Yetişkin Fare Kalbinden Atriyal Miyositler, Ventrikül Miyositleri ve Miyosit Olmayanların Eşzamanlı İzolasyonu ve Kültürü

Özet

Miyositlerin ve miyosit olmayanların tek bir yetişkin fare kalbinin hem atria hem de ventriküllerinden eşzamanlı izolasyonu için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, yüksek oranda uygulanabilir kardiyak miyositlerin ve miyosit olmayanların tutarlı verimini sağlar ve fenotipleme ve in vitro analiz için en uygun hücreye özgü kültür koşullarını detaylandırmaz.

Özet

Kardiyak miyositlerin farelerden izolesi ve kültürasyonu, kardiyak fizyoloji ve patofizyolojinin anlaşılmasını ilerletmede gerekli olmuştur. Yenidoğan fare kalplerinden miyositlerin izole edilmesi nispeten basit olmakla birlikte, yetişkin murine kalbinden miyositler tercih edilir. Bunun nedeni, yenidoğan hücrelerine kıyasla, yetişkin miyositlerin in vivo yetişkin kalbinde meydana geldiği için hücre işlevini daha doğru bir şekilde rekapitulateetmesidir. Bununla birlikte, yetişkin fare kardiyak miyositlerini deneysel bir çıkmaza katkıda bulunan gerekli miktarlarda ve canlılıkta izole etmek teknik olarak zordur. Ayrıca, yayınlanan prosedürler atriyal veya ventriküler miyosit olmayan hücreler pahasına atriyal veya ventriküler miyositlerin izolasyonu için özeldir. Burada açıklanan, atriyal ve ventriküler olmayan miyositlerle birlikte hem atriyal hem de ventrikül kardiyak miyositleri tek bir fare kalbinden aynı anda izole etmek için ayrıntılı bir yöntemdir. Ayrıca, hücre canlılığını ve işlevini artıran optimal hücreye özgü kült oluşturma yöntemleri için ayrıntılar da verilmiştir. Bu protokol sadece yetişkin murine kardiyak hücre izolasyon sürecini hızlandırmakla kalmaz, aynı zamanda atriyal ve ventrikül kardiyak hücrelerin araştırılması için hücrelerin verimini ve canlılığını artırmayı amaçlamaktadır.

Giriş

Birincil hücre kültürü, kardiyak miyosit fonksiyonunun ayrıntılı mekanistik çalışmaları için kontrollü bir ortam sunan ayrılmaz bir kaynaktır. Daha dayanıklı doğası ve izolasyon kolaylığı nedeniyle, yenidoğan sıçan atriyal ve ventriküler miyositler bu tür hücre kültürlerinin ortak kaynağı olmuştur¹. Bununla birlikte, yetişkin fare atriyal ve ventriküler miyositler (AMAM'ler ve AMVM'ler) in vitro çalışmalar için oldukça arzu edilir, çünkü moleküler ve fonksiyonel özellikleri yetişkin kalp hücrelerininkileri daha iyi taklit eder. Bu nedenle, çoğu yetişkinlerde gelişen kardiyak patolojilerle ilgili çalışmalar için uygun hale gelmiştir².

Ayrıca, transgenik ve hastalık fare modellerinin mevcudiyeti ve kullanımı, izole yetişkin kardiyak miyositlerin yararını genişletir. Kısa ve uzun süreli çalışmalar için fare AMVM'lerinin izolasyonu ve kültürüne yönelik protokoller daha önceki çok sayıda yayında^{açıklanmıştır 2,}3^{,4,5,6,7,8,9,10,11}. Buna karşılık, AMAM'lerin yalıtımı için birkaç protokol tanımlanmıştır. Ayrıca, açıklananlar öncelikle yeni izole edilmiş hücrelerin akut çalışmaları için optimize edilmiştir, bugüne kadar^{11 , 12,13}. Bu nedenle, AMAM yalıtım protokolleri, AMVM'lerin izolasyonu ve kültürü için yayınlanan protokollerin yarar ve çok yönlülüğünü sağlamak üzere tasarlanmamıştır. Ayrıca, AMAM'lerin ve AMVM'lerin izolasyonu için yapılan öncü çalışmalar becerikli olmakla birlikte, hem AMAM'lerin hem de AMVM'lerin optimal eşzamanlı izolasyonu ve kültürü için protokol yoktur ve bu da her hazırlık için tüm kalbin verimli bir şekilde kullanılmasına neden olur.

