הערכה של דה נובו חלבון סינתזה שיעורי Caenorhabditis elegans

Summary

כאן, אנו מציגים ומתארים שיטה לא רדיואקטיבית ולא פולשנית כדי להעריך סינתזת חלבון דה נובו ב vivo, ניצול elegans caenorhabditis נמטודה והתאוששות פלואורסצנציה לאחר photobleaching (FRAP). שיטה זו יכולה להיות משולבת עם מסכים גנטיים ו/או תרופתיים כדי לזהות אפנונים חדשניים של סינתזת חלבונים.

Abstract

שמירה על פרוטאום בריא חיוני עבור תא והומטזיס אורגני. אידיאום האיזון בין שליטה תרגום חלבון והשפלה תירגם מספר רב של מחלות הקשורות לגיל. ירידה של מנגנוני בקרת איכות proteostasis הוא סימן ההיכר של הזדקנות. שיטות ביוכימיות לזיהוי סינתזת חלבון דה נובו עדיין מוגבלות, יש מספר חסרונות ולא ניתן לבצע בתאים חיים או בעלי חיים. Caenorhabditis elegans, להיות שקוף ומהונדס גנטית בקלות, הוא מודל מצוין כדי לפקח על שיעורי סינתזת חלבון באמצעות טכניקות הדמיה. כאן, אנו מציגים ומתארים שיטה למדוד סינתזת חלבון דה נובו ב vivo ניצול התאוששות פלואורסצנט לאחר פוטובלאצ'י (FRAP). בעלי חיים טרנסגניים המביעים חלבוני פלורסנט בתאים או ברקמות ספציפיים מופרים על ידי מקור אור רב עוצמה וכתוצאה מכך פוטו-בליח פלואורסצנטי. בתורו, הערכה של התאוששות פלואורסץ מסמל סינתזת חלבון חדשה בתאים ו / או רקמות של עניין. לפיכך, השילוב של נמטודות טרנסגנית, התערבויות גנטיות ו/או פרמקולוגיות יחד עם הדמיה חיה של שיעורי סינתזת חלבונים יכול לשפוך אור על מנגנונים בתיווך קריסת פרוטאוסטזיס תלויי גיל.

Introduction

סינתזת חלבון והשפלה חיוניים להומיאוסטזיס אורגני. מספר רב של מחלות הקשורות לגיל הם יזם על ידי ייצור חלבון פגום^1,,2. על מנת למדוד את שיעורי תרגום חלבון גלובליים, ישנן טכניקות ביוכימיות כגון פרופיל ריבוזומאל, אשר כרוך רצף עמוק של שברי mRNA מוגן ריבוזום כדי לפקח על הביטוי, כמו גם סינתזת חלבון רומן³. שיטה זו, מלבד היותו קריאה עקיפה של שיעורי תרגום, כמו שיוך RNA מוגברת לriבוזומים לא בהכרח אומר תרגום מוגבר, יש חסרונות טכניים, כגון עלות גבוהה ודרישה של כמות גדולה של חומר התחלה. מצד שני, שיטות מבוססות פרוטאומיקה מאפשרות כימות חלבון ישיר על ידי פרופיל חילוף החומרים של הדופק ואחריו ניתוח ספקטרומטריה^{מסה 4,5}. עם זאת, זוהי גישה חצי כמותית עם רזולוציה זמנית מוגבלת שלא ניתן להשתמש בה בקלות ב-vivo. יתר על כן, תיוג של החלבון יכול להיות מופץ באופן לא שווה בבעלי חיים / רקמה של עניין. חשוב לציין, שתי שיטות אלה יכולות להסתיר וריאציות ספציפיות לרקמות או ספציפיות לתא בשיעורי תרגום חלבונים בבעלי חיים או ברקמות שלמים, בהתאמה.

Caenorhabditis elegans הוא אורגניזם מודל קל לשימוש שניתן לגדול במספרים גדולים⁶. בנוסף, היכולת הגנטית והשקיפות שלה מאפשרות הדמיה חיה ב-vivo. פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה כדי לזהות שיעורי סינתזת חלבון באמצעות התאוששות פלואורסצנט לאחר פוטו-בליסינג (FRAP). אנו מנצלים את הביטוי הטרנסגני של חלבוני פלורסנט, או בכל האורגניזם או ברקמות/תאים ספציפיים. בעלי חיים טרנסגניים עשויים גם לבטא GFP באמצעות היזם של גן, אשר מבוטא באופן נרחב / גלובלי או מקדם ספציפי לרקמות כדי למקד סוגי תאים ספציפיים. טכניקה זו יכולה להיות מורחבת יזם ספציפי כדי לבחון את שיעורי סינתזת חלבון של חלבון מסוים.

