العزلة المتزامنة وثقافة Myocytes الأذينية، myocytes البطينية، وغير Myocytes من قلب فأرة البالغين

Summary

يتم وصف طريقة لعزل في وقت واحد من myocytes وغير myocytes من كل من الأذينين والبطينين من قلب الماوس الكبار واحد. هذا البروتوكول يؤدي إلى نتائج متسقة من myocytes القلب قابلة للحياة للغاية وغير myocytes وتفاصيل الظروف المثلى ثقافة الخلية محددة للphenotyping وفي المختبر التحليل.

Abstract

كانت عزلة واستزراع الخلايا العضلية القلبية من الفئران ضرورية لتعزيز فهم فسيولوجيا القلب والفيزيولوجيا المرضية. في حين أن عزل الخلايا الميوسية من قلوب الماوس حديثي الولادة هو بسيط نسبيا، يتم تفضيل myocytes من قلب مورين الكبار. وذلك لأن بالمقارنة مع خلايا حديثي الولادة، myocytes الكبار بشكل أكثر دقة تمدد الخلية وظيفة كما يحدث في قلب الكبار في الجسمالحي. ومع ذلك ، من الصعب من الناحية الفنية عزل الخلايا القلبية الماوس الكبار في الكميات اللازمة ومقومات البقاء ، مما يساهم في مأزق تجريبي. وعلاوة على ذلك، فإن الإجراءات المنشورة محددة لعزل الخلايا العضلية الأذينية أو البطينية على حساب الخلايا الأذينية والبطينية غير العضلية. هو موضح هنا طريقة مفصلة لعزل كل من الأذينية والبطينية القلبية myocytes، جنبا إلى جنب مع الأذينية والبطين غير myocytes، في وقت واحد من قلب فأر واحد. كما تتوفر تفاصيل عن أساليب زراعة الخلايا المثلى، التي تعزز صلاحية الخلية ووظيفته. هذا البروتوكول يهدف ليس فقط إلى تسريع عملية عزل خلايا القلب مورين الكبار، ولكن أيضا إلى زيادة العائد و قابلية الخلايا للتحقيقات في الخلايا القلبية الأذينية والبطينية.

Introduction

ثقافة الخلية الأساسية هي مورد متكامل يوفر بيئة خاضعة للرقابة للدراسات الميكانيكية التفصيلية لوظيفة myocyte القلبية. نظرا لطبيعتها أكثر دواما وسهولة العزلة، الفئران حديثي الولادة الأذينية والعضية البطينية كانت المصدر الشائع لثقافات الخلايا هذه¹. ومع ذلك، فإن الماوس البالغ الأذيني والبطيني (AMAMs و AMVMs) مرغوب فيه للغاية للدراسات المختبرية، لأن خصائصها الجزيئية والوظيفية تحاكي أفضل خصائص خلايا القلب البالغة. وهكذا ، فقد أصبحت ذات صلة للدراسات المتعلقة بأمراض القلب ، ومعظمها يتطور في البالغين^2.

وعلاوة على ذلك، فإن توافر واستخدام نماذج الماوس المعدلة وراثيا والمرض يوسع فائدة myocytes القلبية للبالغين المعزولة. وقد تم وصف بروتوكولات لعزل وثقافة الماوس AMVMs للدراسات قصيرة وطويلة الأجل في العديد من المنشورات السابقة^{2،3،4،5،6،7،8،9،10،11}. وبالمقارنة، تم وصف عدد قليل من البروتوكولات لعزل AMAMs. وعلاوة على ذلك، هي الأمثل في المقام الأول تلك التي يتم وصفها لإجراء دراسات حادة للخلايا المعزولة حديثا، مع عدم وجود بروتوكول زراعة طويلة الأجل وصفها حتى الآن^11،12،13. وعلى هذا النحو، لم تصمم بروتوكولات العزل في AMM لتوفير فائدة ومرونة البروتوكولات المنشورة لعزل وثقافة المركبات المُمَرَّكة. وعلاوة على ذلك، في حين أن الدراسات الرائدة لعزل AMAMs و AMVMs قد ثبت الحيلة، لا توجد بروتوكولات لعزلة متزامنة مثلى وثقافة كل من AMAMs و AMVMs، مما يؤدي إلى الاستخدام الفعال للقلب كله لكل إعداد.

حتى الآن، لم يتم تصميم بروتوكولات العزل AMAM و AMVM المنشورة لعزل كلا النوعين من الخلايا في وقت واحد، لأن معظم الدراسات على وظيفة الأذينية والبطينية لها تركيز خاص بغرفة معينة. على سبيل المثال، يتم استخدام AMAMs في الغالب لدراسة الفيزيولوجيا الكهربائية الأذينية، ويرجع ذلك جزئيًا إلى الاهتمام بالرجفان الأذيني (AF)، وهو أكثر حالات عدم انتظام ضربات القلب شيوعًا في الولايات المتحدة. ومع ذلك، AF ليس المرض الذي يؤثر على الأذين في عزلة، وقد تورط على أنه له دور سببي في ضعف البطين الأيسر خفيفة إلى شديدة¹⁴. وعلاوة على ذلك، فإن تخطيط القلب من المرضى الذين يعانون من قصور القلب مع الحفاظ على كسر طرد (HFpEF) قد أوضحت أن اليسار حجم الأذينية هي واحدة من أقوى التنبؤات للقابلية للقابلية لفشل القلب¹⁵.