Şimdiye kadar, yayınlanan AMAM ve AMVM izolasyon protokolleri her iki hücre tipinin eşzamanlı izolasyonu için tasarlanmamıştır, çünkü atriyal ve ventrikül fonksiyonu üzerine yapılan çalışmaların çoğunda odaya özgü bir odak vardır. Örneğin, AMAM'ler ağırlıklı olarak Atriyal miyosit elektrofizyolojisini incelemek için kullanılır, kısmen ABD'deki en yaygın kardiyak aritmi olan atriyal fibrilasyona (AF) olan ilgi nedeniyle. Bununla birlikte, AF izolasyondaki aryayı etkileyen bir hastalık değildir ve hafif ila şiddetli sol ventrikül disfonksiyonunda nedensel bir role sahip olduğu belirtilmiştir¹⁴. Ayrıca, korunmuş ejeksiyon fraksiyonu (HFpEF) ile kalp yetmezliği olan hastalardan elektrokardiyogramlar, sol atriyal boyutun kalp yetmezliğine duyarlılık için en güçlü tahmin edicilerden biri olduğunu göstermiş¹⁵.

Elektrofizyoloji ve kontrtiyanstaki rolüne ek olarak, atriyum aynı zamanda kan basıncını ve hacmini homeostatik olarak düzenleyen kardiyokinleri (yani atriyal nazüretik peptit [ANP]) salgılayan bir endokrin^organdır. Ayrıca, ANP (muhtemelen atriyal miyositlerden) ventrikül miyositlerinde belirgin bir koruyucu ve anti-hipertrofik role sahiptir^16,17. Çeşitli hastalık durumlarında atria ve ventriküller arasında nörohormonal iletişimin güçlü bir etkisi olmakla birlikte, bu iletişimin altında bulunan mekanizmalar tam olarak araştırılmamıştır. Bu nokta, 1) hastalıklı kalpte miyosit olmayanların (özellikle kardiyak fibroblastlar ve bağışıklık hücreleri) rolü ve 2) hastalığın bir işlevi olarak kardiyak remodelingin kardiyak miyosit canlılığını ve küresel kardiyak fonksiyonu^{18 , 19}, 20^,21,22'yeodaklanan araştırmalardaki artışla daha da örneklenmiştir. Bu nedenle, hem atria hem de ventriküllerden kardiyak hücreleri incelemek, kardiyak patofizyolojideki rollerinin daha eksiksiz bir resmini elde etmek için gerekli bir yaklaşımdır.

Aşağıdaki protokol, atriyal ve ventriküler miyositlerin ve miyosit olmayanların fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında tek bir fare kalbinden eşzamanlı izolasyonu açıklanmaktadır. Ek olarak, bu yöntem atriyal kardiyak miyosit kültürlerini korumak için gerekli olan en uygun koşulları tanımlayan ilk yöntemdir, çünkü ventrikül miyosit kültürlerini sürdürme koşulları zaten yayınlanmıştır.

Protokol

Bu makalede bildirilen fareler üzerinde yapılan tüm araştırmalar SDSU Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından incelenmiş ve onaylanmıştır ve Ulusal Araştırma Konseyi tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygundur.

