Bewertung der de novo Proteinsyntheseraten bei Caenorhabditis elegans

Zusammenfassung

Hier stellen wir eine nicht-radioaktive und nichtinvasive Methode zur Bewertung der de novo Proteinsynthese in vivo vor und beschreiben sie unter Verwendung des Nematoden Caenorhabditis elegans und der Fluoreszenzrückgewinnung nach dem Photobleichen (FRAP). Diese Methode kann mit genetischen und/oder pharmakologischen Screens kombiniert werden, um neuartige Modulatoren der Proteinsynthese zu identifizieren.

Zusammenfassung

Die Aufrechterhaltung eines gesunden Proteoms ist für die Zell- und Organismushomöostase unerlässlich. Die Störung des Gleichgewichts zwischen ProteintranslationalKontrolle und Abbau löst eine Vielzahl altersbedingter Krankheiten aus. Der Rückgang der Proteostase-Qualitätskontrollmechanismen ist ein Kennzeichen des Alterns. Biochemische Methoden zum Nachweis der de novo Proteinsynthese sind noch begrenzt, haben mehrere Nachteile und können nicht in lebenden Zellen oder Tieren durchgeführt werden. Caenorhabditis elegans, transparent und leicht gentechnisch verändert, ist ein ausgezeichnetes Modell, um die Proteinsyntheseraten mit bildgebenden Verfahren zu überwachen. Hier führen wir eine Methode zur Messung der de novo Proteinsynthese in vivo durch Fluoreszenzrückgewinnung nach Photobleicharbeiten (FRAP) ein. Transgene Tiere, die fluoreszierende Proteine in bestimmten Zellen oder Geweben exzieren, werden durch eine leistungsstarke Lichtquelle bestrahlt, was zu Fluoreszenzphotobleichungen führt. Die Bewertung der Fluoreszenzrückgewinnung bedeutet wiederum eine neue Proteinsynthese in Zellen und/oder Geweben von Interesse. Daher kann die Kombination von transgenen Nematoden, genetischen und/oder pharmakologischen Interventionen zusammen mit live-imaging von Proteinsyntheseraten Licht auf Mechanismen werfen, die den altersabhängigen Proteostasekollaps vermitteln.

Einleitung

Proteinsynthese und Abbau ist wichtig für die Muskelhomöostase. Eine Vielzahl altersbedingter Krankheiten wird durch fehlerhafte Proteinproduktion^1,2angezettelt. Um die globalen Protein-Translationsraten zu messen, gibt es biochemische Techniken wie ribosomale simpering, die eine tiefe Sequenzierung von ribosomgeschützten mRNA-Fragmenten zur Überwachung der Expression sowie der neuartigen Proteinsynthese³beinhaltet. Diese Methode ist nicht nur eine indirekte Auslesung von Translationsraten, da eine erhöhte RNA-Assoziation zu Ribosomen nicht notwendigerweise eine erhöhte Translation bedeutet, technische Nachteile wie hohe Kosten und den Bedarf an einer großen Menge an Ausgangsmaterial. Andererseits ermöglichen Proteomik-basierte Methoden eine direkte Proteinquantifizierung durch pulsmetabolische Profilierung, gefolgt von der Massenspektrometrieanalyse^4,5. Dies ist jedoch ein semi-quantitativer Ansatz mit begrenzter zeitlicher Auflösung, der nicht einfach in vivo verwendet werden kann. Darüber hinaus kann die Kennzeichnung des Proteins ungleich im Voninteresse habenden Tier/Gewebe verteilt werden. Wichtig ist, dass beide Methoden gewebespezifische bzw. zellspezifische Variationen der Protein-Translationsraten bei ganzen Tieren bzw. Geweben verbergen können.

Caenorhabditis elegans ist ein einfach zu bedienender Modellorganismus, der in großen^Zahlen6 angebaut werden kann. Darüber hinaus ermöglichen seine genetische Amenabilität und Transparenz eine Live-Bildgebung in vivo. Dieses Protokoll beschreibt die Methodik zum Nachweis von Proteinsyntheseraten mittels Fluoreszenzrückgewinnung nach Photobleicharbeiten (FRAP). Wir nutzen die transgene Expression fluoreszierender Proteine, entweder im gesamten Organismus oder in bestimmten Geweben/Zellen. Transgene Tiere können entweder GFP mit dem Promotor eines Gens, das weit/global exprimiert ist, oder eines gewebespezifischen Promotors exprimieren, um bestimmte Zelltypen anzusprechen. Diese Technik kann auf einen bestimmten Promotor erweitert werden, um die Proteinsyntheseraten eines bestimmten Proteins zu untersuchen.

