Évaluation des taux de synthèse des protéines de novo à Caenorhabditis elegans

Résumé

Ici, nous introduisons et décrivons une méthode non radioactive et non invasive pour évaluer la synthèse de la protéine de novo in vivo, en utilisant le nématode Caenorhabditis elegans et la récupération de fluorescence après photobleaching (FRAP). Cette méthode peut être combinée avec des écrans génétiques et/ou pharmacologiques pour identifier de nouveaux modulateurs de synthèse protéique.

Résumé

Le maintien d’un protéome sain est essentiel pour l’homéostasie cellulaire et organisationnelle. La perturbation de l’équilibre entre le contrôle translationnel des protéines et la dégradation provoque une multitude de maladies liées à l’âge. Le déclin des mécanismes de contrôle de la qualité de la protéostase est une caractéristique du vieillissement. Les méthodes biochimiques de détection de la synthèse des protéines de novo sont encore limitées, présentent plusieurs inconvénients et ne peuvent pas être effectuées dans des cellules vivantes ou des animaux. Caenorhabditis elegans, transparent et facilement génétiquement modifié, est un excellent modèle pour surveiller les taux de synthèse des protéines en utilisant des techniques d’imagerie. Ici, nous introduisons et décrivons une méthode pour mesurer la synthèse de la protéine de novo in vivo en utilisant la récupération de fluorescence après photobleaching (FRAP). Les animaux transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans des cellules ou des tissus spécifiques sont irradiés par une source lumineuse puissante ayant pour résultat le photobleachage de fluorescence. À son tour, l’évaluation de la récupération de fluorescence signifie une nouvelle synthèse des protéines dans les cellules et/ou les tissus d’intérêt. Par conséquent, la combinaison de nématodes transgéniques, d’interventions génétiques et/ou pharmacologiques ainsi que d’imagerie vivante des taux de synthèse des protéines peut faire la lumière sur les mécanismes de médiation de l’effondrement de la protéostase dépendante de l’âge.

Introduction

La synthèse et la dégradation des protéines sont essentielles à l’homéostasie organisationnelle. Une multitude de maladies liées à l’âge sont provoquées par la production de protéines^{défectueuses 1,2}. Afin de mesurer les taux mondiaux de traduction des protéines, il existe des techniques biochimiques telles que le profilage ribosomal, qui implique le séquençage profond des fragments d’ARNm protégés par le ribosome pour surveiller l’expression ainsi que la synthèse des protéines^{nouvelles 3}. Cette méthode, en plus d’être une lecture indirecte des taux de traduction, comme l’association accrue de l’ARN aux ribosomes ne signifie pas nécessairement une traduction accrue, a des inconvénients techniques, tels que le coût élevé et une exigence d’une grande quantité de matériel de départ. D’autre part, les méthodes à base de protéomique permettent une quantification directe des protéines par le profilage métabolique des impulsions suivie d’une analyse de spectrométrie de masse^4,5. Cependant, il s’agit d’une approche semi-quantitative avec une résolution temporelle limitée qui ne peut pas être facilement utilisée in vivo. En outre, l’étiquetage de la protéine peut être inégalement réparti dans l’animal/tissu d’intérêt. Fait important, ces deux méthodes peuvent dissimuler des variations spécifiques aux tissus ou des cellules dans les taux de traduction des protéines chez des animaux entiers ou des tissus, respectivement.

Caenorhabditis elegans est un organisme modèle facile à utiliser qui peut être cultivé en grand nombre⁶. En outre, son agrément génétique et sa transparence permettent l’imagerie vivante in vivo. Ce protocole décrit la méthodologie pour détecter les taux de synthèse des protéines à l’aide de la récupération de fluorescence après photobleaching (FRAP). Nous profitons de l’expression transgénique des protéines fluorescentes, soit dans l’organisme entier, soit dans des tissus/cellules spécifiques. Les animaux transgéniques peuvent soit exprimer le GFP en utilisant le promoteur d’un gène, qui est largement/globalement exprimé ou un promoteur spécifique aux tissus pour cibler des types de cellules spécifiques. Cette technique peut être étendue à un promoteur spécifique pour examiner les taux de synthèse des protéines d’une protéine spécifique.