1. İzolasyon ve kültür medyasının hazırlanması ve kaplama

1. 1 L steril suya Joklik modifiye minimum esansiyel ortam (MMEM) ekleyerek kullanmadan önce 1 L kalp perfüzyon ortamı hazırlayın. 10 N NaOH ile pH'ı 7,36'ya ayarlayın, ardından 0,2 μm filtreden geçirin ve 2 haftaya kadar 4 °C'de saklayın.
   NOT: Joklik MMEM 112 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 9 mM NaH₂PO₄ve 11.1 mM D-glikozdan oluşur. Bu, 10 mM HEPES (2,38 g/L), 30 mM taurin (3,75 g/L), 2 mM D-l-karnitin (0,4 g/L), 2 mM kreatin ve 10 mM butanedione monoksim (1,01 g/L) ile desteklenmiştir.
2. Perfüzyondan hemen önce sindirim tamponunu hazırlayın, aşağıdaki gibi: 100 mM CaCl 2'nin 6,25 μL'si (bkz. adım_1,3) ve kollajenaz tip 2 (enzymatic aktivite ~310–320 U/mg dw) ile 50 mL kalp perfüzyon ortamı takviyesi.
   NOT: Kurban etmeden önce hayvanı tartın. Sindirim tamponuna takviye edilen kollajenaz tip 2 miktarı, hayvanın ağırlığı tarafından belirlenir (1 g vücut ağırlığı başına 2,25 mg kollajenaz tip 2).
3. Hazırlamak için 100 mM CaCl₂, 1.47 g CaCl₂ ila 100 mL moleküler biyoloji sınıfı su ekleyin. Çözünene kadar karıştırın, ardından 0,2 μm'lik bir filtreden geçirin ve oda sıcaklığında 2 aya kadar saklayın.
4. 90 mL kalp perfüzyon tamponunu 10 mL fetal sığır serumu (FBS) ve 125 μL 100 mM CaCl 2 ile destekleyerek miyosit durdurma_tamponu1'i hazırlayın. 0,2 μm filtreden geçirin ve 2 haftaya kadar 4 °C'de saklayın.
5. 6 mL FBS ve 150 μL 10 mM CaCl 2 ile 114 mL kalp perfüzyon tamponunu destekleyerek miyosit durdurma_{tamponu 2'yi}hazırlayın. 0,2 μm filtreden geçirin ve 2 haftaya kadar 4 °C'de saklayın.
6. Dulbecco'nun modifiye Kartal ortamının (DMEM) 95 mL'sini 4 mL FBS, 1 mL'si 100x kalem/strep-glutamin, 1 mL'si 100x insülin transferin-selenyum ve 1 mL'si 10 μM deksametazon ile destekleyerek perfüzyondan hemen önce atriyal miyosit kaplama ortamını hazırlayın. 0,2 μm filtreden geçirin ve kaplamaya kadar 37 °C'de saklayın.
7. 4 mL FBS, 1 mL 100x kalem/strep-glutamin, 10 mL 1 M HEPES çözeltisi, 1 mL 100x insülin transferin-selenyum ve 0,1 g butanedione monoksim ile 95 mL minimum esansiyel ortamı (MEM) destekleyerek ventriküler miyosit kaplama ortamını hazırlayın. 0,2 μm filtreden geçirin ve 2 haftaya kadar 4 °C'de saklayın.
8. 1 mL 100x insülin transferin-selenyum, 0,1 mg/mL sığır serum albümini (BSA), 10 mL 1 M HEPES çözeltisi ve 1 mL 100x kalem/strep-glutamin ile 99 mL MEM takviyesi yaparak ventriküler miyosit tutma ortamını hazırlayın. 0,2 μm filtreden geçirin ve 2 haftaya kadar 4 °C'de saklayın.
9. Laminin kaplı deneysel plakalar ve slaytlar hazırlamak için fare laminin stok çözeltisini (1,19 mg/mL) çözün. Her 1 mL DMEM'e 10 μL laminin stok çözeltisi ekleyin ve karıştırın. Deneysel plakaları ve slaytları eşit şekilde kaplayın ve dengeye izin vermek için perfüzyondan önce en az 1 saat boyunca 37 °C, %5 CO₂ inkübatörde saklayın.
   NOT: Kaplamalı deneysel plakalar ve kaydıraklar 4 °C'de 2 güne kadar saklanabilir.

2. İzolasyon aparatı

1. Her izolasyondan önce, kabarcık tuzağını üste doldurarak boruyu ve sistemin diğer bileşenlerini% 70 EtOH'luk üç tam yıkama ile temizleyin (alt stopcock'u kapatın ve üst stopcock'u açık tutun).
2. Kabarcık tuzağını üste doldurarak tüm sistemi 3x steril H₂O ile durulayın (alt stopcock'u kapatın ve üst stopcock'u açık tutun).
3. Tüm sistemi kalp perfüzyon tamponu ile durulayın ve kabarcık tuzağını yarı yolda medya ile doldurun.
4. Sirkülasyon suyu banyoyu 37 °C'ye ayarlayın.
5. Ortam için bir su banyosayı 37 °C olarak ayarlayın.
6. Peristaltik pompa borularındaki hava kabarcıklarını çıkarın.
7. Peristaltik pompanın debisini 3 mL/dk olarak ayarlayın.