Protocol

הערה: ניתן להשתמש הן היתוך שעתוק והן תרגום פלואורופורים כדי להעריך את תרגום חלבון דה נובו במספר רקמות. ניתן להעריך את שיעורי סינתזת החלבון עבור משפחות חלבון מרובות המותאם לתאים תאיים^שונים,כולל ציטופלסמה, מיטוכונדריה וגרעין 7 . הזנים הבאים משמשים כדי לפקח על שיעורי סינתזת חלבון גלובלית ונוירונלית, N2; אקס[p_ife-2GFP, pRF4], ife-2(ok306); אקס[p_ife-2GFP, pRF4], N2; לשעבר[p_unc-119GFP, pRF4], edc-3(ok1427); אקס[p_unc-119GFP, pRF4], N2; לשעבר[p_sod-3GFP; pRF4]

1. תחזוקה, סנכרון והכנה של נמטודות טרנסגנית לניטור סינתזת חלבון דה נובו

1. השתמש stereomicroscope לנתח כדי להעריך את השלבים ההתפתחותיים ואת הצמיחה של סוג בר (wt) ונמטודות טרנסגנית מוטציה.
2. יום 1: השתמש בתולעת לבחור ולהעביר 10 L4 זחלים של wt ומוטציה חיות טרנסגניים נושאות את כתב פלורסנט הרצוי על נמטודה צמיחה מדיה (NGM) צלחות זרעים עם Escherichia קולי (OP50) (טבלה 1).
   1. בצע איסוף תולעים על ידי חיבור חוט פלטינה לתוך הקצה המ מחודד של פיפטה פסטר זכוכית על ידי המסת הזכוכית באתר הקשר על מבער Bunsen. לאחר מכן, לשטח את קצה חוט הפלטינה לתוך צורת מרית באמצעות כל כלי (למשל, מלקחיים או פטיש אור).
   2. לחסן מושבה אחת של E. coli (OP50) חיידקים לתוך בקבוקון המכיל 50 מ"ל של Luria-Bertani (LB) נוזלי בינוני ולגדול במשך 10 שעות ב 37 ° C באינקובטור רועד (200 סל"ד; שולחן 1). לאחר מכן, זרע צלחות NGM עם 200 μL של תרבות חיידקים. דגירה צלחות זרע בטמפרטורת החדר בן לילה כדי לאפשר את הצמיחה של הדשא החיידקי.
3. דגירה ומגדלים את הנמטודות בטמפרטורה הסטנדרטית של 20 מעלות צלזיוס.
4. יום 5: הצלחות מכילות אוכלוסייה מעורבת של תולעים טרנסגנית. בחר והעבר 15 זחלי L4 של כל זן על לוחות OP50-NGM שנזרעו זה עתה.
5. יום 6: לבצע תסוואי FRAP ולפקח על קצב סינתזת חלבון ביום 1 של הבגרות.
6. הכן והשתמש ציקלוהקסמיד המכיל לוחות NGM כפקד חיובי:
   הערה: להכין פתרון מניות של ציקלוהאקסמיד על ידי דילול במים לריכוז של 10 מ"ג/מ"ל. שמור על פתרון מלאי ב-4°C.
   1. להרוג חיידקים על ידי חשיפת צלחות NGM זריעה במשך 15 דקות עם אור UV (222 μW / ס"מ² עוצמה).
   2. להוסיף ציקלוהאקסמיד על גבי צלחות זרעים חיידקיים 500 μg / מ"ל ריכוז סופי בנפח אגר.
   3. אפשרו להצלחות להתייבש בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
   4. העבר נמטודות טרנסגנית המביעות P_sod-3GFP על כלי רכב וצלחות המכילות ציקלוהקסמיד.
   5. דגירה בעלי חיים במשך 2 שעות בטמפרטורה סטנדרטית של 20 מעלות צלזיוס.

2. תסיסה FRAP באמצעות בעלי חיים טרנסגנית המביעים כתבים רקמות סומטיות p_ife-2GFP ו p_sod-3GFP

הערה: לפקח על קצב סינתזת חלבון גלובלי בכל גוף החי. כתבים שעתוק אלה מציגים רמות ביטוי שונות ומתבטאים בכל מקום ברקמות סומטיות מרובות, כולל שרירי מעיים, לוע וקיר גוף.

