)と研究技術総事務局(GSRT)からの助成金を受けています。N.T.は欧州研究評議会(ERC – GA695190 – MANNA)、欧州委員会枠組みプログラム、ギリシャ教育省からの助成金によって資金提供されています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
AgarSigma-Aldrich5040
AgaroseBiozym8,40,004
Agarose pads 2%
Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O)Sigma-AldrichC5080
CholesterolSERVA Electrophoresis17101.01
cycloheximideSigma-AldrichC-7698
Dissecting stereomicroscopeNikon CorporationSMZ645
edc-3(ok1427);Ex[punc-119GFP, pRF4]Tavernarakis labMaintain animals at 20 °C
Epifluorescence microscopeZeissAxio Imager Z2
Escherichia coli OP50 strainCaenorhabditis Genetics Center (CGC)
Fluorescence dissecting stereomicroscopeZeissSteREO Lumar V12
Greiner Petri dishes (60 x 15 mm)Sigma-AldrichP5237
ife-2(ok306);Ex[pife-2GFP, pRF4]Tavernarakis labMaintain animals at 20 °C
image analysis softwareFijihttps://fiji.sc
KH2PO4EMD Millipore1,37,010
K2HPO4EMD Millipore1,04,873
LB liquid medium
M9 buffer
Magnesium sulfate (MgSO4)Sigma-AldrichM7506
Microscope slides (75 x 25 x 1 mm)Marienfeld, Lauda-Koenigshofen10 006 12
Microsoft Office 2011 Excel software packageMicrosoft Corporation, Redmond, USA
N2;Ex[pife-2GFP; pRF4]Tavernarakis labMaintain animals at 20 °C
N2;Ex[psod-3GFP; pRF4]Tavernarakis labMaintain animals at 20 °C
N2;Ex[punc-119GFP; pRF4]Tavernarakis labMaintain animals at 20 °C
Na2HPO4EMD Millipore1,06,586
Nematode growth medium (NGM) agar plates
Nystatin stock solutionSigma-AldrichN3503
PeptoneBD, Bacto211677
Phosphate buffer
Sodium chloride (NaCl)EMD Millipore1,06,40,41,000
Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.)
Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.).
statistical analysis softwareGraphPad Software Inc., San Diego, USAGraphPad Prism software package
StreptomycinSigma-AldrichS6501
UV CrosslinkerVilber Lourmat BIO-LINK BLX 254
Worm pick

参考文献

  1. Syntichaki, P., Troulinaki, K., Tavernarakis, N. eIF4E function in somatic cells modulates ageing in Caenorhabditis elegans. Nature. 445 (7130), 922-926 (2007).
  2. Charmpilas, N., Daskalaki, I., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. Protein synthesis as an integral quality control mechanism during ageing. Ageing Research Reviews. 23, 75-89 (2015).
  3. Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources. Cell. 157 (3), 624-635 (2014).
  4. Dermit, M., Dodel, M., Mardakheh, F. K. Methods for monitoring and measurement of protein translation in time and space. Molecular Biosystems. 13 (12), 2477-2488 (2017).
  5. Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The Growing Toolbox for Protein Synthesis Studies. Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 612-624 (2017).
  6. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
  7. Kourtis, N., Tavernarakis, N. Cell-specific monitoring of protein synthesis in vivo. PLoS One. 4 (2), 4547 (2009).
  8. Parker, R., Sheth, U. P bodies and the control of mRNA translation and degradation. Molecular Cell. 25 (5), 635-646 (2007).
  9. Rieckher, M., Markaki, M., Princz, A., Schumacher, B., Tavernarakis, N. Maintenance of Proteostasis by P Body-Mediated Regulation of eIF4E Availability during Aging in Caenorhabditis elegans. Cell Reports. 25 (1), 199-211 (2018).
  10. Reits, E. A., Neefjes, J. J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nature Cell Biology. 3 (6), 145-147 (2001).
  11. Keith, S. A., et al. Graded Proteasome Dysfunction in Caenorhabditis elegans Activates an Adaptive Response Involving the Conserved SKN-1 and ELT-2 Transcription Factors and the Autophagy-Lysosome Pathway. PLoS Genetics. 12 (2), 1005823 (2016).
  12. Kumsta, C., et al. The autophagy receptor p62/SQST-1 promotes proteostasis and longevity in C. elegans by inducing autophagy. Nature Communications. 10 (1), 5648 (2019).
  13. Gregersen, N., Bolund, L., Bross, P. Protein misfolding, aggregation, and degradation in disease. Molecular Biotechnology. 31 (2), 141-150 (2005).

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