3. Cerrahi prosedür (sağkalım dışı)

1. Cerrahi aletleri % 70 EtOH'da en az 5 dakika bekletin.
2. Kalp perfüzyon medyasını, miyosit durdurma tamponlarını ve sindirim tamponunu 37 °C su banyosuna yerleştirin.
3. Atriyal miyosit kaplama ortasını, ventrikül miyosit kaplama ortasını ve ventrikül miyosit bakım ortamını kullanmadan önce 37 °C, %5 CO₂ inkübatör 1 saat içine yerleştirin ve dengeyi sağlamak için kapakları gevşetin.
4. 10 haftalık erkek veya dişi C57b6/j farelere intraperitoneally (i.p.) ile 0.35 mL heparin enjekte edin, fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltilerek 100 IU/mL'ye. İlacın yaklaşık 10 dakika boyunca etkili olmasını izin verin.
   NOT: İki kalp bu izolasyon işlemine tabi tutulacaksa, ikinci fare ilk işlemde bu noktada uyuşturulabilir ve heparin uygulanabilir. Hayvan üzerindeki stresi en aza indirmek için, hermetik olarak kapatılmış bir indüksiyon odasında% 2 izofluran / oksijen karışımı kullanılarak hafif anestezi uygulanabilir.
5. Hayvanı% 2 izofluran / oksijen karışımı ile uyuşturun ve i.p.'ye pentobarbital (10 mg / mL stoktan 0.3 mL) enjekte edin, ardından% 70 EtOH ile sürünerek göğsü hazırlayın.
6. Kalbi perfüzyon kanülüne bağlamaya hazır olmak için bağlı bir 5-0 ipek dikiş hazırlayın. Cerrahi mikroskobun hemen yanına canül monte edin.
7. Önce karın ortasından çeneye kadar orta çizgi cilt kesisi yaparak, daha sonra büyük makasla peritona girerek, diyaframı künt diseksiyonla temizleyerek göğsü hızla açın. Daha sonra, her iki tarafın yan yönünde göğüs duvarını keserek makası kullanarak göğüs kafesini kesin.
8. Kalp ve göğüs duvarı (timus dahil) arasındaki lifli bağlantıları kesin. Sonra göğüs kafesini hep birlikte kesin. Küçük tokmaları ve makası kullanarak, kalbi apeks tarafından hafifçe kaldırın ve kalbin arka yönünü ortaya çıkarın.
9. Yükselen aorttaki innominat arterden hemen daha düşük bir şekilde parçalayarak kalbi ayıklayın ve kalbi hemen buz gibi PBS veya soğuk kalp perfüzyon ortamına yerleştirin. Daha sonra, buz gibi kalp perfüzyon ortamlarında ekilen kalpten kalan dokuyu hızla parçalara ayrıştırarak yükselen aortu ortaya çıkardı.
   NOT: Anatomik bir dönüm noktası olarak kullanmak için kalbi timus bozulmadan çıkarmak faydalıdır.
10. Mikro diseksiyonlu tokmalar ve makas kullanarak fazla doku aortunun etrafındaki alanı temizleyin. Aortu ince uçlu dikizler kullanarak canül üzerine yerleştirin ve 5-0 ipek dikişle sabitleyin.
    NOT: En iyi yerleşim genellikle aortun canül üzerinde yaklaşık 2 mm yukarı çıkmasıyla gerçekleşir.
11. 4 dakika boyunca 3 mL / dak'lık bir akış hızında kalp perfüzyon ortamı ile kanüle kalbi perfüzyon. Daha sonra ortamı kalp perfüzyon medyasından 15,0−17,5 dk perfüzyon için sindirim tamponu olarak değiştirin (Şekil 1A).
    NOT: Koroner akış hızı büyük olasılıkla artacak ve etkili doku sindirimini (yani soluk, şişmiş kalp) gösterecektir.
12. 5.4 adımında daha sonra kullanmak için perfüzyonun son dakikalarında 8 mL sindirim tampon akışı toplayın.
13. Kalbi çanak kemiğinden çıkarın ve 60 mm'lik plastik bir kültür kabına yerleştirin. Fazla dokuyu (yani aort, damarlar) çıkarın ve mekanik ayırmaya hazırlanmak için kalbi 2,5 mL sindirim tamponu içine batırın.
    NOT: Bu noktada, atria parçalara ayrılırken, bir deneyci atriyal hücre izolasyon protokolünü, ikinci bir deneyci ise ventrikül hücre izolasyonu yapmalıdır.