بالإضافة إلى دورها في الفيزيولوجيا الكهربائية والتقلص، الأذين هو أيضا جهاز الغدد الصماء، إفراز القلب (أي، الببتيد الأذيني natriuretic [ANP]) أن تنظيم ضغط الدم بشكل عام وحجم^16،17. وعلاوة على ذلك، ANP (يفترض من myocytes الأذيني) له دور بارز واقية ومكافحة الضخع في myocytes البطيني^16،17. في حين أن هناك تأثير قوي على الاتصال العصبي بين الأذينين والبطينين في حالات الأمراض المختلفة ، فإن الآليات التي يستند لديها هذا الاتصال لم تستكشف بشكل كامل. وتجسد هذه النقطة كذلك من خلال الزيادة في البحوث التي تركز على 1) دور غير myocytes (الليفية القلبية والخلايا المناعية على وجه التحديد) في القلب المريض و 2) كيف يعيد تشكيل القلب كدالة للمرض يؤثر مباشرة على قدرة القلب على البقاء العضلية والوظائف القلبية العالمية^{18،19،21،22}. وهكذا، دراسة الخلايا القلبية من كل من الأذينين والبطينين هو نهج ضروري للحصول على صورة أكثر اكتمالا لأدوارهم في الفيزيولوجيا القلبية.

يصف البروتوكول التالي العزل المتزامن للوميوسيات الأذينية والبطينية وغير العضلية من قلب فأر واحد في ظل الظروف الفسيولوجية والفيزيولوجية. بالإضافة إلى ذلك، هذه الطريقة هي أول من يصف الظروف المثلى اللازمة للحفاظ على ثقافات myocytes القلبية الأذينية، كما تم بالفعل نشر شروط للحفاظ على الثقافات من myocytes البطين.

Protocol

وقد تم استعراض جميع البحوث التي أجريت على الفئران المبلغ عنها في هذه الورقة والموافقة عليها من قبل لجنة الرعاية واستخدام الحيوانات SDSU المؤسسية، وأنها تتفق مع دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية التي نشرها المجلس الوطني للبحوث.

1. إعداد العزلة والثقافة وسائل الإعلام والطلاء

1. إعداد 1 L من القلب في التبول وسائل الإعلام قبل استخدامها عن طريق إضافة جوليك تعديل الحد الأدنى من وسائل الإعلام الأساسية (MMEM) إلى 1 لتر من الماء المعقم. اضبط درجة PH إلى 7.36 مع 10 N NaOH، ثم قم بالتصفية من خلال فلتر 0.2 ميكرومتر واخزنه عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
   ملاحظة: يتكون جوليك MMEM من 112 mM NaCl، 5.4 mM KCl، 1 mM MgCl_2،9 mM NaH₂PO_4،و 11.1 mM D-glucose. ويكمل هذا مع 10 M HEPES (2.38 غرام / لتر), 30 mM تورين (3.75 غرام / لتر), 2 M D-l-carnitine (0.4 غرام / لتر), 2 mM الكرياتين, و 10 mM butanedione monoxime (1.01 غرام / لتر).
2. تحضير العازلة الهضم فقط قبل perfusion, على النحو التالي: تكملة 50 مل من القلب ضخ وسائل الإعلام مع 6.25 ميكرولتر من 100 mM CaCl₂ (انظر الخطوة 1.3) والكولاجيناس نوع 2 (النشاط الأنزيمي ~ 310-320 U/mg dw).
   ملاحظة: وزن الحيوان قبل التضحية. كمية من الكولاجين نوع 2 تكملها في العازلة الهضم تمليها وزن الحيوان (2.25 ملغ من نوع الكولاجيناز 2 لكل 1 غرام من وزن الجسم).
3. لإعداد 100 mM CaCl₂، أضف 1.47 غرام من CaCl₂ إلى 100 مل من مياه الصف البيولوجيا الجزيئية. يُحرّك المزيج حتى يذوب، ثم يمر عبر فلتر 0.2 ميكرومتر ويخزن في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى شهرين.
4. إعداد myocyte وقف العازلة 1 عن طريق استكمال 90 مل من القلب فيتوية العازلة مع 10 مل من مصل الأبقار الجنين (FBS) و 125 ميكرولتر من 100 MM CaCl₂. مر عبر فلتر 0.2 ميكرومتر واخزنه عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
5. إعداد myocyte وقف العازلة 2 عن طريق استكمال 114 مل من القلب عازلة قذف مع 6 مل من FBS و 150 μL من 10 M CaCl₂. مر عبر فلتر 0.2 ميكرومتر واخزنه عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
6. إعداد الأذيال myocyte تصفيح المتوسطة فقط قبل perfusion من خلال استكمال 95 مل من دولبيككو المتوسط النسر المعدل (DMEM) مع 4 مل من FBS، 1 مل من 100x القلم/ستريب-الجلوتامين، 1 مل من 100x الأنسولين transferrin-السيلينيوم، و 1 مل من 10 ميكرومتر dexamethasone. تمر من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر وتخزينها في 37 درجة مئوية حتى الطلاء.
7. إعداد البطين myocyte تصفيح المتوسطة من خلال استكمال 95 مل من الحد الأدنى من المتوسطة الأساسية (MEM) مع 4 مل من FBS, 1 مل من 100x القلم /ستريب-الجلوتامين, 10 مل من 1 M HEPES الحل, 1 مل من 100x الأنسولين transferrin-السيلينيوم, و 0.1 غرام من monoxime butanedione. مر عبر فلتر 0.2 ميكرومتر واخزنه عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
8. إعداد myocyte البطين الحفاظ على المتوسطة من خلال المكمل 99 مل من MEM مع 1 مل من 100x الأنسولين transferrin-السيلينيوم, 0.1 ملغ /مل البوفينات ألبوم المصل (BSA), 10 مل من 1 M HEPES الحل و 1 مل من 100x القلم / ستر الجلوتامين. مر عبر فلتر 0.2 ميكرومتر واخزنه عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
9. لإعداد لوحات وشرائح تجريبية مغلفة باللامينين، قم بذوبان محلول مخزون الماوس اللامينيين (1.19 ملغ/مل). إضافة 10 ميكرولتر من محلول الأسهم اللامينين إلى كل 1 مل من DMEM، ومزيج. لوحات معطف التجريبية والشرائح بالتساوي وتخزينها في 37 درجة مئوية، 5٪ CO₂ ح ح على الأقل قبل perfusion للسماح لموازنة.
   ملاحظة: يمكن تخزين اللوحات والشرائح التجريبية المغلفة في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى يومين.

