卡诺哈布迪蒂斯 伊利根斯新蛋白合成率评估

摘要

在这里，我们介绍和描述一种非放射性和非侵入性的方法，以评估体内的去新蛋白合成，利用线虫 卡诺 哈布迪炎和荧光漂白后恢复（FRAP）。该方法可与遗传和/或药理学屏幕相结合，识别蛋白质合成的新调制器。

摘要

保持健康的蛋白质组对细胞和有机体平衡至关重要。蛋白质转化控制和降解之间的平衡的扰动引发了许多与年龄相关的疾病。蛋白位虫质量控制机制的减少是老龄化的一个标志。检测新蛋白合成的生化方法仍然有限，有几个缺点，不能在活细胞或动物中进行。 卡诺哈布迪蒂斯，透明 和容易转基因，是一个极好的模型，以监测蛋白质合成率使用成像技术。在这里，我们介绍并描述了一种利用光漂白后荧光回收（FRAP）测量体内新蛋白合成的方法。在特定细胞或组织中表达荧光蛋白的转基因动物被强大的光源照射，从而产生荧光光漂白。反过来，荧光恢复的评估意味着新的蛋白质合成在细胞和/或组织感兴趣。因此，将转基因线虫、遗传和/或药理干预与蛋白质合成率的活成像相结合，可以揭示调解年龄依赖性蛋白酶崩溃的机制。

引言

蛋白质的合成和降解对于有机体平衡至关重要。许多与年龄相关的疾病是由有缺陷的蛋白质生产^{1，2,引起的}。为了测量全球蛋白质的转化率，有生化技术，如核糖体分析，其中包括核糖体保护mRNA片段的深度测序，以监测表达以及新的蛋白质合成^3。这种方法除了间接读出转化率外，因为增加RNA与核糖体的关联并不一定意味着翻译增加，因此具有技术缺点，例如成本高和大量起始材料的需求。另一方面，基于蛋白质组学的方法允许通过脉冲代谢分析直接蛋白质定量，然后进行质谱分析^4，5。,5然而，这是一种半定量方法，具有有限的时间分辨率，在体内不容易使用。此外，蛋白质的标签可以在感兴趣的动物/组织中不均匀分布。重要的是，这两种方法可以分别隐藏整个动物或组织中蛋白质转化率的组织特异性或细胞特异性变异。

卡诺哈布迪蒂斯埃利 根是一种易于使用的模型生物体，可以大量^生长6。此外，其遗传的适用性和透明度允许在体内进行活成像。该协议描述了光漂白（FRAP）后使用荧光回收检测蛋白质合成率的方法。我们利用荧光蛋白的转基因表达，无论是整个生物体还是特定的组织/细胞。转基因动物可以使用基因的启动子表达GP，该基因被广泛/全球表达，或者使用组织特异性启动子来靶向特定细胞类型。此技术可以扩展到特定启动子，以检查特定蛋白质的蛋白质合成率。

研究方案

注:对荧光团的转录和转化融合都可用于评估多个组织中的诺沃蛋白转化。蛋白质合成率可以评估多个蛋白质家族，本地化在不同的细胞隔间，包括细胞质，线粒体和核^7。以下菌株用于监测全球和神经元蛋白合成率，N2;Ex[p_ife-2GFP， pRF4]， ife-2 （ok306）;Ex[p_ife-2GFP， pRF4]， N2;Ex[p_unc-119GFP， pRF4]， edc-3 （ok1427）;Ex[p_unc-119GFP, pRF4], N2;Ex[p_sod-3Gfp; prf4]