4. Atriyal hücre izolasyonu ve kültürü

1. Aryayı kalpten uzaklaştırın ve 30 mm'lik plastik bir kültür kabına yerleştirin. Mekanik ayırma için 0,75 mL sindirim tamponu içine batırın. Ventrikülleri 60 mm'lik tabakta tutun (adım 3.12) ve ayrı izolasyon yöntemlerini aynı anda gerçekleştirin (bölüm 5, Şekil 1B).
   NOT: Bu noktada, sol ve sağ taraftaki hücreleri izole etmek gerekirse, atria ve ventriküller daha fazla ayrılmaya tabi tutulabilir.
2. Atria'yı kıymaya ve alay etmeye başlayın, başlangıçta ince uçlu cerrahi makasla ve ardından daha fazla kıyma için ince forsepslerle. Dokuyu karıştırmaktan kaçının ve kas liflerini hızla ayırmayın.
3. Steril bir transfer pipet ucu kullanarak, dokuyu 15 dakika boyunca hafifçe karıştırmaya ve ayırmaya devam edin. Her 5 dakikada bir, 10x objektif brightfield mikroskobu altında dokudan atriyal miyosit disassosiyasyonunu gözlemleyin. Doku daha fazla sindirildikçe, daha küçük gözenek boyutuna sahip steril bir transfer pipet ucu kullanarak dokuyu hafifçe karıştırmaya ve ayırmaya devam edin.
4. Hücre süspansiyonu 2 mL steril mikro santrifüj tüpüne aktarın. 30 mm'lik plakayı 37 °C miyosit durdurma tamponu 1'in 0,75 mL'si ile durulayın ve hücre süspansiyonuyla birleştirin (bitiş hacmi = 1,5 mL).
5. Atriyal miyositlerin oda sıcaklığında 10 dakika boyunca yerçekimi ile tortulanmasına izin verin. Miyositlerin konik tüpün dibine çökeltilmesine izin vermek için hücre süspansiyonunun hafifçe çalkalanması ve görünür bir pelet oluşturması.
6. Hücre süspansiyonu 20 x g'da5 dakika santrifüj. Miyosit olmayanları içeren süpernatant'ı dikkatlice çıkarın ve atriyal miyositlerin peletini bozmadan steril bir pipet ucu kullanarak 15 mL polipropilen konik tüpe aktarın.
7. Miyosit olmayan fraksiyonu 20.000 x g'da 5 dakika santrifüj edin. Süpernatantı aspire ve miyosit olmayan peleti% 10 fetal baldır serumu (FCS) ile desteklenmiş 10 mL DMEM'de yeniden kullanın.
8. Hemositometre veya başka bir yöntem kullanarak miyosit olmayanları sayın, ardından deneysel ihtiyaçlara göre plakalayın veya floresanla aktive edilmiş hücre sıralama yoluyla bireysel spesifik hücre popülasyonlarına daha fazla izole edin (Şekil 1C).
9. İzole atriyal miyositlerin peletini atriyal miyosit kaplama ortamının 1 mL'sinde 4,6 adımdan yeniden uygulayın ve bu süspansiyonun 10 μL'lik kısmını bir hemositometreye uygulayın. Alan başına çubuk şeklindeki miyositlerin hücre sayısını gerçekleştirin.
10. Önceden kaplanmış deneysel plakalardan/slaytlardan laminin aspiratlayın ve izole edilmiş atriyal miyositleri 25 μM blebbistatin ile desteklenmiş uygun atriyal miyosit kaplama ortamı hacminde yeniden kullanın. Deneysel ihtiyaçlar başına istenen yoğunlukta plaka (Şekil 1C).
    NOT: Burada açıklanan uzun süreli kültleme için tipik kaplama yoğunluğu, dört odalı (1,7 cm²⁾cam slaytlar üzerinde 5 x 10⁵ hücre /odadır.

5. Ventrikül hücre izolasyonu ve kültürü

1. Önce ince uçlu cerrahi makas ve ardından daha fazla kıyma için ince forseps ile kalbi ventrikül dokusunu kıymaya ve alay etmeye başlayın (Şekil 1B). Kas liflerini hızla ayırarak dokuyu tedirgin etmekten kaçının.
2. Hücre süspansiyonunu 15 mL polipropilen konik tüpe aktarın. Plakayı 2,5 mL 37 °C miyosit durdurma tamponu 1 ile durulayın ve hücre süspansiyonu ile birleştirin (bitiş hacmi = 5 mL).
3. Steril bir transfer pipet ucu kullanarak, dokuyu 4 dakika boyunca hafifçe karıştırmaya ve ayırmaya devam edin. Bu hücre süspansiyonunun 10 μL'lik kısmını slayda uygulayın ve izolasyon kalitesini sağlamak için çubuk şeklindeki miyositlerin varlığını görselleştirin.
4. Hücre süspansiyonunu 100 μm steril naylon filtreden 50 mL polipropilen konik bir tüpe geçirin. Kalan hücreleri steril naylon filtreden yıkamak için 3.12 adımında toplanan 2 mL sindirim tamponunu kullanın.
5. Ventrikül miyositlerinin oda sıcaklığında 6 dakika boyunca yerçekimi ile tortulanmasına izin verin. Miyositlerin konisinin dibinde çökeltilmesine izin vermek için filtrelenmiş hücre süspansiyonu hafifçe çalkalayın ve görünür bir pelet oluşturun.
6. Ventriküler miyositlerin peletini bozmadan, süpernatantları (miyosit olmayan) dikkatlice çıkarın ve steril bir pipet ucu kullanarak 50 mL polipropilen konik bir tüpe aktarın. Miyosit olmayan fraksiyonu 20.000 x g'da 5 dakika santrifüj edin. Süpernatantı aspire edin ve miyosit olmayan peleti% 10 FCS ile desteklenmiş 10 mL DMEM'de yeniden kullanın.
7. Hemositometre kullanarak miyosit olmayanları sayın ve %10 FCS ile desteklenmiş uygun bir DMEM hacminde yeniden kullanın. Daha sonra, deneysel ihtiyaçlara göre plakalayın veya floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama yoluyla bireysel spesifik hücre popülasyonlarına daha fazla izole edin (Şekil 1C).
8. İzole ventrikül miyositlerini 2 mL miyosit durdurma tamponu 2'ye yeniden uygulayın ve hemositometreye 10 μL hücre süspansiyonu uygulayın. Alan başına çubuk şeklindeki miyositlerin hücre sayısını gerçekleştirin.
9. Ca^2+'nın adım adım bir paradigma kullanılarak yeniden tanıtılması
   NOT: Kalsiyum reintrodüksiyon adımları ventriküler miyositler için özeldir ve hücre ölümü ile sonuçlanacağı için atriyal miyositler için yapılmamalıdır.
   1. Ventrikül miyosit hücre süspansiyonu için 50 μL 10 mM CaCl₂ ekleyin. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 4 dakika kuluçkaya yatır.
   2. Ventrikül miyosit hücre süspansiyonu için 10 mM CaCl_2'lik ek 50 μL ekleyin. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 4 dakika kuluçkaya yatır.
   3. Ventrikül miyosit hücre süspansiyonu için 100 μL 10 mM CaCl₂ daha ekleyin. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 4 dakika kuluçkaya yatır.
   4. Ventrikül miyosit hücre süspansiyonu için 80 μL 100 mM CaCl₂ ekleyin. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 4 dakika kuluçkaya yatır.
10. Laminin kaplamayı plakalardan veya slaytlardan çıkarın ve izole edilmiş ventrikül miyositlerini deneysel ihtiyaçlara göre uygun bir ventriküler miyosit kaplama ortamı hacminde yeniden kullanın (Şekil 1C).
    NOT: Burada açıklanan uzun süreli kültleme için tipik kaplama yoğunluğu, dört odalı (1,7 cm²⁾cam slaytlar üzerinde 5 x 10⁵ hücre /odadır. Hücresel aşırı densifikasyon hücre topaklanmasını teşvik ettiği ve böylece plakaya bağlanmayı engellediği için% 75'ten fazla izdiah yoğunluğunda kaplamadan kaçının. Ayrıca, ilk orta değişim sırasında çok sayıda hücre kaybolacaktır. Hücre dışı Ca^2+, hiperkretsiyonu ve canlı miyositlerin kaybını teşvik ettiği için izolasyondan sonra hızlı bir şekilde plaka hücreleri.
11. Ventriküler miyositlerin en az 1 saat boyunca yerleşmesine ve yapışmasına izin verin. Daha sonra ortamı 25 μM blebbistatin ile desteklenmiş ventrikül miyosit bakım ortamına değiştirin.
    NOT: Ventriküler miyositler μM blebbistatin ile kaplattıktan sonra 96 saate kadar kültürlenebilir. Deneyler, blebbistatin yokluğunda ventriküler miyosit tutma ortamında yapılmalıdır.