2. جهاز العزل

1. قبل كل عزلة، وتنظيف الأنابيب وغيرها من مكونات النظام مع ثلاثة يغسل كاملة من EtOH 70٪ عن طريق ملء فخ فقاعة إلى الأعلى (إغلاق قبالة stopcock أسفل والحفاظ على stopcock أعلى مفتوحة).
2. شطف النظام الكامل 3x مع العقيمة H₂O عن طريق ملء فخ فقاعة إلى الأعلى (إغلاق قبالة stopcock أسفل والحفاظ على stopcock أعلى مفتوحة).
3. شطف خارج النظام الكامل مع عازلة ضخ القلب وملء فخ فقاعة في منتصف الطريق مع وسائل الإعلام.
4. تعيين حمام الماء المتداولة إلى 37 درجة مئوية.
5. تعيين حمام مائي لوسائل الإعلام إلى 37 درجة مئوية.
6. إزالة أي فقاعات الهواء في أنابيب مضخة ال peristaltic.
7. ضبط معدل تدفق مضخة ال peristaltic إلى 3 مل / دقيقة.

3. إجراء العمليات الجراحية (عدم البقاء على قيد الحياة)

1. نقع الأدوات الجراحية في EtOH 70٪ لمدة 5 دقائق على الأقل.
2. وضع وسائل الاعلام في ضخ القلب، myocyte وقف المخازن المؤقتة، والهضم العازلة في حمام الماء 37 درجة مئوية.
3. ضع الأذينية الأذينية 2 واسطة الطلاء، البطينية نيوسيتي التصفيح المتوسطة، و myocyte البطين الحفاظ على المتوسطة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO₂ ح ح الحضانة قبل استخدام وتخفيف قبعات للسماح بالموازنة.
4. حقن 10 أسابيع ذكر أو أنثى C57b6/j الفئران intraperitoneally (i.p.) مع 0.35 مل من الهيبارين, المخفف في الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) إلى 100 وحدة دولية/مل. السماح للدواء أن يدخل حيز التنفيذ لمدة 10 دقيقة.
   ملاحظة: إذا كان قلبين هي أن تكون عرضة لإجراء العزل هذا، الماوس الثاني يمكن تخديره و إدارة heparin عند هذه النقطة في الإجراء الأول. لتقليل الضغط على الحيوان، يمكن إعطاء التخدير الخفيف باستخدام 2٪ خليط الأيزوفلوران/الأكسجين في غرفة تحريض مختومة بإحكام.
5. تخدير الحيوان مع 2٪ خليط ايزوفلوران / الأكسجين وحقن i.p. مع pentobarbital (0.3 مل من 10 ملغ / مل الأسهم)، ثم إعداد الصدر عن طريق swabbing مع EtOH 70٪.
6. إعداد تعادل خياطة الحرير 5-0 لتكون على استعداد لligate القلب إلى قنية الضخ. جبل قنية بجوار المجهر الجراحي.
7. فتح الصدر بسرعة عن طريق إجراء شق الجلد في منتصف الخط أولا، من منتصف البطن إلى الفك، ثم دخول الصفاق مع مقص كبير، وإزالة الحجاب الحاجز بعيدا عن طريق تشريح حادة. ثم، قطع بعيدا القفص الصدري باستخدام مقص مع قطع حتى جدار الصدر على الجانب الجانبي من كلا الجانبين.
8. قص بعيدا اتصالات ليفية بين القلب والصدر الجدار (بما في ذلك الغدة الصعترية). ثم، قطع القفص الصدري معا. باستخدام ملقط الصغيرة ومقص، ورفع بلطف القلب من قمة وفضح الجانب الخلفي للقلب.
9. Explant القلب عن طريق تشريح على الفور أقل شأنا من الشريان السام على الشريان الأورطي الصاعد ووضع القلب على الفور في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة أو وسائل الإعلام ضخ القلب البارد. في وقت لاحق، تشريح بسرعة بعيدا الأنسجة المتبقية من القلب explanted في الجليد الباردة ضخ القلب وسائل الإعلام، وفضح الشريان الأورطي الصاعد.
   ملاحظة: من المفيد أن تُزرع القلب بالثُمَة سليمة لاستخدامها كمعلم تشريحي.
10. تنظيف المنطقة المحيطة الشريان الأورطي من الأنسجة الزائدة باستخدام ملقط تشريح صغير ومقص. ضع الشريان الأورطي على القنية باستخدام ملقط ذات رؤوس دقيقة وآمن مع خياطة حريرية 5-0.
    ملاحظة: يحدث أفضل موضع عادة مع الشريان الأبهر تمتد حوالي 2 مم حتى على القنية.
11. اثقب القلب المُبجَّح مع سائل القلب في ضخ القلب بمعدل تدفق 3 مل/دقيقة لمدة 4 دقائق. ثم قم بتبديل الوسائط من سائل القلب إلى عازلة الهضم لمدة 15.0−17.5 دقيقة من الضخ (الشكل 1A).
    ملاحظة: من المرجح أن يزيد معدل التدفق التاجي، مما يشير إلى هضم الأنسجة الفعال (أي، شاحب، وتورم القلب).
12. جمع 8 مل من تدفق العازلة الهضم من خلال خلال خلال الدقائق الأخيرة من perfusion لاستخدامها في وقت لاحق في الخطوة 5.4.
13. إزالة القلب من القنية ووضعها على طبق ثقافة بلاستيكية 60 ملم. إزالة الأنسجة الزائدة (أي، الشريان الأورطي، والأوردة) وغمر القلب في 2.5 مل من العازلة الهضم استعدادا لفصل الميكانيكية.
    ملاحظة: عند هذه النقطة، يتم تشريح الأذيني بعيداً، وينبغي إجراء أحد المجرب بروتوكول عزل الخلية الأذينية، بينما يجب إجراء المجرب الثاني عزل الخلايا البطينية.