1. 转基因线虫的维护、同步和制备，用于监测新蛋白合成

1. 使用解剖立体显微镜评估野生型（wt）和突变转基因线虫的发育阶段和生长。
2. 第1天:使用蠕虫采摘选择并转移10L4幼虫的wt和突变转基因动物携带所需的荧光报告器到线虫生长介质（NGM）板种子与Escherichia大肠杆菌（OP50）（表1）。
   1. 通过将 Bunsen 燃烧器接触现场的玻璃熔化，将铂丝连接到玻璃巴斯德移液器的锥形端，进行蠕虫采摘。然后，使用任何工具（例如钳子或轻锤），将铂丝的端部分平展成铲子形状。
   2. 将大肠杆菌（OP50）E. coli的单个菌群接种到含有50 mL的Luria-Bertani（LB）液体介质的烧瓶中，在37°C的摇床（200 rpm;表 1.然后，用200μL的细菌培养剂播种NGM板。在室温下孵育种子板过夜，使细菌草坪生长。
3. 在20°C的标准温度下孵育和生长线虫。
4. 第5天:板块中含有转基因蠕虫的混合种群。在新鲜种子OP50-NGM盘上选择并转移每种菌株的15个L4幼虫。
5. 第6天:在成年的第1天进行FRAP测定并监测蛋白质合成率。
6. 准备和使用含有NGM板的环氧胺作为正控:
   注:在水中稀释至浓度为10mg/mL，准备环氧酰胺的库存溶液。将库存溶液保持在 4 °C。
   1. 通过暴露种子的NGM板15分钟与紫外线（222 μW/厘米^{2强度）杀死} 细菌。
   2. 在细菌种子板上加入环氧胺，在总和量中达到500微克/mL的最终浓度。
   3. 让板在室温下干燥 30 分钟。
   4. 转移转基因线虫，在车辆和含环氧胺的板上表达p_sod-3GFP。
   5. 在20°C的标准温度下孵育动物2小时。

2. 使用转基因动物表达躯体组织记者 p_{ife-2 Gfp}和 p_{sod -3 Gfp 的}Frap 测定

注:监测整个动物体内的全球蛋白质合成率。这些转录记者呈现不同的表达水平，并无处不在地表达在多个躯体组织，包括肠道，咽和体壁肌肉。

1. 挑选并转移1天成人转基因动物到个别NGM板种子与20μL OP50下降的中心。
2. 取下盖子，将每个板放在荧光显微镜的 20 倍客观透镜下。
3. 在光漂白（预漂白）之前对参考图像进行对焦和捕获。
4. 光漂白每个样品10分钟。
   注:当荧光信号淬火至 30 ~ 50% 的强度时，停止光漂白。根据被检查的特定荧光团、动物阶段和细胞或组织，应相应地调整光强度和漂白周期的持续时间。对于不同的试样，需要适当的辐照持续时间，以达到足够的光漂白程度。
5. 光漂白（漂白）后捕获图像。
6. 将动物放在单独的NGM盘子中，让它们恢复。
7. 在荧光立体显微镜下，每1小时成像并记录每个荧光测量仪的恢复情况，至少6小时。
8. 或者，使用荧光显微镜（例如，AxioImager Z2）进行荧光恢复评估。
9. 仔细评估每只动物的健康，通过监测其运动，触摸敏感性，生殖能力和生存在未来3天。光漂白后出现损伤迹象的线虫被排除在进一步分析之外。

3. 安装样品并使用表达泛神经细胞质 GFP 的转基因线虫进行 FRAP 测定，p_unc-119GFP

注:通过神经环位于的头部区域定向光漂白来监测泛神经元蛋白合成。

1. 准备2%的加糖垫。
2. 将 M9 缓冲液滴到红糖垫的中心添加 10 μL 滴。
3. 将5个表达泛神经细胞质GP的转基因线虫转移到一滴M9缓冲液中。
4. 用睫毛传播液体。
   注:由于 M9 吸收剂进入阿加，动物在 2 分钟内显示的运动减少。
5. 使用"睫毛"选择更改线虫位置以避免重叠。
6. 将样品放在荧光显微镜的 40 倍客观透镜下。
   注:请勿使用盖玻片。
7. 对焦并捕获参考图像（预漂白）。
8. 将目标感兴趣区域光漂白 90 秒。
   注:当荧光信号淬火至 30 ~ 50% 的强度时，停止光漂白。根据被检查的特定荧光团、动物阶段和细胞或组织，应相应地调整光强度和漂白周期的持续时间。对于不同的试样，需要适当的辐照持续时间，以达到足够的光漂白程度。
9. 光漂白（漂白）后捕获图像。
10. 在光漂白线虫上添加 10 μL 滴 M9 缓冲液。
11. 让动物恢复5分钟。
12. 使用"睫毛"拾取器或移液器将线虫转移到单个 NGM 板，在中心放置 20 μL OP50 滴。
13. 每 1 小时在荧光立体显微镜下每 1 小时捕获一次每个样本的图像。
    注:在光漂白后恢复时间计数 t=0。