Sonuçlar

Wildtype 10 haftalık C57b6/j fare kalbi tipik olarak 75.000−150.000 atriyal miyosit ve 1.0−1.5 x 10⁶ ventrikül miyositleri ile sonuçlanır. atriyal ve ventrikül miyositleri için yaklaşık %30−%50 verime eşittir^18,19. İzolasyonlar sırasında ve hemen sonrasında, uygulanabilir kardiyak miyositler çubuk şeklinde ve kasılmayan görünmelidir. İzole kardiyak miyositlerin çoğunluğu, etkili perfüzyonun bir göstergesi olan bu morfolojiyi uyarlamalıdır. Çubuk şeklindeki morfoloji de canlılığın bir tahmincisi olabilir. Protokol, hastalıklı bir fare kalbinden izole edilmiş miyositlerin ve miyosit olmayanların verimini ve canlılığını artırmayı amaçlamaktadır. Ayrıca, basınç aşırı yük kaynaklı kalp yetmezliği modelinde test edilmiştir (veriler gösterilmemiştir).

Miyositlerin ve miyosit olmayanların atriyal ve ventrikül dokusundan yeterli ve tekrarlanabilir izolasyonlarını doğrulamak için, hücreler kültürde çeşitli günlerde gözlenmiş ve fotoğraflanmıştır (Şekil 2). Ayrıca hücre tipine özgü transkript seviyelerini ölçmek için nicel ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) yapıldı. Kardiyak kas troponin T (Tnnt2) kardiyak miyositlerin bir belirtecidir ve hem atriyal hem de ventrikül kardiyak miyosit kültürlerinde sağlam bir şekilde ifade edildi (Şekil 3A). Buna karşılık, atriyal nazüretik peptit (tipik olarak fizyolojik koşullar altında sadece erişkin atriyal kardiyak miyositlerde ifade edilenNppa)ve miyosin ışık zinciri 2 (Ventriküler miyosit spesifik bir gen olanMyl2)sırasıyla atriyal ve ventriküler kardiyak miyosit kültürlerinde sağlam ve özel olarak ifade edilmiştir (Şekil 3B,C).

Fibroblast belirteçleri, transkripsiyon faktörü 21 (Tcf21), trombosit türevli büyüme faktörü reseptörü A (Pdgfra) ve monosit türevi hücre işaretleyici kümesi 68 (Cd68) sadece hem atriyal hem de ventrikül odalarından izole edilmiş miyosit dışı kültürlerde ifade edilmiştir (Şekil 3D−F). Miyosit olmayanların tüm kalp hücrelerinin ~ % 65'ini tehlikeye attığı ve bunların çoğunluğunun fibroblast veya monosit türevi bir soydan kaynaklandığı tahmin edilmektedir^18,19,23,24. Bu nedenle, bu iki soyun belirteçleri, kardiyak patolojinin çeşitli model ve etiyolojilerinin çalışmalarında bu hücresel popülasyonlara olan ilgi göz önüne alındığında temsili olarak seçilmiştir.