4- عزل الخلايا الأذينية وثقافتها

1. تشريح الأذين بعيدا عن القلب ووضعها في طبق ثقافة بلاستيكية 30 ملم. غمره في 0.75 مل من عازلة الهضم لفصل الميكانيكية. الحفاظ على البطينين في طبق 60 ملم (الخطوة 3.12) وتنفيذ أساليب العزل منفصلة في وقت واحد (القسم 5، الشكل 1B).
   ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن أن تخضع الأذينين والبطينين لمزيد من الانفصال إذا كانت هناك حاجة لعزل الخلايا اليسرى والأيسر من الجانب الأيمن.
2. تبدأ في mince وندف الأذين وبصرف النظر، في البداية مع غرامة تلميح مقص الجراحية ويتبعها ملقط غرامة لمزيد من mincing. تجنب تهيج الأنسجة، ولا تسحب بسرعة بعيدا ألياف العضلات.
3. باستخدام تلميح الماصات نقل معقمة، والاستمرار في خلط بلطف وتفكك الأنسجة لمدة 15 دقيقة. كل 5 دقائق، لاحظ الأذيني الأذينية فصل من الأنسجة تحت مجهر 10x الهدف brightfield. كما يصبح الأنسجة مزيد من الهضم، ومواصلة خلط بلطف وتفكك الأنسجة باستخدام تلميح الماصات نقل معقمة مع حجم المسام أصغر.
4. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق معقم 2 مل. شطف لوحة 30 مم مع 0.75 مل من 37 درجة مئوية توقف myocyte العازلة 1 والجمع مع تعليق الخلية (وحدة التخزين نهاية = 1.5 مل).
5. السماح myocytes الأذينية إلى الرواسب عن طريق الجاذبية لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يهيج بلطف تعليق الخلية للسماح ل myocytes إلى الرواسب إلى الجزء السفلي من أنبوب مخروطي، وتشكيل بيليه مرئية.
6. الطرد المركزي تعليق الخلية لمدة 5 دقائق في 20 × ز. إزالة بعناية فائقة، الذي يحتوي على غير myocytes، ونقلها إلى أنبوب مخروطي البولي بروبلين 15 مل باستخدام تلميح ماصة معقمة دون إزعاج بيليه من myocytes الأذيني.
7. الطرد المركزي كسر غير myocyte لمدة 5 دقائق في 20،000 × ز. التعرق و resuspend بيليه غير myocyte في 10 مل من DMEM تكملها مع مصل عجل الجنين 10٪ (FCS).
8. عد غير myocytes باستخدام قياس الهيموسيت أو طريقة أخرى، ثم لوحة وفقا للاحتياجات التجريبية، أو عزل مزيد من مجموعات الخلايا الفردية المحددة عن طريق فرز الخلايا المفلورة المنشطة (الشكل 1C).
9. Resuspend بيليه من myocytes الأذينية المعزولة من الخطوة 4.6 في 1 مل من الأذيال الطنين yocyte المتوسطة وتطبيق 10 ميكرولتر من هذا التعليق على قياس الهيموسيت. إجراء عدد خلايا من الخلايا على شكل قضيب myocytes لكل حقل.
10. لامينين السبيرات من لوحات تجريبية مُكَدَّة/شرائح و resuspend myocytes الأذينية المعزولة في الحجم المناسب من الطنين الأذيني الأذيني الطنين المتوسط المكمل بـ 25 ميكرومتر بليبيستاتين. لوحة في الكثافة المطلوبة لكل احتياجات تجريبية(الشكل 1C).
    ملاحظة: الكثافة النموذجية للطلاء للاستزراع طويل الأجل الموصوف هنا هو 5 × 10⁵ خلايا / غرفة على أربع غرف (1.7 سم²) الشرائح الزجاجية.