Protocole

REMARQUE : Les fusions transcriptionnelles et translationnelles aux fluorophores peuvent être utilisées pour évaluer la traduction de protéines de novo dans plusieurs tissus. Les taux de synthèse des protéines peuvent être évalués pour plusieurs familles de protéines qui ont été localisées dans différents compartiments cellulaires, y compris le cytoplasme, les mitochondries et le noyau⁷. Les souches suivantes sont utilisées pour surveiller les taux globaux et de synthèse des protéines neuronales, N2; Ex[p_ife-2GFP, pRF4], ife-2(ok306); Ex[p_ife-2GFP, pRF4], N2; Ex[p_unc-119GFP, pRF4], edc-3(ok1427); Ex[p_unc-119GFP, pRF4], N2; Ex[p_sod-3GFP; pRF4]

1. Entretien, synchronisation et préparation de nématodes transgéniques pour la surveillance de la synthèse des protéines novo

1. Utilisez un stéréomicroscope disséquant pour évaluer les stades de développement et la croissance du type sauvage (wt) et des nématodes transgéniques mutants.
2. Jour 1 : Utilisez une pioche de vers pour sélectionner et transférer 10 larves de L4 d’animaux transgéniques wt et mutants portant le journaliste fluorescent souhaité sur les plaques nematode Growth Media (NGM) ensemencées d’Escherichia coli (OP50) (Tableau 1).
   1. Faites une sélection de vers en attachant un fil de platine dans l’extrémité effilée d’une pipette pasteur en verre en faisant fondre le verre sur le site de contact sur un brûleur Bunsen. Ensuite, aplatir l’extrémité du fil de platine en forme de spatule à l’aide de n’importe quel outil (p. ex., pince ou marteau léger).
   2. Inoculer une seule colonie de bactéries E. coli (OP50) dans une fiole contenant 50 ml de milieu liquide Luria-Bertani (LB) et se développer pendant 10 heures à 37 °C dans un incubateur de secousses (200 tr/min; Tableau 1). Ensuite, les plaques de NGM de semences avec 200 μL de culture bactérienne. Incuber les plaques ensemencées à température ambiante pendant la nuit pour permettre la croissance de la pelouse bactérienne.
3. Incuber et faire pousser les nématodes à la température standard de 20 °C.
4. Jour 5 : Les plaques contiennent une population mixte de vers transgéniques. Sélectionner et transférer 15 larves L4 de chaque souche sur des plaques OP50-NGM fraîchement ensemencées.
5. Jour 6 : Effectuer l’analyse FRAP et surveiller le taux de synthèse des protéines le premier jour de l’âge adulte.
6. Préparer et utiliser le cycloheximide contenant des plaques NGM comme un contrôle positif :
   REMARQUE : Préparez une solution de bouillon de cycloheximide en diluant dans l’eau à une concentration de 10 mg/mL. Conserver la solution de stock à 4 °C.
   1. Tuer les bactéries en exposant les plaques de NGM ensemencées pendant 15 minutes avec la lumière UV (222 μW/cm² intensité).
   2. Ajouter le cycloheximide sur les plaques à graines bactériennes à une concentration finale de 500 μg/mL dans le volume d’agar.
   3. Laisser sécher les assiettes à température ambiante pendant 30 minutes.
   4. Transférer des nématodes transgéniques exprimant p_sod-3GFP sur les plaques contenant des véhicules et des cycloheximide.
   5. Incuber les animaux pendant 2 h à la température standard de 20 °C.

2. Essai FRAP utilisant des animaux transgéniques exprimant les reporters de tissu somatique p_ife-2GFP et p_sod-3GFP

REMARQUE : Surveiller le taux global de synthèse des protéines dans tout le corps animal. Ces reporters transcriptionnels présentent différents niveaux d’expression et sont omniprésents dans les tissus somatiques multiples, y compris l’intestin, le pharynx et les muscles de la paroi du corps.

