Оценка показателей синтеза белка de novo в Caenorhabditis elegans

Резюме

Здесь мы вводим и описываем нерадиоактивный и неинвазивный метод оценки синтеза белка de novo in vivo, используя нематоды caenorhabditis elegans и восстановление флуоресценции после фотоблейлинга (FRAP). Этот метод можно комбинировать с генетическими и/или фармакологическими экранами для выявления новых модуляторов синтеза белка.

Аннотация

Поддержание здорового протеома имеет важное значение для клеток и организма гомеостаза. Возмущение баланса между белково-трансляционным контролем и деградацией провоцирует множество возрастных заболеваний. Снижение механизмов контроля качества протеостаза является отличительной чертой старения. Биохимические методы обнаружения синтеза белка de novo по-прежнему ограничены, имеют ряд недостатков и не могут быть выполнены в живых клетках или животных. Caenorhabditis elegans, будучи прозрачным и легко генетически модифицированных, является отличной моделью для мониторинга темпов синтеза белка с помощью методов визуализации. Здесь мы представляем и описываем метод измерения синтеза белка de novo in vivo с использованием восстановления флуоресценции после фотоотливания (FRAP). Трансгенные животные, выражаюющие флуоресцентные белки в определенных клетках или тканях, облучаются мощным источником света, что приводит к фотоотбелу флуоресценции. В свою очередь, оценка восстановления флуоресценции означает новый синтез белка в клетках и/или тканях, представляющих интерес. Таким образом, сочетание трансгенных нематод, генетических и/или фармакологических вмешательств вместе с живой визуализацией скорости синтеза белка может пролить свет на механизмы, ососредуемые возрастной крах протеостаза.

Введение

Синтез и деградация белка имеет важное значение для организма гомеостаза. Множество возрастных заболеваний вызваны дефектным производством белка^1,,2. Для того, чтобы измерить глобальные темпы перевода белка, Существуют биохимические методы, такие как рибосомное профилирование, которое включает в себя глубокое секвенирование рибосомно-защищенных фрагментов мРНК для мониторинга экспрессии, а также^{синтеза нового белка 3}. Этот метод, помимо того, что он является косвенным считыванием переводческих ставок, поскольку увеличение ассоциации РНК с рибосомами не обязательно означает увеличение перевода, имеет технические недостатки, такие, как высокая стоимость и требование большого количества исходного материала. С другой стороны, методы, основанные на протеомике, позволяют напрямую количественно оценить белок путем метаболического профилирования импульса, за которым^{следует анализ масс-спектрометрии 4,,5.} Однако это полуколичеспособный подход с ограниченным временным разрешением, который не может быть легко использован in vivo. Кроме того, маркировка белка может быть неравномерно распределена в животных / тканей, представляющих интерес. Важно отметить, что оба эти метода могут скрывать специфические или клеточные изменения в ставках перевода белка у целых животных или тканей, соответственно.

Caenorhabditis elegans является простой в использовании модель организма, который может быть выращен в больших количествах⁶. Кроме того, его генетическая подмена и прозрачность позволяют живую визуализацию в vivo. Этот протокол описывает методологию обнаружения показателей синтеза белка с помощью восстановления флуоресценции после фотоблейлинга (FRAP). Мы пользуемся трансгенной экспрессией флуоресцентных белков, либо во всем организме, либо в определенных тканях/клетках. Трансгенные животные могут либо выразить GFP с помощью промоутера гена, который широко / глобально выражается или ткани конкретных промоутер для целевых конкретных типов клеток. Этот метод может быть распространен на конкретного промоутера для изучения темпов синтеза белка конкретного белка.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Как транскрипционные, так и трансляционные синтезы флюорофоров могут быть использованы для оценки перевода белка de novo в нескольких тканях. Скорость синтеза белка может быть оценена для нескольких белковых семейств, локализованных в различных клеточных отсеках, включая цитоплазму, митохондрии и^{ядро 7.} Следующие штаммы используются для мониторинга глобальных и нейронных темпов синтеза белка, N2; Ex«p_ife-2GFP, pRF4», ife-2 (ok306); Ex«p_ife-2GFP, pRF4», N2; Ex«p_unc-119GFP, pRF4», edc-3 (ok1427); Ex«p_unc-119GFP, pRF4», N2; Экс-p_sod-3GFP; pRF4

1. Поддержание, синхронизация и подготовка трансгенных нематод для мониторинга синтеза белка de novo

