Avaliação das taxas de síntese de proteínas de novo em Caenorhabditis elegans

Resumo

Aqui, introduzimos e descrevemos um método nãoradioativo e não invasivo para avaliar a síntese de proteína de novo in vivo, utilizando o nematode Caenorhabditis elegans e recuperação de fluorescência após fotobleaching (FRAP). Este método pode ser combinado com telas genéticas e/ou farmacológicas para identificar novos moduladores da síntese proteica.

Resumo

Manter um proteome saudável é essencial para a homeostase celular e organismo. A perturbação do equilíbrio entre controle translacional de proteínas e degradação instiga uma infinidade de doenças relacionadas à idade. O declínio dos mecanismos de controle de qualidade da proteostase é uma marca do envelhecimento. Os métodos bioquímicos para detectar a síntese de proteínas de novo ainda são limitados, têm várias desvantagens e não podem ser realizados em células vivas ou animais. Caenorhabditis elegans, sendo transparente e facilmente geneticamente modificado, é um excelente modelo para monitorar as taxas de síntese proteica usando técnicas de imagem. Aqui, introduzimos e descrevemos um método para medir a síntese de proteína de novo in vivo utilizando a recuperação da fluorescência após o fotobleaching (FRAP). Animais transgênicos que expressam proteínas fluorescentes em células ou tecidos específicos são irradiados por uma poderosa fonte de luz que resulta em fotobleaching de fluorescência. Por sua vez, a avaliação da recuperação da fluorescência significa nova síntese proteica em células e/ou tecidos de interesse. Assim, a combinação de nematoides transgênicos, intervenções genéticas e/ou farmacológicas, juntamente com imagens vivas das taxas de síntese proteica podem lançar luz sobre mecanismos que mediam o colapso da proteostase dependente da idade.

Introdução

A síntese e a degradação da proteína são essenciais para a homeostase do organismo. Uma infinidade de doenças relacionadas à idade são instigadas pela produção de proteína defeituosa^1,,2. Para medir as taxas globais de tradução de proteínas, existem técnicas bioquímicas, como o perfil ribossômico, que envolve sequenciamento profundo de fragmentos de mRNA protegidos por ribossomos para monitorar a expressão, bem como a nova síntese proteica³. Este método, além de ser uma leitura indireta das taxas translacionais, uma vez que o aumento da associação do RNA aos ribossomos não significa necessariamente aumento da tradução, tem desvantagens técnicas, como alto custo e exigência de uma grande quantidade de material inicial. Por outro lado, os métodos baseados em proteômica permitem quantificação direta da proteína por perfil metabólico de pulso seguido de análise de espectrometria de massa^4,,5. No entanto, trata-se de uma abordagem semi-quantitativa com resolução temporal limitada que não pode ser facilmente utilizada in vivo. Além disso, a rotulagem da proteína pode ser desigualmente distribuída no animal/tecido de interesse. É importante ressaltar que ambos os métodos podem ocultar variações específicas de tecidos ou células nas taxas de tradução de proteínas em animais ou tecidos inteiros, respectivamente.

Caenorhabditis elegans é um organismo modelo fácil de usar que pode ser cultivado em grande número⁶. Além disso, sua comodidade genética e transparência permitem imagens ao vivo in vivo. Este protocolo descreve a metodologia para detectar taxas de síntese proteica usando recuperação de fluorescência após fotobleaching (FRAP). Aproveitamos a expressão transgênica de proteínas fluorescentes, seja em todo o organismo ou em tecidos/células específicas. Animais transgênicos podem expressar GFP usando o promotor de um gene, que é amplamente/globalmente expresso ou um promotor específico do tecido para atingir tipos de células específicas. Esta técnica pode ser estendida a um promotor específico para examinar as taxas de síntese proteica de uma proteína específica.

Protocolo

NOTA: Tanto as fusões transcricionais quanto as translacionais aos fluoroforos podem ser usadas para avaliar a tradução de nova proteína em vários tecidos. As taxas de síntese proteica podem ser avaliadas para múltiplas famílias de proteínas localizadas em diferentes compartimentos celulares, incluindo citoplasma, mitocôndrias e núcleo⁷. As seguintes cepas são usadas para monitorar as taxas globais e neuronais de síntese de proteínas, N2; Ex[p_ife-2GFP, pRF4], ife-2(ok306); Ex[p_ife-2GFP, pRF4], N2; Ex[p_unc-119GFP, pRF4], edc-3(ok1427); Ex[p_unc-119GFP, pRF4], N2; Ex[p_sod-3GFP; pRF4]