1. Choisissez et transférez des animaux transgéniques d’un jour sur des plaques NGM individuelles ensemencées d’une goutte op50 de 20 μL dans le centre.
2. Retirez le couvercle et placez chaque plaque sous une lentille objective 20x d’un microscope à épifluorescence.
3. Concentrez-vous et capturez une image de référence avant de photobleaching (pré-blanchiment).
4. Photobleach chaque échantillon pendant 10 minutes.
   REMARQUE : Arrêtez le photobleaching lorsque le signal fluorescent est éteint à 30 – 50 % d’intensité par rapport à l’image de pré-blanchiment. L’intensité lumineuse et la durée de la période de blanchiment doivent être ajustées en conséquence pour le fluorophore spécifique, le stade animal et la cellule ou le tissu à l’étude. La durée appropriée de l’irradiation nécessaire pour atteindre une étendue adéquate de photobleaching, pour différents spécimens, devrait être déterminée expérimentalement.
5. Capturez une image après photobleaching (blanchiment).
6. Gardez les animaux dans des plaques NGM individuelles et laissez-les récupérer.
7. Image et enregistrer la récupération de chaque journaliste fluorescent toutes les 1 heure pendant au moins 6 heures à un stéréomicroscope de fluorescence.
8. Sinon, effectuer une évaluation de récupération fluorescente à l’aide d’un microscope à épifluorescence (p. ex., AxioImager Z2).
9. Évaluez soigneusement la santé animale par animal en surveillant leur locomotion, leur sensibilité au toucher, leur capacité de reproduction et leur survie au cours des 3 prochains jours. Les nématodes montrant des signes de dommages après photobleaching ont été exclus de l’analyse plus poussée.

3. Montage des échantillons et effectuer des essais FRAP à l’aide de nématodes transgéniques exprimant le GFP cytoplasmique pan-neuronal, p_unc-119GFP

REMARQUE : Surveillez la synthèse des protéines pan-neuronales par photobleaching ciblé à la région de la tête, où se trouve l’anneau nerveux.

1. Préparer 2% de coussinets agarose.
2. Ajouter une goutte de tampon M9 de 10 μL au centre du tampon agarose.
3. Transférez 5 nématodes transgéniques exprimant le GFP cytoplasmique pan-neuronal dans une goutte de tampon M9.
4. Utilisez un cil pour répandre le liquide.
   REMARQUE : Les animaux affichent des mouvements réduits dans les 2 minutes en raison de l’absorption de M9 dans l’agar.
5. Changez la position du nématode pour éviter de vous chevaucher à l’aide d’un pic à cils.
6. Placez l’échantillon sous une lentille objective 40x d’un microscope à épifluorescence.
   REMARQUE : N’utilisez pas de couvercle.
7. Concentrez et capturez une image de référence (pré-blanchiment).
8. Photobleach la zone d’intérêt ciblée pendant 90 secondes.
   REMARQUE : Arrêtez le photobleaching lorsque le signal fluorescent est éteint à 30 – 50 % d’intensité par rapport à l’image de pré-blanchiment. L’intensité lumineuse et la durée de la période de blanchiment doivent être ajustées en conséquence pour le fluorophore spécifique, le stade animal et la cellule ou le tissu à l’étude. La durée appropriée de l’irradiation nécessaire pour atteindre une étendue adéquate de photobleaching, pour différents spécimens, devrait être déterminée expérimentalement.
9. Capturez une image après photobleaching (blanchiment).
10. Ajoutez une goutte de tampon M9 de 10 μL sur les nématodes photobleached.
11. Laisser les animaux récupérer pendant 5 minutes.
12. Utilisez le pic à cils ou une pipette pour transférer les nématodes sur des plaques NGM individuelles ensemencées de 20 μL OP50 au centre.
13. Capturez une image de chaque échantillon toutes les 1 heure sous un stéréomicroscope d’épifluorescence.
    REMARQUE : Comptez t=0 pour le temps de récupération après le photobleaching.