5. عزل الخلايا البطينية والثقافة

1. ابدأ في مفروم وندف القلب بعيداً عن الأنسجة البطينية، أولاً بمقص جراحي دقيق متبوعاً بالملقطات الدقيقة لمزيد من مفروم(الشكل 1B). تجنب تهيج الأنسجة عن طريق سحب بسرعة بعيدا ألياف العضلات.
2. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي بولي بروبلين 15 مل. شطف لوحة مع 2.5 مل من 37 درجة مئوية توقف myocyte العازلة 1 والجمع مع تعليق الخلية (وحدة التخزين نهاية = 5 مل).
3. باستخدام تلميح الماصات المنقولة العقيمة، استمر في خلط الأنسجة وفكها بلطف لمدة 4 دقائق. تطبيق 10 μL من هذا التعليق الخلية على الشريحة وتصور وجود myocytes على شكل قضيب لضمان جودة العزل.
4. تمرير تعليق الخلية من خلال مرشح النايلون 100 ميكرومتر معقم في أنبوب مخروطي بولي بروبلين 50 مل. استخدام 2 مل من العازلة الهضم التي تم جمعها في الخطوة 3.12 لغسل أي الخلايا المتبقية قبالة مرشح النايلون العقيمة.
5. السماح للنيوسيات البطين إلى الرواسب عن طريق الجاذبية لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة. يهيج بلطف تعليق الخلية المصفاة للسماح ل myocytes إلى الرواسب في الجزء السفلي من المخروطية، وتشكيل بيليه مرئية.
6. دون إزعاج بيليه من myocytes البطينية، وإزالة بعناية فائقة (غير myocytes) ونقلها إلى أنبوب مخروطي بولي بروبلين 50 مل باستخدام طرف الماصات العقيمة. الطرد المركزي كسر غير myocyte لمدة 5 دقائق في 20،000 × ز. التعرق و resuspend بيليه غير myocyte في 10 مل من DMEM تكملها 10٪ FCS.
7. عد غير myocytes باستخدام قياس الهيموزيت و resuspend في حجم مناسب من DMEM تكملها 10٪ FCS. ثم، لوحة وفقا للاحتياجات التجريبية، أو مزيد من العزلة في مجموعات الخلايا الفردية المحددة عن طريق فرز الخلايا المنشطة الفلوريسانس(الشكل 1C).
8. Resuspend myocytes البطين المعزولة في 2 مل من myocyte وقف العازلة 2 وتطبيق 10 ميكرولتر من تعليق الخلية على قياس الهيموسيت. إجراء عدد خلايا من الخلايا على شكل قضيب myocytes لكل حقل.
9. إعادة إدخال كاليفورنيا^{2 +} باستخدام نموذج متدرج
   ملاحظة: خطوات إعادة إدخال الكالسيوم محددة للنيوسيات البطينية ويجب ألا يتم تنفيذها لـ myocytes الأذينية، لأن هذا سيؤدي إلى موت الخلية.
   1. أضف 50 ميكرولتر من 10 mM CaCl₂ إلى تعليق الخلية العضلية البطيني. تخلط جيدا واحتضان لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   2. أضف 50 ميكرولتر إضافي من 10 mM CaCl₂ إلى تعليق الخلية العضلية البطيني. تخلط جيدا واحتضان لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   3. أضف 100 ميكرولتر إضافية من 10 mM CaCl₂ إلى تعليق الخلية العضلية البطيني. تخلط جيدا واحتضان لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   4. أضف 80 ميكرولتر من 100 mM CaCl₂ إلى تعليق الخلية العضلية البطيني. تخلط جيدا واحتضان لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
10. إزالة طلاء اللامينيين من لوحات أو الشرائح وإعادة تعليق الخلايا العضلية البطين المعزولة في حجم مناسب من البطين myocyte طلاء المتوسطة المتوسطة وفقا للاحتياجات التجريبية (الشكل 1C).
    ملاحظة: الكثافة النموذجية للطلاء للاستزراع طويل الأجل الموصوف هنا هو 5 × 10⁵ خلايا / غرفة على أربع غرف (1.7 سم²) الشرائح الزجاجية. تجنب الطلاء بكثافة أكبر من 75٪ التقاء، كما الإفراط الخلوية التكميم يعزز تكتل الخلايا، وبالتالي تثبيط التعلق لوحة. وعلاوة على ذلك، ستفقد أعداد كبيرة من الخلايا خلال التغيير المتوسط الأول. خلايا لوحة بسرعة بعد العزل، كما خارج الخلية كاليفورنيا²⁺ يعزز فرط الثبات وفقدان myocytes قابلة للحياة.
11. السماح للنيوسيات البطين لتسوية والالتزام لمدة 1 ساعة على الأقل. في وقت لاحق تغيير وسائل الإعلام إلى myocyte البطينية الحفاظ على المتوسطة تكمل مع 25 μM blebbistatin.
    ملاحظة: يمكن أن تكون مُيوسيات البطين مُثقَفة حتى 96 ساعة بعد الطلاء في μM blebbistatin. وينبغي إجراء التجارب في myocyte البطينية الحفاظ على المتوسطة في غياب blebbistatin.

النتائج

نمط البرية 10 أسابيع من العمر C57b6/ ي القلب الماوس عادة ما يؤدي إلى ما بين 75،000-150،000 myocytes الأذيني و 1.0-1.5 × 10^{6 6} myocytes البطيني، يعادل العائد التقريبي من 30٪ −50٪ للعضاليات الأذينية والبطينية^18,19. أثناء وبعد العزل مباشرة, يجب أن تظهر myocytes القلب قابلة للحياة على شكل قضيب وعدم التعاقد. وينبغي أن غالبية myocytes القلب المعزولة التكيف هذا مورفولوجيا، وهو مؤشر على الضخ الفعال. يمكن أن يكون مورفولوجيا شكل القضيب أيضًا مؤشرًا على الجدوى. يهدف البروتوكول إلى تعزيز العائد وقابلية صلاحية الخلايا myocytes وغير myocytes المعزولة من قلب الماوس المريض. وعلاوة على ذلك، فقد تم اختباره في نموذج للضغط الزائد الناجم عن فشل القلب (البيانات غير مبينة).

لتأكيد عزل كافية وقابلة للتكرار من myocytes وغير myocytes من الأنسجة الأذينية والبطين، وقد لوحظت الخلايا وتصويرها في أيام مختلفة في الثقافة (الشكل 2). بالإضافة إلى ذلك، تم تنفيذ تفاعل سلسلة البوليمرات العكسية الكمية (qRT-PCR) لقياس مستويات النصوص التي كانت محددة بنوع الخلية. القلب عضلة تروبونين T (Tnnt2) هو علامة من myocytes القلب وأعرب بقوة في كل من الأذيني والبطين الثقافات myocyte القلب (الشكل 3A). في المقابل، الببتيد الأذيني الناتريوري(Nppa، والذي يعبر عنه عادة بشكل حصري في myocytes القلب الأذيني البالغين تحت الظروف الفسيولوجية) وسلسلة الضوء myosin 2 (Myl2، وهو جين ميثي البطينية محددة) كانت قوية وتحديدا في الأذينة والبطين الثقافات العضلية القلبية ، على التوالي (الشكل 3B، C).