T-tübül belirteci dihidrosiridin (voltaja bağımlı (L tipi kalsiyum kanalı olan DHPR) ve ryanodin reseptörü (RYR2) için AMAM'lerin ve AMVM'lerin immünostainasyonu, izolasyon ve uzun vadeli kültür boyunca bozulmamış t-tübüller göstermiştir (Şekil 4A,B). Atriyal ve ventriküler miyositlere özgü ve karakteristik olan DHPR ve lokalizasyon bolluğu t-tübüllerin varlığını gösteriyordu. Ayrıca, DHPR'nin RYR2 immünostaining ile kolokalizasyonu bozulmamış diad yapıların bir göstergesiydi. Atriyal ve ventrikül kardiyak miyositlerde sarkolerik protein alfa-aktinin için immünostaining beklenen sarkolerik çizgi düzeni ile sonuçlandı. Sarkolerik çizgi deseni, çubuk şeklindeki morfolojik şekil ve TOPRO-3 ile nükleer boyama ile birlikte izole kardiyak miyositlerin saflığını ve canlılığını değerlendirmek için kullanılmıştır(Şekil 4C,D; mor ve kırmızı). Beklendiği gibi, ventrikül kardiyak miyositler büyüktü ve ortalama 150 mm uzunluk sergilerken, atriyal kardiyak miyositler ortalama ~ 75 mm'dir. Ayrıca, immünostaining analizi üzerine, atriyal kardiyak miyositler (ancak ventriküler kardiyak miyositler değil), endoplazmik retikül ve salgı granüllerine lokalizasyonun karakteristiği olan bir boyama kalıbında atriyal nazüretik peptidin (ANP) sağlam bir ifadesini sergiledi (Şekil 4C,D; yeşil).

Atriyal kardiyak miyositlere özgü bir özellik, kontrtil hücreye ek olarak endokrin hücre olarak sınıflandırılmasıdır. Atriyal miyositler bazal koşullar altında ANP salgılarken, salgılara yanıt olarak salgı artar (yani alfa-adrenerjik agonist, fenilefrin [PE]). Ayrıca, atriyal kardiyak miyositler ANP salgılar ve hormonun bir kısmını öncü durumundan (Pro-ANP, 15 kD) ürün peptidi (ANP 3kD)^16,17'yekadar birlikte işler. Bu salgı yeteneği, akut PE tedavisine yanıt olarak izole atriyal kardiyak miyositlerin ortamlarında ANP'nin immünoblot tespiti ile ölçülebilir (Şekil 4E). Atriyal kardiyak miyositin bu salgı ve işleme yeteneğinin kültleme koşullarına duyarlı olduğu bulunmuştur. Bu nedenle, atriyal miyosit kaplama ortamının deksametazon, insülin, transferrin ve selenyum ile desteklenmiş olması zorunludur.