1. Manutenção, sincronização e preparação de nematoides transgênicos para monitoramento da síntese de proteínas de novo

1. Use um estereótipo dissetante para avaliar os estágios de desenvolvimento e o crescimento de nematoides transgênicos mutantes (wt) e mutantes.
2. Dia 1: Use uma palhadeira para selecionar e transferir 10 larvas L4 de animais transgênicos wt e mutantes carregando o repórter fluorescente desejado para placas de Nematode Growth Media (NGM) semeadas com Escherichia coli (OP50)(Tabela 1).
   1. Faça uma picareta de vermes anexando um fio de platina na extremidade afilada de uma pipeta Pasteur de vidro derretendo o vidro no local de contato em um queimador de Bunsen. Em seguida, achate a extremidade do fio de platina em uma forma de espátula usando qualquer ferramenta (por exemplo, pinça ou martelo leve).
   2. Inocular uma única colônia de bactérias E. coli (OP50) em um frasco contendo 50 mL de meio líquido Luria-Bertani (LB) e crescer por 10 horas a 37 °C em uma incubadora de agitação (200 rpm; Tabela 1). Em seguida, placas de GNL de sementes com 200 μL de cultura bacteriana. Incubar as placas semeadas à temperatura ambiente durante a noite para permitir o crescimento do gramado bacteriano.
3. Incubar e cultivar os nematoides na temperatura padrão de 20 °C.
4. Dia 5: As placas contêm uma população mista de vermes transgênicos. Selecione e transfira 15 larvas L4 de cada cepa em placas OP50-NGM recém-semeadas.
5. Dia 6: Realize o ensaio FRAP e monitore a taxa de síntese de proteínas no primeiro dia da vida adulta.
6. Prepare e use cicloheximida contendo placas de NGM como um controle positivo:
   NOTA: Prepare uma solução de estoque de cicloheximida diluindo na água a uma concentração de 10 mg/mL. Mantenha a solução de estoque a 4 °C.
   1. Mate bactérias expondo as placas de NGM semeadas por 15 minutos com luz UV (intensidade de 222 μW/cm^2).
   2. Adicione cicloheximida em cima de placas bacterianas semeadas a 500 μg/mL de concentração final no volume do ágar.
   3. Deixe as placas secarem à temperatura ambiente por 30 minutos.
   4. Transfira nematoides transgênicos expressando p_sod-3GFP em placas contendo veículos e cicloheximida.
   5. Incubar animais por 2h na temperatura padrão de 20 °C.

2. Ensaio FRAP usando animais transgênicos expressando repórteres de tecido somático p_ife-2GFP e p_sod-3GFP

NOTA: Monitore a taxa global de síntese de proteínas em todo o corpo animal. Esses repórteres transcricionais apresentam diferentes níveis de expressão e são onipresentemente expressos em múltiplos tecidos somáticos, incluindo músculos do intestino, faringe e parede corporal.

1. Escolha e transfira animais transgênicos adultos de 1 dia para placas individuais de GNL semeadas com uma queda de 20 μL OP50 no centro.
2. Remova a tampa e coloque cada placa sob uma lente objetiva de 20x de um microscópio de epifluorescência.
3. Concentre-se e capture uma imagem de referência antes de fotobleaching (pré-alvejante).
4. Fotobleach cada amostra por 10 minutos.
   NOTA: Pare de fazer fotobásma quando o sinal fluorescente for extinto para 30 – 50% de intensidade em relação à imagem pré-branqueamento. A intensidade da luz e a duração do período de branqueamento devem ser ajustadas de acordo para o fluorohore específico, estágio animal e célula ou tecido em exame. A duração adequada da irradiação necessária para atingir uma extensão adequada do fotobleaching, para diferentes espécimes deve ser determinada experimentalmente.
5. Capture uma imagem após fotobleaching (alvejante).
6. Mantenha os animais em placas de GNM individuais e deixe-os se recuperar.
7. Imagem e registro da recuperação de cada repórter fluorescente a cada 1 hora por pelo menos 6 horas em um estereóscópio fluorescência.
8. Alternativamente, realize a avaliação de recuperação fluorescente usando um microscópio de epifluorescência (por exemplo, AxioImager Z2).
9. Avalie cuidadosamente a expectativa de saúde animal por animal monitorando sua locomoção, sensibilidade ao toque, capacidade reprodutiva e sobrevivência nos próximos 3 dias. Nematoides que apresentavam sinais de dano após fotobleaching foram excluídos de análises posteriores.

3. Montagem das amostras e realização de ensaio FRAP utilizando nematoides transgênicos expressando GFP citoplasmático pan-neuronal, p_unc-119GFP

NOTA: Monitore a síntese de proteína pan-neuronal por fotobleaching direcionado na região da cabeça, onde o anel nervoso está localizado.

1. Prepare 2% de almofadas de agarose.
2. Adicione uma gota de 10 μL de tampão M9 ao centro da almofada agarose.
3. Transfira 5 nematoides transgênicos expressando GFP citoplasmica pan-neuronalmente em uma gota de tampão M9.
4. Use um cílio para espalhar o líquido.
   NOTA: Os animais exibem movimentos reduzidos em 2 minutos devido à absorção de M9 no ágar.
5. Altere a posição do nematoide para evitar sobreposição usando uma picareta "cílios".
6. Coloque a amostra sob uma lente objetiva de 40x de um microscópio de epifluorescência.
   NOTA: Não use um tapa-tampa.
7. Concentre-se e capture uma imagem de referência (pré-alvejante).
8. Fotobleach a área de interesse alvo por 90 segundos.
   NOTA: Pare de fazer fotobásma quando o sinal fluorescente for extinto para 30 – 50% de intensidade em relação à imagem pré-branqueamento. A intensidade da luz e a duração do período de branqueamento devem ser ajustadas de acordo para o fluorohore específico, estágio animal e célula ou tecido em exame. A duração adequada da irradiação necessária para atingir uma extensão adequada do fotobleaching, para diferentes espécimes deve ser determinada experimentalmente.
9. Capture uma imagem após fotobleaching (alvejante).
10. Adicione uma gota de 10 μL de tampão M9 em nematoides fotobleachados.
11. Deixe os animais se recuperarem por 5 minutos.
12. Use a picareta "cílios" ou uma pipeta para transferir os nematoides para placas NGM individuais semeadas com 20 μL OP50 drop no centro.
13. Capture uma imagem de cada amostra a cada 1 hora sob um estereóscópio de epifluorescência.
    NOTA: Conte t=0 para o tempo de recuperação após fotobleaching.