علامات الخلايا الليفية، عامل النسخ 21 (Tcf21، مستقبلات عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية A (Pdgfra) ، ومجموعة علامات الخلايا المشتقة من أحادية الخلايا من التمايز 68 (Cd68) تم التعبير عنها حصريًا في الثقافات غير العضلية المعزولة عن كل من الغرف الأذينية والبينية (الشكل 3D−F). ويقدر أن غير myocytes تسوية ~ 65 ٪ من جميع خلايا القلب ، وأن غالبية هذه تنشأ من الليفية أو monocyte مشتقة النسب^{18،19،23،24}. وهكذا، تم اختيار علامات لهذين النسب ليكون تمثيليا، نظرا للاهتمام في هذه المجموعات الخلوية في دراسات من مختلف النماذج و etiologies من أمراض القلب.

مناعة من AMAMs وAMVMs لعلامة تي-أنبوب ديهي دروبريدين (DHPR، وهو يعتمد على الجهد (L) من نوع قناة الكالسيوم) وكذلك مستقبلات RYR2 اليود أظهرت سليمة t-tubules طوال العزلة والثقافة على المدى الطويل(الشكل 4A, B). وفرة DHPR والتوطين التي كانت مميزة وفريدة من نوعها لالعضيات العضلية الأذينية والبطينية تشير إلى وجود تي-أنابيب. وعلاوة على ذلك، كان التكلس من DHPR مع RYR2 المثبطة للمناعة مؤشرا على هياكل دياد سليمة. أدى الكبت المناعي للبروتين الساركميري ألفا أكتينين في الخلايا العضلية القلبية الأذينية والبطينية إلى نمط التصدع الساركميرتي المتوقع. تم استخدام نمط التصدع الساركميري لتقييم نقاء وقابلية البقاء من الخلايا الميوسيولوجية المعزولة القلبية بالتزامن مع شكل شكل شكل قضيب وصبغ نووي مع TOPRO-3(الشكل 4C, D; الأرجواني والأحمر). كما هو متوقع، كانت الخلايا العضلية القلبية البطينية كبيرة، وعرض متوسط طول ~ 150 ملم، في حين أن العضلة العضلية القلبية الأذينية متوسط ~ 75 ملم. وعلاوة على ذلك، عند تحليل المناعة، أظهر myocytes القلبية الأذينية (ولكن ليس myocytes القلبية البطينية) التعبير القوي عن الببتيد الأذيني النتري يوريك (ANP) في نمط تلطيخ التي كانت سمة من سمات التوطين إلى التشنج endoplasmic والحبيبات إفرازية(الشكل 4C, D; الأخضر).

سمة فريدة من نوعها ل myocytes القلبية الأذينية هو تصنيفها كخلية الغدد الصماء بالإضافة إلى خلية انكماشية. بينما يفرز myocytes الأذيني ANP في ظل الظروف القاعدية ، يزيد الإفراز استجابة للسراغوجيات (أي ، ناهض ألفا -adrenergic ، فينيليفرين [PE]). وعلاوة على ذلك، الأذينيات القلبية myocytes تفرز ANP وco-إفراز عملية جزء من هرمون من حالته السلائف (برو ANP، 15 KD) إلى ببتيد المنتج (ANP 3kD)^16،17. ويمكن تحديد هذه القدرة على إفرازية عن طريق الكشف المناعي من ANP في وسائل الإعلام من myocytes القلبية الأذيناة المعزولة استجابة لعلاج PE الحاد(الشكل 4E). تم العثور على هذه القدرة على إفراز ومعالجة myocyte القلب الأذيني لتكون حساسة لظروف الاستزراع. وبالتالي، فمن الضروري أن يتم استكمال الأذيني الأذينية الاسطونية المتوسطة مع dexamethasone، الأنسولين، transferrin، والسيلينيوم.

الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية للقلب الرجعي، والهضم، وعزل الخلية. تظهر هي الخطوات الرئيسية التي ينطوي عليها عزل الخلية عن كل من الغرف الأذينية والبطينية في وقت واحد من قلب فأر واحد. (A) يتم قذف قلب فأر واحد بسرعة عبر الشريان الأورطي الصاعد و perfused بطريقة رجعية. (B) يتم فصل القلب إلى أنسجة الأذينية والفينية لمزيد من الهضم والفصل الجسدي. (C)بعد الهضم الكافي، يتم فصل الخلايا عن طريق الترشيح الجاذبية إلى ما مجموعه أربعة كسور الخلوية التي يتم استزراعها للتجريب اللاحقة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: التحليل المورفولوجي للأوعية القلبية الأذينية والبطينية المعزولة وغير myocytes في الثقافة. (A) الماوس البالغ المعزولة الأذينية myocytes (AMAMs)،(ب)الكبار الماوس الأذيني غير myocytes (AMANMs)، (C) الكبار الماوس myocytes البطينية (AMVMs)، أو (D)الكبار الماوس بطين غير myocytes (AMVNMs) مطلية في 5 × 10⁵ الخلايا / الغرفة على أربع غرف (1.7 سم²) الشرائح الزجاجية في وسائط مطلية على التوالي. تم الحصول على صور المرحلة في الأيام المشار إليها في الثقافة باستخدام هدف 10x تحت مجهر epifluorescence. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: تحليل تمثيلي لـ qRT-PCR لثقافات الخلايا المعزولة. تم استخراج الحمض النووي الريبي من الخلايا القلبية المعزولة حديثا وغير myocytes، وتم تحديد مستويات مرنا لعلامات الجينات الخلية محددة من قبل qRT-PCR⁴. (A) Tnnt2, القلب العضلات تروبونين تي (القلب علامة myocyte); (B) Nppa، الببتيد الأذيني الناتري يوريك (علامة الأذينية الفلورية) ؛ (C) Myl2، سلسلة ضوء myosin 2 (علامة myocyte البطين) ؛ (D) Tcf21، عامل النسخ 21 (علامة الخلايا الليفية) ؛ (E) Pdgfra, الصفائح الدموية المشتقة مستقبلات عامل النمو A (علامة الخلايا الليفية); (F) Cd68، مجموعة من التمايز 68 (علامة الخلية المشتقة من أحادية الخلية). تمثل البيانات ± SEM (* p ≤ 0.05 مختلفة عن جميع القيم الأخرى، كما تحددها ANOVA متبوعة بتحليل نيومان كيلو بعد المخصص). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: التحليل المورفولوجي والوظيفي للمناظير المعزولة والبطينية القلبية. (أ)AMAMs أو (B) AMVMs مطلية في 5 × 10⁵ الخلايا / الغرفة على أربع غرف (1.7 سم²) الشرائح الزجاجية في وسائل الاعلام الطلاء على التوالي لمدة 1 ساعة للسماح للالتصاق. وأعقب ذلك إما إعادة تغذية الأذينية myocyte وسائل الاعلام الطلاء أو تغيير إلى myocyte البطينية الحفاظ على وسائل الإعلام تكمل مع blebbistatin لمدة 16 ساعة إضافية. تم تثبيت الثقافات في وقت لاحق ثم المثبطة للمناعة RYR2 (الأرجواني)، DHPR (الأخضر)، واللطخة النووية TOPRO-3 (الأحمر). (C)AMAMs أو (D) AMVMs كانت معزولة ومطلية ، ثم مناعة لـ a-actinin (الأرجواني) ، ANP (الأخضر) ، و TOPRO-3 (أحمر). تظهر صورتان تمثيليتان لكل نوع خلية. (E)مطلية AMAMs في 5 × 10⁵ الخلايا / جيدا على 12 طبق ثقافة جيدة لمدة 16 ساعة في الأذينية وسائط طلاء. وعولجت الأمهات في وقت لاحق ل0.5 ساعة مع السيارة أو إفراز ANP (فينيليفرين، 50 مللي أم) قبل أن يتم جمع وسائل الإعلام وإخضاعها لتحليل مناعي ل ANP. وقبل تحليل النبع المناعي، كانت عينات الوسائط تُجرى بالطرد المركزي عند 500 x غم لمدة 5 دقائق لإزالة الحطام الخلوي وضمان أن يكون عنصر ANP المرصود نتيجة للإفراز النشط من المركبات AMAMs. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

نوعية الخلايا المعزولة باستخدام الإجراء الموصوف هنا، كما يحددها الغلة الخلية والصحة العامة للخلايا في الثقافة، يعتمد على العديد من العوامل التي يمكن السيطرة عليها. بدءا من الفأرة نفسها، وقد تم توثيق أن الإجهاد المفروض على الحيوان يمكن أن تؤثر سلبا على انتاج الخلية وقابليتها للحياة في الثقافة، ويفترض أن يرجع ذلك إلى الكورتيزول النظامية الزائدة، catecholamines، وحالة hypercontractile من أنسجة القلب^2،5،7. لهذه الأسباب، ينبغي اتخاذ تدابير لتجنب إثارة الذعر الحيوان قبل التضحية. وتشمل هذه التدابير تغطية قفص الحيوان والحد من الوقت خارج فيفاريوم قبل التضحية. الهيبارين والعديد من الباربيتيورات المستخدمة عادة للقتل الرحيم يمكن أن تؤثر على مسارات الإشارات; وهكذا، ينبغي تخصيص الطريقة المثلى للقتل الرحيم وفقا لذلك. عمر الحيوان له تأثير كبير على نوعية و صلاحية الخلايا المعزولة، على الأرجح بسبب تراكم تدريجي للتليف الخلالي يحدث بالتزامن مع عملية الشيخوخة، والتي يمكن أن تؤثر على هضم الأنسجة²⁵. في البيانات غير المعروضة هنا ، في حين أن الطريقة المذكورة أعلاه تعمل في الفئران التي تصل إلى 78 أسبوعًا ، كانت جودة الخلايا أقل في هذه الحيوانات القديمة.

الخطوة الأكثر أهمية في عملية العزل الموصوفة ، فضلا عن بروتوكولات أخرى تتميز جهاز Langendorff للانفورل ، هو التكنغي والقذف الأولي للقلب. للحصول على أفضل النتائج، ينبغي أن يستغرق الوقت من الزرع القلبي إلى التكبل من الشريان الأبهر الصاعد والشروع في ضخ لا أكثر من 90 s. بالإضافة إلى الوقت، هناك عاملان مهمان إضافيان هما عمق الكانولا وإمكانية إدخال emboli الهواء من جهاز الضخ. وبناء على ذلك، ينبغي أن تقدم كانولا في الشريان الأورطي التصاعدي حتى لا يدخل جذر الأبهر وعرقلة الصمام الأبهري، والتي من شأنها أن تضعف ضخ الأوعية التاجية.