1. Используйте рассечение стереомикроскопа для оценки стадий развития и роста дикого типа (wt) и трансгенных нематод мутантов.
2. День 1: Используйте червя выбрать и передать 10 L4 личинок WT и мутант трансгенных животных, несущих желаемого флуоресцентного репортера на Nematode Рост СМИ (NGM) пластин, посеянных с Escherichia coli (OP50) (Таблица 1).
   1. Сделайте выбор червя путем прикреплять провод платины в конические конца стеклянной пипетки Pasteur путем плавления стекла на месте контакта на горелке Bunsen. Затем разровняйте конец платиновой проволоки в форму шпателя с помощью любого инструмента (например, клеща или легкого молотка).
   2. Привить одну колонию бактерий кишечной палочки (OP50) в колбу, содержащую 50 мл жидкой среды Luria-Bertani (LB) и расти в течение 10 часов при 37 градусах Цельсия в трясущемся инкубаторе (200 об/мин; Таблица 1). Затем, семена NGM пластин с 200 йл бактериальной культуры. Инкубировать семенами пластин при комнатной температуре на ночь, чтобы рост бактериального газона.
3. Инкубировать и выращивать нематод при стандартной температуре 20 градусов по Цельсию.
4. День 5: Пластины содержат смешанную популяцию трансгенных червей. Выберите и перенесите 15 личинок L4 из каждой деформации на свежесеянные пластины OP50-NGM.
5. День 6: Выполните анализ FRAP и контролировать скорость синтеза белка на 1 день взрослой жизни.
6. Подготовка и использование циклохэксимида, содержащего ngM пластины в качестве положительного контроля:
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте стоковое раствор циклохексимида путем разбавления в воде до концентрации 10 мг/мл. Держите фондовый раствор на уровне 4 градусов по Цельсию.
   1. Убейте бактерии, обнажая семенами пластин NGM в течение 15 минут с ультрафиолетовым светом (222 МК/см^{2 интенсивности).}
   2. Добавьте циклохексимид поверх бактериальных семенных пластин до 500 мкг/мл окончательной концентрации в объеме агара.
   3. Разрешить пластины высохнуть при комнатной температуре в течение 30 минут.
   4. Передача трансгенных нематод, выражающих p_sod-3GFP на транспортное средство и циклохэксимидсодержащие пластины.
   5. Инкубировать животных в течение 2 ч при стандартной температуре 20 градусов по Цельсию.

2. FraP анализ с использованием трансгенных животных, выражаюющих соматические_{ткани репортеров р ife-2}GFP_{и р sod-3}GFP

ПРИМЕЧАНИЕ: Мониторинг глобальной скорости синтеза белка во всем теле животного. Эти транскрипционные репортеры представляют различные уровни выражения и повсеместно выражаются в нескольких соматических тканях, включая кишечник, глотку и мышцы стенок тела.

1. Выберите и перенесите 1-дневных взрослых трансгенных животных на отдельные ngM пластины, посеянные с падением 20 йл OP50 в центре.
2. Снимите крышку и поместите каждую пластину под 20-х объектив эпифлюоресценции микроскопа.
3. Сосредоточьтесь и захватит эталонное изображение перед фотоотбелом (до отбеливателя).
4. Photobleach каждый образец в течение 10 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Остановить фотоотбеливание, когда флуоресцентный сигнал угасает до 30 - 50% интенсивности по отношению к предварительному отбеливанию изображения. Интенсивность света и продолжительность периода отбеливания должны быть соответствующим образом скорректированы для конкретного флюорофора, стадии животного происхождения и клеток или тканей, которые находятся под обследованием. Следует экспериментально определить соответствующую продолжительность облучения, необходимую для достижения адекватной степени фотооблечивания, для различных образцов.
5. Захват изображения после фотоотбела (отбеливатель).
6. Храните животных в отдельных пластинах NGM и дайте им восстановиться.
7. Изображение и записывать восстановление каждого флуоресцентного репортера каждые 1 час, по крайней мере 6 часов на флуоресценции стереомикроскоп.
8. Кроме того, выполните флуоресцентную оценку восстановления с помощью эпифлюоресцентного микроскопа (например, AxioImager No2).
9. Тщательно оцените здоровье животных на одно животное, отслеживая их передвижение, сенсорную чувствительность, репродуктивную способность и выживание в течение следующих 3 дней. Нематоды с признаками повреждения после фотоблейинга были исключены из дальнейшего анализа.

3. Монтаж образцов и выполнить анализ FRAP с использованием трансгенных нематод, выражаюющих пан-нейронально цитоплазмической GFP, р_unc-119GFP

ПРИМЕЧАНИЕ: Монитор пан-нейронального синтеза белка путем целевого фотоотчета в области головы, где нервное кольцо находится.