Protokoll

HINWEIS: Sowohl transkriptionale als auch translationale Fusionen zu Fluorophoren können verwendet werden, um die De-Novo-Proteintranslation in mehreren Geweben zu bewerten. Proteinsyntheseraten können für mehrere Proteinfamilien bewertet werden, die in verschiedenen Zellkompartimenten lokalisiert sind, einschließlich Zytoplasma, Mitochondrien und Kern⁷. Die folgenden Stämme werden verwendet, um globale und neuronale Proteinsyntheseraten zu überwachen, N2; Ex[p_ife-2GFP, pRF4], ife-2(ok306); Ex[p_ife-2GFP, pRF4], N2; Ex[p_unc-119GFP, pRF4], edc-3(ok1427); Ex[p_unc-119GFP, pRF4], N2; Ex[p_sod-3GFP; pRF4]

1. Wartung, Synchronisation und Herstellung von transgenen Nematoden zur Überwachung der de novo Proteinsynthese

1. Verwenden Sie ein sezierendes Stereomikroskop, um die Entwicklungsstadien und das Wachstum von Wildtyp (Wt) und mutierten transgenen Nematoden zu bewerten.
2. Tag 1: Verwenden Sie einen Wurmpick, um 10 L4-Larven von gewandunden und mutierten transgenen Tieren auszuwählen und zu übertragen, die den gewünschten fluoreszierenden Reporter auf Nematode Growth Media (NGM)-Platten tragen, die mit Escherichia coli (OP50) gesät sind (Tabelle 1).
   1. Machen Sie einen Wurm picken, indem Sie einen Platindraht an das verjüngte Ende einer glasigen Pasteurpipette befestigen, indem Sie das Glas an der Kontaktstelle auf einem Bunsenbrenner schmelzen. Anschließend wird das Ende des Platindrahtes mit einem beliebigen Werkzeug (z. B. Zange oder Leichter Hammer) in eine Spachtelform abgeflacht.
   2. Eine einzelne Kolonie von E. coli (OP50)-Bakterien in einen Kolben mit 50 ml flüssigem Medium Luria-Bertani (LB) zu impfen und 10 Stunden bei 37 °C in einem Schüttelinkubator (200 U/min; Tabelle 1). Dann samen NGM-Platten mit 200 L Bakterienkultur. Inkubieren Sie die gesäten Platten bei Raumtemperatur über Nacht, um das Wachstum des bakteriellen Rasens zu ermöglichen.
3. Die Nematoden bei der Standardtemperatur von 20 °C inkubieren und anbauen.
4. Tag 5: Die Platten enthalten eine gemischte Population von transgenen Würmern. Wählen und übertragen Sie 15 L4-Larven jeder Sorte auf frisch gesäte OP50-NGM-Platten.
5. Tag 6: Führen Sie FRAP-Assay durch und überwachen Sie die Proteinsyntheserate am ersten Tag des Erwachsenenalters.
6. Vorbereiten und verwenden Sie Cycloheximid, das NGM-Platten enthält, als Positivkontrolle:
   HINWEIS: Bereiten Sie eine Stammlösung mit Cycloheximid vor, indem Sie in Wasser auf eine Konzentration von 10 mg/ml verdünnen. Lagerlösung bei 4 °C halten.
   1. Töten Sie Bakterien, indem Sie die gesäten NGM-Platten 15 Minuten lang mit UV-Licht (222 W/cm² Intensität) freisetzen.
   2. Fügen Sie Cycloheximid auf bakteriellen Platten auf 500 g/ml Endkonzentration im Agarvolumen hinzu.
   3. Teller 30 Minuten bei Raumtemperatur trocknen lassen.
   4. Transgene Nematoden, die p_sod-3GFP auf Fahrzeug- und Cycloheximid-haltigen Platten exdrücken, übertragen.
   5. Tiere 2 h bei der Standardtemperatur von 20 °C bebrüten.

2. FRAP-Test mit transgenen Tieren, die somatische Gewebereporter p_ife-2GFP und p_sod-3GFP exzessiieren

HINWEIS: Überwachen Sie die globale Proteinsyntheserate im gesamten Tierkörper. Diese Transkriptionsreporter präsentieren unterschiedliche Expressionsniveaus und werden allgegenwärtig in mehreren somatischen Geweben ausgedrückt, einschließlich Darm-, Rachen- und Körperwandmuskeln.