أثناء عملية الهضم ، من المهم اختبار صلابة القلب بانتظام لتجنب التعرض لفترات طويلة لانزيم الكولاجيناز الهضمي ، مما يقلل من تحمل الكالسيوم في عضلة القلب. تم تصميم البروتوكول الموصوف أعلاه لإعادة إدخال الكالسيوم في ثقافات myocyte البطينية المعزولة للحد من موت الخصيتين القلبية عن طريق تدفق الكالسيوم غير المناسب عبر قنوات الكالسيوم المخزنية التي تعمل. وتجدر الإشارة إلى أن إعادة إدخال الكالسيوم خطوة لا ينبغي أن يتم لثقافات myocyte الأذينية المعزولة، وهذا من شأنه أن يعزز موت الخلايا خلال الثقافة قصيرة وطويلة الأجل¹². لمزيد من الاحتياطات، وتشمل المخازن المؤقتة الضخ والهضم المستخدمة هنا مثبط تقلص عضلة القلب butanedione monoxime (BDM) لتجنب فرط الاحتقان من myocytes المعزولة، فضلا عن مفارقة الكالسيوم، وكلاهما تأثير myocyte قابلية البقاء²⁶. ومع ذلك، ينبغي ملاحظة التحول من BDM إلى blebbistatin، كما هو العامل المفضل المضادة للانكماش في الحفاظ على وسائل الإعلام ل myocytes القلب المعزولة. في البيانات غير المعروضة، blebbistatin يمنح قابلية أكبر للحياة لثقافة طويلة الأجل من myocytes القلب المعزولة.

بعد العزلة مباشرة ، من المهم النظر في تداعيات الثقافة طويلة الأجل للخلايا القلبية ، وخاصة الخلايا myocytes. ويستند القلب غير myocyte عزل وعبادة البروتوكول الموصوفة هنا على الطرق الشائعة التي تستفيد من الكثافات المختلفة والخصائص اللاصقة للخلايا القلبية المختلفة. فائدة غير myocytes هي إمكاناتها التوسعية العالية في الثقافة. وهكذا، على عكس myocytes القلب، فهي قابلة لتمرين لإدامة. ومع ذلك، فمن المعروف أن ظروف زراعة، بما في ذلك مكملات المتوسطة مع FBS، يمكن أن تؤثر على وظائف myocyte القلب²⁷. تم تصميم وسائل الإعلام الثقافية الموصوفة هنا لتحسين الجدوى والحد من الاضطرابات الوظيفية ، خاصة بالنسبة للوسيعات الأذينية المعزولة. في حين لم يلاحظ أي ضعف القدرة على الانقبال في الخلايا العضلية القلبية المعزولة بعد الثقافة في غياب مكملات blebbistatin ، يجب إجراء الدراسات التي تركز على الفيزيولوجيا الكهربائية ، والانقبالية ، وغيرها من الخلايا المفردة في الإشارات الجزيئية القائمة على الجسم الحي بعد وقت قصير من العزلة ، عندما لا يزال الهيكل الساركومبي والتوقيع الجزيئي يحاكي ذلك القلب السليم.

السمة المميزة ل myocyte الأذيني هو قدرته على ضوء القمر كخلية الغدد الصماء مع قدرة إفرازية هائلة، بالإضافة إلى وظيفة انكماشها. في ظل الظروف الفسيولوجية، myocytes الأذينية تنتج كميات كبيرة من ANP، والتي يتم تخزينها في إندوبلاسميك ريتيكولوم وفي حبيبات إفرازية كثيفة كبيرة تستعد ل exocytosis منظم على تلقي حافز^16،17. في حين أن العديد من الدراسات المعزولة الأذينية تركز على خصائصها الكهربائية الفريدة ، فهذه هي الدراسة الأولى لتصميم وسائل الإعلام الثقافية. وهذا يسمح لقابلية البقاء على المدى الطويل، فضلا عن تعزيز الوظائف المحافظة على خصائص الغدد الصماء والانكماش من myocytes الأذينية. هذه الطريقة الجديدة للاستزراع ، وكذلك العزل المتزامن لجميع أنواع الخلايا من الغرف الأذينية والبطينية من قلب فأر واحد ، ستكون مفيدة وفعالة للدراسات حول الخصائص الفسيولوجية والفيزيولوجية لعضليات الأذينية والفيني.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(-)-Blebbistatin	Sigma-Aldrich	B0560
1 Liter Water Jacketed Reservoir	Radnoti	120142-1
2,3-Butanedione monoxime	Sigma-Aldrich	B0753
5-0 Silk Suture Thread	Fine Science Tools	18020-50
Adenosine	Sigma-Aldrich	A9251
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A6003
Bubble Trap Compliance Chamber	Radnoti	130149
Calcium Chloride Anhydrous	Fisher Scientific	C614-500
Carnitine hydrochloride	Sigma-Aldrich	C9500
Collagenase type 2	Worthington Biochemical Corporation	LS004176
Creatine	Sigma-Aldrich	C0780
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915
DMEM/F12 (1:1; 1X)	Gibco	11330-032
Dumont #7 - Fine Forceps	Fine Science Tools	11274-20
Epifluorescent micropscpe	Olympus X70	IX70
Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated)	Omega Scientific	FB-12	Lot# 206018
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-09
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11051-10
Headband Magnifiers	Fine Science Tools	28030-04
Hemacytometer (Bright-Line)	Hausser Scientific	1475
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
Inosine	Sigma-Aldrich	I4125
Insulin-Transferrin-Selenium-X	Gibco	51500-056
Isotemp 105 Water Bath	Fisher Scientific	NC0858659
Isotemp 3006	Fisher Scientific	13-874-182
Joklik Modified Minimum Essential Media	Sigma-Aldrich	M-0518
Laminin (Natural, Mouse)	Gibco	1795024	Lot# 1735572
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G8540
Masterflex C/L Single-Channel Variable-Speed Compact Pump	Cole-Palmer	EW-77122-24
Minimum Essential Medium (MEM 1X)	Gibco	12350-039
Molecular Biology Grade Water	Corning	46-000-CM
Pen Strep Glutamine (100X)	Gibco	10378-016
Spring Scissors - 6mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15020-15
Taurine	Sigma-Aldrich	T-8691