4. Análise de dados da captura de imagens durante o ensaio FRAP

1. Analise as imagens adquiridas usando software (por exemplo, Fiji).
2. Abra imagens com o software.
3. Selecione o comando Canais divididos através do menu suspenso imagem e cor.
   NOTA: Mantenha a imagem do canal verde.
4. Use a ferramenta Seleção à mão livre para definir manualmente a região fluorescente de interesse (por exemplo, corpo inteiro, cabeça, intestino).
5. Selecione o comando Medição através do menu 'Analisar's's para medir a intensidade média do pixel da área de interesse para cada ponto de partida.
   NOTA: A porcentagem de recuperação da fluorescência é calculada usando as imagens de referência capturadas após o fotobleachamento.

5. Relatório de análise estatística

1. Use pelo menos 20 a 25 nematoides de cada cepa e/ou condição.
   NOTA: Três réplicas biológicas devem ser realizadas.
2. Realizar teste t-estudantis(comparação entre dois grupos) ou ANOVA (comparação entre vários grupos) para análise estatística com P < 0,05 como significativo utilizando software de análise estatística.

Resultados

Utilizando o procedimento aqui apresentado, foram utilizados nematoides transgênicos de tipo selvagem e mutantes expressando os seguintes repórteres somáticos, p_ife-22GFP, p_sod-3GFP e p_unc-119GFP, para avaliar as taxas de síntese proteica de acordo com os respectivos protocolos. Particularmente, vermes mutantes do tipo selvagem e ife-2 expressando GFP citoplasmático em seus tecidos somáticos usando o promoto...

Discussão

A modulação da síntese proteica é essencial para a homeostase do organismo. Durante o envelhecimento, a síntese de proteínas globais e específicas é perturbada. Estudos recentes revelam que o equilíbrio da tradução proteica controla diretamente a senescência e o envelhecimento não é meramente um subproduto do processo de envelhecimento. Em particular, componentes centrais da máquina de tradução, como o fator de iniciação eucariótica 4E (eIF4E), que facilita o capping de mRNA durante a iniciação da t...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Sigma-Aldrich	5040
Agarose	Biozym	8,40,004
Agarose pads 2%
Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O)	Sigma-Aldrich	C5080
Cholesterol	SERVA Electrophoresis	17101.01
cycloheximide	Sigma-Aldrich	C-7698
Dissecting stereomicroscope	Nikon Corporation		SMZ645
edc-3(ok1427);Ex[punc-119GFP, pRF4]	Tavernarakis lab		Maintain animals at 20 °C
Epifluorescence microscope	Zeiss		Axio Imager Z2
Escherichia coli OP50 strain	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Fluorescence dissecting stereomicroscope	Zeiss		SteREO Lumar V12
Greiner Petri dishes (60 x 15 mm)	Sigma-Aldrich	P5237
ife-2(ok306);Ex[pife-2GFP, pRF4]	Tavernarakis lab		Maintain animals at 20 °C
image analysis software	Fiji		https://fiji.sc
KH2PO4	EMD Millipore	1,37,010
K2HPO4	EMD Millipore	1,04,873
LB liquid medium
M9 buffer
Magnesium sulfate (MgSO4)	Sigma-Aldrich	M7506
Microscope slides (75 x 25 x 1 mm)	Marienfeld, Lauda-Koenigshofen	10 006 12
Microsoft Office 2011 Excel software package	Microsoft Corporation, Redmond, USA
N2;Ex[pife-2GFP; pRF4]	Tavernarakis lab		Maintain animals at 20 °C
N2;Ex[psod-3GFP; pRF4]	Tavernarakis lab		Maintain animals at 20 °C
N2;Ex[punc-119GFP; pRF4]	Tavernarakis lab		Maintain animals at 20 °C
Na2HPO4	EMD Millipore	1,06,586
Nematode growth medium (NGM) agar plates
Nystatin stock solution	Sigma-Aldrich	N3503
Peptone	BD, Bacto	211677
Phosphate buffer
Sodium chloride (NaCl)	EMD Millipore	1,06,40,41,000
Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.)
Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.).
statistical analysis software	GraphPad Software Inc., San Diego, USA		GraphPad Prism software package
Streptomycin	Sigma-Aldrich	S6501
UV Crosslinker	Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254
Worm pick