4. FRAP测定期间图像捕获的数据分析

1. 使用软件（例如斐济）分析获取的图像。
2. 使用软件打开图像。
3. 通过"图像和颜色"下拉菜单选择"拆分通道"命令。
   注:保留绿色通道图像。
4. 使用 "手绘选择 "工具手动设置感兴趣的荧光区域（例如全身、头部、肠道）。
5. 通过" 分析 "下 拉 菜单选择"测量"命令，以测量每个时间点所感兴趣区域的均值像素强度。
   注:荧光恢复百分比使用光漂白后捕获的参考图像计算。

5. 报告统计分析

1. 使用至少20~25个线虫的每个菌株和/或条件。
   注:应进行三次生物复制。
2. 使用统计 分析软件执行学生 t-测试（两组之间的比较）或 ANOVA（多个组之间的比较）进行统计分析 ，P < 0.05 具有重要意义。

结果

利用此处介绍的程序，使用野生型和突变转基因线虫表示以下体细胞学记者，p_ife-22GFP，p_sod-3-3GFP和 p_unc-119GFP，根据各自的方案评估蛋白质合成速率。特别是，野生型和 ife-2突变蠕虫使用ife-2促进器在其躯体组织中表达细胞质 GFP，在光漂白后和恢复后 5 小时立即进行比较。代表性图像和定量显示，野生类动物完...

讨论

蛋白质合成调制对机体平衡至关重要。在衰老期间，全球和特定的蛋白质合成受到干扰。最近的研究表明，蛋白质转化平衡直接控制衰老和衰老不仅仅是衰老过程的副产品。特别是，真核启动因子4E（eIF4E）等翻译机制的核心成分，在翻译启动过程中促进mRNA封顶，从而降低依赖帽的蛋白质转化率，诱发氧化应激，加速衰老^过程1。此外，神经元特异性EDC-3，它与mRNA处理体、P体相互...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Sigma-Aldrich	5040
Agarose	Biozym	8,40,004
Agarose pads 2%
Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O)	Sigma-Aldrich	C5080
Cholesterol	SERVA Electrophoresis	17101.01
cycloheximide	Sigma-Aldrich	C-7698
Dissecting stereomicroscope	Nikon Corporation		SMZ645
edc-3(ok1427);Ex[punc-119GFP, pRF4]	Tavernarakis lab		Maintain animals at 20 °C
Epifluorescence microscope	Zeiss		Axio Imager Z2
Escherichia coli OP50 strain	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Fluorescence dissecting stereomicroscope	Zeiss		SteREO Lumar V12
Greiner Petri dishes (60 x 15 mm)	Sigma-Aldrich	P5237
ife-2(ok306);Ex[pife-2GFP, pRF4]	Tavernarakis lab		Maintain animals at 20 °C
image analysis software	Fiji		https://fiji.sc
KH2PO4	EMD Millipore	1,37,010
K2HPO4	EMD Millipore	1,04,873
LB liquid medium
M9 buffer
Magnesium sulfate (MgSO4)	Sigma-Aldrich	M7506
Microscope slides (75 x 25 x 1 mm)	Marienfeld, Lauda-Koenigshofen	10 006 12
Microsoft Office 2011 Excel software package	Microsoft Corporation, Redmond, USA
N2;Ex[pife-2GFP; pRF4]	Tavernarakis lab		Maintain animals at 20 °C
N2;Ex[psod-3GFP; pRF4]	Tavernarakis lab		Maintain animals at 20 °C
N2;Ex[punc-119GFP; pRF4]	Tavernarakis lab		Maintain animals at 20 °C
Na2HPO4	EMD Millipore	1,06,586
Nematode growth medium (NGM) agar plates
Nystatin stock solution	Sigma-Aldrich	N3503
Peptone	BD, Bacto	211677
Phosphate buffer
Sodium chloride (NaCl)	EMD Millipore	1,06,40,41,000
Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.)
Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.).
statistical analysis software	GraphPad Software Inc., San Diego, USA		GraphPad Prism software package
Streptomycin	Sigma-Aldrich	S6501
UV Crosslinker	Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254
Worm pick