1. לקטוף ולהעביר 1 יום מבוגר בעלי חיים טרנסגנית לוחיות NGM בודדים נזרעו עם 20 μL OP50 ירידה במרכז.
2. הסר את המכסה והיכנסו כל צלחת מתחת לעדשה אובייקטיבית של פיפלואורסצינציה.
3. התמקד וצלם תמונת ייחוס לפני פוטו-בליך (קדם-אקונומיקה).
4. פוטובלאץ' כל דגימה למשך 10 דקות.
   הערה: הפסק את ההתבקות כאשר אות הפלורסנט מרווה לעוצמה של 30% – 50% ביחס לתמונה שלפני ההלבנה. עוצמת האור ומשך תקופת ההלבנה יש להתאים בהתאם לפלואורופור הספציפי, שלב בעלי חיים ותא או רקמה בבדיקה. משך ההתערה המתאים הנדרש כדי להגיע להיקף מספיק של פוטו-בליך, עבור דגימות שונות יש לקבוע באופן ניסיוני.
5. לכוד תמונה לאחר פוטו-בליח (אקונומיקה).
6. לשמור על בעלי חיים צלחות NGM בודדים ולתת להם להתאושש.
7. תמונה ותיעוד ההתאוששות של כל כתב פלורסנט כל שעה לפחות 6 שעות בסטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי.
8. לחלופין, לבצע הערכת שחזור פלורסנט באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence (למשל, אקסיואמגר Z2).
9. להעריך בקפידה את בריאות בעלי החיים לכל בעל חיים על ידי ניטור הקטר שלהם, רגישות למגע, יכולת הרבייה והישרדות במהלך 3 הימים הבאים. נמטודות המציגות סימנים של נזק לאחר פוטו-בלייוח לא נכללו בניתוח נוסף.

3. הרכבה הדגימות ולבצע אסייג FRAP באמצעות נמטודות טרנסגנית המביעים GFP צטופלסמי פאן-עצבי, p_unc-119GFP

הערה: לפקח על סינתזת חלבון פאן-עצבי על ידי פוטו-בליכות ממוקדת באזור הראש, שבו טבעת עצבית ממוקמת.

1. הכן 2% רפידות agarose.
2. הוסף טיפה 10 μL של מאגר M9 למרכז משטח agarose.
3. להעביר 5 נמטודות טרנסגנית המביעות GFP צטופלסמי פאן-נוירונלית לטיפה של מאגר M9.
4. השתמש בריס כדי לפזר את הנוזל.
   הערה: בעלי חיים מציגים תנועות מופחתות בתוך 2 דקות בשל ספיגת M9 לתוך הגר.
5. שנה את מיקום הנמטודה כדי להימנע מחפיפה באמצעות לקטוף "ריס".
6. מניחים את הדגימה מתחת לעדשה אובייקטיבית של פיפלורסציה של 40x של מיקרוסקופ אפיפלואורסצינציה.
   הערה: אין להשתמש בסיכה.
7. התמקד וללכוד תמונת ייחוס (קדם-אקונומיקה).
8. פוטובלאץ' אזור העניין הממועד למשך 90 שניות.
   הערה: הפסק את ההתבקות כאשר אות הפלורסנט מרווה לעוצמה של 30% – 50% ביחס לתמונה שלפני ההלבנה. עוצמת האור ומשך תקופת ההלבנה יש להתאים בהתאם לפלואורופור הספציפי, שלב בעלי חיים ותא או רקמה בבדיקה. משך ההתערה המתאים הנדרש כדי להגיע להיקף מספיק של פוטו-בליך, עבור דגימות שונות יש לקבוע באופן ניסיוני.
9. לכוד תמונה לאחר פוטו-בליח (אקונומיקה).
10. הוסף טיפה 10 μL של מאגר M9 על נמטודות פוטו-בלונות.
11. תן לחיות להתאושש למשך 5 דקות.
12. השתמש במפרט "ריס" או בפיפטה כדי להעביר את הנמטודות ללחליות NGM בודדות שנזרעו עם 20 μL OP50 טיפה במרכז.
13. צלם תמונה של כל דגימה כל שעה תחת סטריאומיקרוסקופ אפיפלואורסץ.
    הערה: ספירה t = 0 עבור זמן השחזור לאחר פוטו-בליך.