1. Pflücken und übertragen Sie 1 Tage erwachsene transgene Tiere auf einzelne NGM-Platten, die mit einem 20-L-OP50-Tropfen in der Mitte gesät sind.
2. Entfernen Sie den Deckel und legen Sie jede Platte unter eine 20-fache Objektivlinse eines Epifluoreszenzmikroskops.
3. Fokussieren und erfassen Sie ein Referenzbild vor dem Photobleichen (Vorbleichen).
4. Photoble jede Probe für 10 Minuten.
   HINWEIS: Stoppen Sie die Photobleiche, wenn das fluoreszierende Signal auf 30 – 50% Intensität im Vergleich zum Vorbleichen abgeschreckt wird. Die Lichtintensität und die Dauer der Bleichzeit sollten entsprechend an das spezifische Fluorophor, das Tierstadium und die zu untersuchende Zelle oder das zu untersuchende Gewebe angepasst werden. Die angemessene Dauer der Bestrahlung, die erforderlich ist, um ein angemessenes Ausmaß der Photobleichung zu erreichen, sollte für verschiedene Proben experimentell bestimmt werden.
5. Erfassen Sie ein Bild nach dem Photobleichen (Bleaching).
6. Halten Sie die Tiere in einzelnen NGM-Platten und lassen Sie sie sich erholen.
7. Bild und aufzeichnung die Wiederherstellung jedes fluoreszierenden Reporters alle 1 Stunde für mindestens 6 Stunden an einem Fluoreszenz-Stereomikroskop.
8. Alternativ können Sie eine fluoreszierende Rückgewinnungsbewertung mithilfe eines Epifluoreszenzmikroskops (z. B. AxioImager Z2) durchführen.
9. Bewerten Sie sorgfältig die Tiergesundheit pro Tier, indem Sie ihre Fortbewegung, Berührungsempfindlichkeit, Fortpflanzungsfähigkeit und Überleben in den nächsten 3 Tagen überwachen. Nematoden, die Nach der Photobleiche Anzeichen von Schäden zeigten, wurden von der weiteren Analyse ausgeschlossen.

3. Montage der Proben und Durchführung von FRAP-Assay mit transgenen Nematoden, die panneuronal zytoplasmatisches GFP, p_unc-119GFP

HINWEIS: Überwachen Sie die panneuronale Proteinsynthese durch gezielte Photobleaching im Kopfbereich, in dem sich der Nervenring befindet.

1. Bereiten Sie 2% Agarose-Pads vor.
2. Fügen Sie in der Mitte des Agarose-Pads einen 10-L-Tropfen M9-Puffer hinzu.
3. Transfer 5 transgene Nematoden, die panneuronal zytoplasmatisches GFP exdrücken, in einen Tropfen M9-Puffer.
4. Verwenden Sie eine Wimper, um die Flüssigkeit zu verbreiten.
   HINWEIS: Tiere zeigen reduzierte Bewegungen innerhalb von 2 Minuten aufgrund der M9-Absorption in den Agar an.
5. Ändern Sie die Nematodenposition, um Überlappungen zu vermeiden, indem Sie eine "Wimpern"-Auswahl verwenden.
6. Platzieren Sie die Probe unter einer 40-fachen Objektivlinse eines Epifluoreszenzmikroskops.
   HINWEIS: Verwenden Sie keinen Deckzettel.
7. Fokussieren und erfassen Sie ein Referenzbild (Vorbleichen).
8. Photoble den Zielbereich von Interesse für 90 Sekunden.
   HINWEIS: Stoppen Sie die Photobleiche, wenn das fluoreszierende Signal auf 30 – 50% Intensität im Vergleich zum Vorbleichen abgeschreckt wird. Die Lichtintensität und die Dauer der Bleichzeit sollten entsprechend an das spezifische Fluorophor, das Tierstadium und die zu untersuchende Zelle oder das zu untersuchende Gewebe angepasst werden. Die angemessene Dauer der Bestrahlung, die erforderlich ist, um ein angemessenes Ausmaß der Photobleichung zu erreichen, sollte für verschiedene Proben experimentell bestimmt werden.
9. Erfassen Sie ein Bild nach dem Photobleichen (Bleaching).
10. Fügen Sie einen 10-L-Tropfen M9-Puffer auf photobleached Nematoden hinzu.
11. Lassen Sie die Tiere für 5 Minuten erholen.
12. Verwenden Sie die "Wimpern" Pick oder eine Pipette, um die Nematoden auf einzelne NGM-Platten mit 20 L OP50 Tropfen in der Mitte gesät zu übertragen.
13. Erfassen Sie alle 1 Stunde ein Bild jeder Probe unter einem Epifluoreszenz-Stereomikroskop.
    HINWEIS: Zählen Sie t=0 für die Erholungszeit nach dem Photobleichvorgang.