1. Подготовка 2% агарозы колодки.
2. Добавьте 10 мкл капли буфера M9 в центр агарозной площадки.
3. Передача 5 трансгенных нематод, выражаюющих пан-нейронально цитоплазмический GFP в каплю буфера M9.
4. Используйте ресницы для распространения жидкости.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Животные отображают уменьшенные движения в течение 2 минут из-за поглощения M9 в агар.
5. Изменение положения нематод, чтобы избежать перекрытия с помощью "ресницы" забрать.
6. Поместите образец под 40-х объектив эпифлюоресценции микроскопа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте обложку.
7. Сосредоточьтесь и захватит эталонное изображение (до отбеливателя).
8. Фотоотчет целевой области интереса в течение 90 секунд.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Остановить фотоотбеливание, когда флуоресцентный сигнал угасает до 30 - 50% интенсивности по отношению к предварительному отбеливанию изображения. Интенсивность света и продолжительность периода отбеливания должны быть соответствующим образом скорректированы для конкретного флюорофора, стадии животного происхождения и клеток или тканей, которые находятся под обследованием. Следует экспериментально определить соответствующую продолжительность облучения, необходимую для достижения адекватной степени фотооблечивания, для различных образцов.
9. Захват изображения после фотоотбела (отбеливатель).
10. Добавьте 10 мкл капли буфера M9 на фотоотлив нематод.
11. Пусть животные выздоравливают в течение 5 минут.
12. Используйте "ресницы" забрать или пипетки для передачи нематод на отдельные пластины NGM посеяны с 20 йл OP50 падение в центре.
13. Захват изображения каждого образца каждые 1 час под стереомикроскопом эпифлюоресценции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Граф t'0 для времени восстановления после фотоотчета.

4. Анализ данных изображений, полученных во время анализа FRAP

1. Проанализируйте приобретенные изображения с помощью программного обеспечения (например, Фиджи).
2. Открытые изображения с программным обеспечением.
3. Выберите команду Сплит-каналов через меню высадки изображений и цветов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите изображение зеленого канала.
4. Используйте инструмент Freehand Selection, чтобы вручную установить флуоресцентную область интереса (например, все тело, голову, кишечник).
5. Выберите команду измерения с помощью меню «Анализ падения» для измерения означает интенсивность пикселей в области, интересной для каждой точки времени.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Процент восстановления флуоресценции рассчитывается с помощью эталонных изображений, снятых после фотоотливания.

5. Отчетный статистический анализ

1. Используйте по крайней мере 20 - 25 нематод каждого штамма и / или условие.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Три биологические репликации должны быть выполнены.
2. Выполните тест студента t-(сравнение двух групп) или ANOVA (сравнение между несколькими группами) для статистического анализа с P lt; 0.05 как значительное использование программного обеспечения статистического анализа.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Используя представленную здесь процедуру, для оценки скорости синтеза белка в соответствии с соответствующими протоколами использовались трансгенные нематоды дикого типа и мутантные нематоды, выражают следующие соматические репортеры, p_ife-2GFP, p_sod-3

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Модуляция синтеза белка имеет важное значение для организма гомеостаза. Во время старения, глобальный, а также специфический синтез белка возмущен. Недавние исследования показывают тот факт, что баланс перевода белка непосредственно контролирует старение и старение не просто побочны...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Sigma-Aldrich	5040
Agarose	Biozym	8,40,004
Agarose pads 2%
Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O)	Sigma-Aldrich	C5080
Cholesterol	SERVA Electrophoresis	17101.01
cycloheximide	Sigma-Aldrich	C-7698
Dissecting stereomicroscope	Nikon Corporation		SMZ645
edc-3(ok1427);Ex[punc-119GFP, pRF4]	Tavernarakis lab		Maintain animals at 20 °C
Epifluorescence microscope	Zeiss		Axio Imager Z2
Escherichia coli OP50 strain	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Fluorescence dissecting stereomicroscope	Zeiss		SteREO Lumar V12
Greiner Petri dishes (60 x 15 mm)	Sigma-Aldrich	P5237
ife-2(ok306);Ex[pife-2GFP, pRF4]	Tavernarakis lab		Maintain animals at 20 °C
image analysis software	Fiji		https://fiji.sc
KH2PO4	EMD Millipore	1,37,010
K2HPO4	EMD Millipore	1,04,873
LB liquid medium
M9 buffer
Magnesium sulfate (MgSO4)	Sigma-Aldrich	M7506
Microscope slides (75 x 25 x 1 mm)	Marienfeld, Lauda-Koenigshofen	10 006 12
Microsoft Office 2011 Excel software package	Microsoft Corporation, Redmond, USA
N2;Ex[pife-2GFP; pRF4]	Tavernarakis lab		Maintain animals at 20 °C
N2;Ex[psod-3GFP; pRF4]	Tavernarakis lab		Maintain animals at 20 °C
N2;Ex[punc-119GFP; pRF4]	Tavernarakis lab		Maintain animals at 20 °C
Na2HPO4	EMD Millipore	1,06,586
Nematode growth medium (NGM) agar plates
Nystatin stock solution	Sigma-Aldrich	N3503
Peptone	BD, Bacto	211677
Phosphate buffer
Sodium chloride (NaCl)	EMD Millipore	1,06,40,41,000
Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.)
Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.).
statistical analysis software	GraphPad Software Inc., San Diego, USA		GraphPad Prism software package
Streptomycin	Sigma-Aldrich	S6501
UV Crosslinker	Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254
Worm pick