4. ניתוח נתונים של תמונות ללכוד במהלך אחסון FRAP

1. נתח את התמונות שנרכשו באמצעות תוכנה (לדוגמה, פיג'י).
2. פתח תמונות עם התוכנה.
3. בחרו בפקודה 'פצל ערוצים' באמצעות התפריט הנפתח 'תמונה וצבע'.
   הערה: שמור את תמונת הערוץ הירוק.
4. השתמש בכלי בחירת יד חופשית כדי להגדיר באופן ידני את אזור הפלורסנט של עניין (למשל, כל הגוף, הראש, המעי).
5. בחרו בפקודה 'מדידה' באמצעות התפריט הנפתח 'נתח' כדי למדוד עוצמת פיקסלים ממוצעת של אזור העניין עבור כל נקודת זמן.
   הערה: אחוז שחזור הפלואורסצנס מחושב באמצעות תמונות ההפניה שצולמו לאחר אחסון פוטו-בליי.

5. דווח על ניתוח סטטיסטי

1. השתמש לפחות 20 – 25 נמטודות של כל זן ו / או מצב.
   הערה: יש לבצע שלושה משכפלים ביולוגיים.
2. בצע סטודנט t-מבחן(השוואה בין שתי קבוצות) או ANOVA (השוואה בין קבוצות מרובות) לניתוח סטטיסטי עם P < 0.05 כמשמעותי באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטי.

תוצאות

באמצעות ההליך המוצג כאן, סוג בר ונמטודות טרנסגנית מוטציה לבטא את הכתבים סומטי הבאים, p_ife-2GFP, p_sod-3GFP ו p_unc-119GFP, שימשו כדי להעריך את שיעורי סינתזת חלבון על פי הפרוטוקולים המתאימים. במיוחד, סוג פראי ife-2 תולעים מוטציה המביעים GFP צטופלסמי לא...

Discussion

אפנון סינתזה חלבון חיוני עבור הומיאוסטזיס אורגני. במהלך ההזדקנות, סינתזת חלבון גלובלית, כמו גם ספציפית הוא מוטרד. מחקרים שנעשו לאחרונה חושפים את העובדה שאיזון תרגום חלבונים שולט ישירות בסנסנס והזדקנות אינו רק תוצר לוואי של תהליך ההזדקנות. בפרט, רכיבים מרכזיים של מכונות התרגום כגון גורם ח?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Sigma-Aldrich	5040
Agarose	Biozym	8,40,004
Agarose pads 2%
Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O)	Sigma-Aldrich	C5080
Cholesterol	SERVA Electrophoresis	17101.01
cycloheximide	Sigma-Aldrich	C-7698
Dissecting stereomicroscope	Nikon Corporation		SMZ645
edc-3(ok1427);Ex[punc-119GFP, pRF4]	Tavernarakis lab		Maintain animals at 20 °C
Epifluorescence microscope	Zeiss		Axio Imager Z2
Escherichia coli OP50 strain	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Fluorescence dissecting stereomicroscope	Zeiss		SteREO Lumar V12
Greiner Petri dishes (60 x 15 mm)	Sigma-Aldrich	P5237
ife-2(ok306);Ex[pife-2GFP, pRF4]	Tavernarakis lab		Maintain animals at 20 °C
image analysis software	Fiji		https://fiji.sc
KH2PO4	EMD Millipore	1,37,010
K2HPO4	EMD Millipore	1,04,873
LB liquid medium
M9 buffer
Magnesium sulfate (MgSO4)	Sigma-Aldrich	M7506
Microscope slides (75 x 25 x 1 mm)	Marienfeld, Lauda-Koenigshofen	10 006 12
Microsoft Office 2011 Excel software package	Microsoft Corporation, Redmond, USA
N2;Ex[pife-2GFP; pRF4]	Tavernarakis lab		Maintain animals at 20 °C
N2;Ex[psod-3GFP; pRF4]	Tavernarakis lab		Maintain animals at 20 °C
N2;Ex[punc-119GFP; pRF4]	Tavernarakis lab		Maintain animals at 20 °C
Na2HPO4	EMD Millipore	1,06,586
Nematode growth medium (NGM) agar plates
Nystatin stock solution	Sigma-Aldrich	N3503
Peptone	BD, Bacto	211677
Phosphate buffer
Sodium chloride (NaCl)	EMD Millipore	1,06,40,41,000
Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.)
Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.).
statistical analysis software	GraphPad Software Inc., San Diego, USA		GraphPad Prism software package
Streptomycin	Sigma-Aldrich	S6501
UV Crosslinker	Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254
Worm pick