4. Analyse des données des images capturées pendant l’essai du FRAP

1. Analyser les images acquises à l’aide d’un logiciel (p. ex., Fidji).
2. Ouvrez des images avec le logiciel.
3. Sélectionnez la commande Split Channels via le menu déroulant Image et Couleur.
   REMARQUE : Conservez l’image du canal vert.
4. Utilisez l’outil Sélection à main levée pour régler manuellement la région fluorescente d’intérêt (p. ex., corps entier, tête, intestin).
5. Sélectionnez la commande Mesure via le menu déroulant Analyser pour mesurer l’intensité moyenne des pixels de la zone d’intérêt pour chaque point de temps.
   REMARQUE : Le pourcentage de récupération de fluorescence est calculé à l’aide des images de référence capturées après le photobleaching.

5. Analyse statistique du rapport

1. Utilisez au moins 20 à 25 nématodes de chaque souche et/ou condition.
   REMARQUE : Trois répliques biologiques doivent être effectuées.
2. Effectuer le test t-étudiant(comparaison entre deux groupes) ou ANOVA (comparaison entre plusieurs groupes) pour l’analyse statistique avec P < 0,05 comme significatif à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique.

Résultats

À l’aide de la procédure présentée ici, des nématodes transgéniques sauvages et mutants exprimant les reporters somatiques suivants, p_ife-2GFP, p_sod-3GFP et p_unc-119GFP, ont été utilisés pour évaluer les taux de synthèse des protéines selon les protocoles respectifs. En particulier, les vers mutants de type sauvage et d’ife-2 exprimant le GFP cytoplasmique dans leurs tissus somatiques en utilisant ...

Discussion

La modulation de synthèse protéique est essentielle à l’homéostasie organisationnelle. Pendant le vieillissement, la synthèse globale ainsi que spécifique des protéines est perturbée. Des études récentes révèlent que l’équilibre de traduction de protéine contrôle directement la sénescence et le vieillissement n’est pas simplement un sous-produit du processus de vieillissement. En particulier, les composants de base des machines de traduction tels que le facteur d’initiation eucaryote 4E (eIF4E), q...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Sigma-Aldrich	5040
Agarose	Biozym	8,40,004
Agarose pads 2%
Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O)	Sigma-Aldrich	C5080
Cholesterol	SERVA Electrophoresis	17101.01
cycloheximide	Sigma-Aldrich	C-7698
Dissecting stereomicroscope	Nikon Corporation		SMZ645
edc-3(ok1427);Ex[punc-119GFP, pRF4]	Tavernarakis lab		Maintain animals at 20 °C
Epifluorescence microscope	Zeiss		Axio Imager Z2
Escherichia coli OP50 strain	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Fluorescence dissecting stereomicroscope	Zeiss		SteREO Lumar V12
Greiner Petri dishes (60 x 15 mm)	Sigma-Aldrich	P5237
ife-2(ok306);Ex[pife-2GFP, pRF4]	Tavernarakis lab		Maintain animals at 20 °C
image analysis software	Fiji		https://fiji.sc
KH2PO4	EMD Millipore	1,37,010
K2HPO4	EMD Millipore	1,04,873
LB liquid medium
M9 buffer
Magnesium sulfate (MgSO4)	Sigma-Aldrich	M7506
Microscope slides (75 x 25 x 1 mm)	Marienfeld, Lauda-Koenigshofen	10 006 12
Microsoft Office 2011 Excel software package	Microsoft Corporation, Redmond, USA
N2;Ex[pife-2GFP; pRF4]	Tavernarakis lab		Maintain animals at 20 °C
N2;Ex[psod-3GFP; pRF4]	Tavernarakis lab		Maintain animals at 20 °C
N2;Ex[punc-119GFP; pRF4]	Tavernarakis lab		Maintain animals at 20 °C
Na2HPO4	EMD Millipore	1,06,586
Nematode growth medium (NGM) agar plates
Nystatin stock solution	Sigma-Aldrich	N3503
Peptone	BD, Bacto	211677
Phosphate buffer
Sodium chloride (NaCl)	EMD Millipore	1,06,40,41,000
Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.)
Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.).
statistical analysis software	GraphPad Software Inc., San Diego, USA		GraphPad Prism software package
Streptomycin	Sigma-Aldrich	S6501
UV Crosslinker	Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254
Worm pick