4. Datenanalyse der Bildaufnahme während des FRAP-Assays

1. Analysieren Sie die aufgenommenen Bilder mit Software (z. B. Fidschi).
2. Öffnen Sie Bilder mit der Software.
3. Wählen Sie den Befehl Kanäle teilen über das Dropdown-Menü Bild und Farbe aus.
   HINWEIS: Behalten Sie das Grüne Kanalbild bei.
4. Verwenden Sie das Freehand Selection Tool, um den fluoreszierenden Bereich manuell einzustellen (z. B. Ganzkörper, Kopf, Darm).
5. Wählen Sie den Befehl Messung über das Dropdown-Menü Analysieren aus, um die mittlere Pixelintensität des Interessenbereichs für jeden Zeitpunkt zu messen.
   HINWEIS: Der Prozentsatz der Fluoreszenzwiederherstellung wird anhand der Referenzbilder berechnet, die nach dem Photobleichen aufgenommen wurden.

5. Statistische Auswertung melden

1. Verwenden Sie mindestens 20 – 25 Nematoden jeder Sorte und/oder Bedingung.
   HINWEIS: Es sollten drei biologische Repliken durchgeführt werden.
2. Führen Sie den Studenten-t-Test(Vergleich zwischen zwei Gruppen) oder ANOVA (Vergleich mehrerer Gruppen) für statistische Analysen mit P < 0,05 als signifikant mit statistischer Analysesoftware durch.

Ergebnisse

Mit dem hier vorgestellten Verfahren wurden Wildtyp und mutierte transgene Nematoden, die die folgenden somatischen Reporter, p_ife-2GFP, p_sod-3GFP und p_unc-119GFP ausdrückten, zur Beurteilung der Proteinsyntheseraten nach den jeweiligen Protokollen verwendet. Insbesondere wildartige und ife-2-mutierte Würmer, die zytoplasmatisches GFP in ihrem gesamten somatischen Gewebe exzättierten, wurden mit dem ife-2-P...

Diskussion

Die Proteinsynthesemodulation ist für die Muskelhomöostase unerlässlich. Während des Alterns wird die globale und spezifische Proteinsynthese gestört. Jüngste Studien zeigen, dass das Protein-Translation-Balance-Gleichgewicht die Seneszenz direkt steuert und das Altern nicht nur ein Nebenprodukt des Alterungsprozesses ist. Insbesondere Kernkomponenten der Übersetzungsmaschinerie wie der eukaryotische Initiationsfaktor 4E (eIF4E), der die mRNA-Kappung während der Translationsinitiierung und damit die Rate der cap-...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Sigma-Aldrich	5040
Agarose	Biozym	8,40,004
Agarose pads 2%
Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O)	Sigma-Aldrich	C5080
Cholesterol	SERVA Electrophoresis	17101.01
cycloheximide	Sigma-Aldrich	C-7698
Dissecting stereomicroscope	Nikon Corporation		SMZ645
edc-3(ok1427);Ex[punc-119GFP, pRF4]	Tavernarakis lab		Maintain animals at 20 °C
Epifluorescence microscope	Zeiss		Axio Imager Z2
Escherichia coli OP50 strain	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Fluorescence dissecting stereomicroscope	Zeiss		SteREO Lumar V12
Greiner Petri dishes (60 x 15 mm)	Sigma-Aldrich	P5237
ife-2(ok306);Ex[pife-2GFP, pRF4]	Tavernarakis lab		Maintain animals at 20 °C
image analysis software	Fiji		https://fiji.sc
KH2PO4	EMD Millipore	1,37,010
K2HPO4	EMD Millipore	1,04,873
LB liquid medium
M9 buffer
Magnesium sulfate (MgSO4)	Sigma-Aldrich	M7506
Microscope slides (75 x 25 x 1 mm)	Marienfeld, Lauda-Koenigshofen	10 006 12
Microsoft Office 2011 Excel software package	Microsoft Corporation, Redmond, USA
N2;Ex[pife-2GFP; pRF4]	Tavernarakis lab		Maintain animals at 20 °C
N2;Ex[psod-3GFP; pRF4]	Tavernarakis lab		Maintain animals at 20 °C
N2;Ex[punc-119GFP; pRF4]	Tavernarakis lab		Maintain animals at 20 °C
Na2HPO4	EMD Millipore	1,06,586
Nematode growth medium (NGM) agar plates
Nystatin stock solution	Sigma-Aldrich	N3503
Peptone	BD, Bacto	211677
Phosphate buffer
Sodium chloride (NaCl)	EMD Millipore	1,06,40,41,000
Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.)
Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.).
statistical analysis software	GraphPad Software Inc., San Diego, USA		GraphPad Prism software package
Streptomycin	Sigma-Aldrich	S6501
UV Crosslinker	Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254
Worm pick