Şekil 1: Retrograd kalp perfüzyonu, sindirimi ve hücre izolasyonunun şematik özeti. Gösterilenler, tek bir fare kalbinden aynı anda hem atriyal hem de ventrikül odalarından hücre izolasyonunda yer alan ana adımlardır. (A) Tek bir fare kalbi yükselen aort yoluyla hızla kanüle edilir ve retrograd bir şekilde perfüzyona maruz kalmaktadır. (B) Kalp daha fazla sindirim ve fiziksel ayrım için atriyal ve ventrikül dokularına ayrılır. (C) Yeterli sindirimi takiben, hücreler yerçekimi filtrasyonu yoluyla sonraki deneyler için kültürlenmiş toplam dört hücresel fraksiyona ayrılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Kültürde izole atriyal ve ventrikül kardiyak miyositlerin ve miyosit olmayanların morfolojik analizi. (A) İzole yetişkin fare atriyal miyositler (AMAM'ler), (B) yetişkin fare atriyal miyosit olmayanlar (AMANM'ler), (C) yetişkin fare ventrikül miyositleri (AMVM'ler) veya (D) yetişkin fare ventriküler miyosit olmayanlar (AMVNM'ler) 5 x 10⁵ hücre/odana, ilgili plakalı ortamdaki dört odalı (1,7 cm²⁾cam kaydıraklar üzerine kaplandı. Faz görüntüleri, epifluoresans mikroskobu altında 10x amaç kullanılarak kültürde belirtilen günlerde elde edilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: İzole hücre kültürlerinin temsili qRT-PCR analizi. RNA taze izole kardiyak miyositlerden ve miyosit olmayanlardan çıkarılmış ve hücreye özgü gen belirteçleri için mRNA düzeyleri qRT-PCR⁴ile belirlenmiştir. (A) Tnnt2, kardiyak kas troponin T (kardiyak miyosit belirteci); (B) Nppa, atriyal nazüretik peptit (atriyal miyosit belirteci); (C) Myl2, miyosin ışık zinciri 2 (ventriküler miyosit belirteci); (D) Tcf21, transkripsiyon faktörü 21 (fibroblast işaretleyici); (E) Pdgfra, trombosit türevi büyüme faktörü reseptörü A (fibroblast belirteci); (F) Cd68, farklılaşma kümesi 68 (monosit türevli hücre işaretçisi). Veriler, ANOVA'nın ve ardından Newman Keul'un post-hoc analizinin belirlediği gibi, diğer tüm değerlerden 0,05 farklı ± SEM anlamına gelir (*p ≤). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: İzole atriyal ve ventrikül kardiyak miyotirklerin temsili morfolojik ve fonksiyonel analizi. (A) AMAM'ler veya (B) AMVM'ler, yapışıklık sağlamak için 1 saat boyunca ilgili kaplama ortamlarında dört odalı (1,7 cm²⁾cam slaytlar üzerinde 5 x 10⁵ hücre/haznede kaplandı. Bunu ya atriyal miyosit kaplama medyasının yeniden beslenmesi ya da 16 saat boyunca blebbistatin ile desteklenmiş ventriküler miyosit bakım ortamına değiştirilmesi izledi. Kültürler daha sonra RYR2 (mor), DHPR (yeşil) ve nükleer leke TOPRO-3 (kırmızı) için immünostain edildi. (C) AMAM'ler veya (D) AMVM'ler izole edildi ve kaplandı, daha sonra a-actinin (mor), ANP (yeşil) ve TOPRO-3 (kırmızı) için immünostain edildi. Gösterilen, her hücre türü için iki temsili resimdir. (E) AMAM'ler atriyal miyosit kaplama medyasında 16 saat boyunca 12 kuyu kültürü çanağı üzerine 5 x 10⁵ hücre/kuyuda kaplandı. AMAM'lar daha sonra medya toplanmadan ve ANP için immünoblot analizine tabi tutulmadan önce araç veya ANP secretagogu (fenilenfrin, 50 mM) ile 0,5 saat boyunca tedavi edildi. İmmünoblot analizinden önce, hücresel kalıntıları gidermek ve gözlemlenen ANP'nin AMAM'lardan aktif salgılanması sonucu olduğundan emin olmak için medya örnekleri 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

Burada açıklanan prosedür kullanılarak izole edilen hücrelerin kalitesi, hücre verimi ve kültürdeki hücrelerin genel sağlığı tarafından belirlendiği gibi, çok sayıda kontrol edilebilir faktöre bağlıdır. Farenin kendisinden başlayarak, hayvana uygulanan stresin, muhtemelen aşırı sistemik kortizol, katekolaminler ve kalp dokusunun hiperkraktil durumu nedeniyle kültürde hücre verimini ve canlılığını olumsuz yönde etkileyebileceği belgelenmiştir^2,5,7. Bu nedenlerden dolayı, kurban etmeden önce hayvanı endişeye kapılmamak için önlemler alınmalıdır. Bu tür önlemler, hayvanın kafesini kaplamayı ve kurban etmeden önce vivarium dışındaki süreyi sınırlamayı içerir. Heparin ve ötanazi için yaygın olarak kullanılan birçok barbitürat sinyal yollarını etkileyebilir; bu nedenle, en uygun ötanazi yöntemi buna göre özelleştirilmelidir. Hayvanın yaşı, izole hücrelerin kalitesi ve canlılığı üzerinde önemli bir etkiye sahiptir, büyük olasılıkla doku sindirimini etkileyebilecek yaşlanma süreci ile eş zamanlı olarak meydana gelen interstisyel fibrozisin ilerleyici birikimi nedeniyle²⁵. Burada sunulmayan verilerde, yukarıda açıklanan yöntem 78 haftaya kadar farelerde çalışırken, bu yaşlı hayvanlarda hücrelerin kalitesi daha düşüktü.

Açıklanan izolasyon sürecindeki en kritik adım ve retrograd perfüzyon için langendorff aparatı içeren diğer protokoller, kalbin kanülasyonu ve ilk perfüzyonudur. Optimum sonuçlar için, kardiyak eksplantasyondan yükselen aortun kanülasyonuna ve perfüzyonun başlatılmasına kadar geçen süre 90 s'den fazla sürmemelidir. Zamana ek olarak, iki önemli faktör kanül derinliği ve perfüzyon cihazından hava emboli tanıtma olasılığıdır. Buna göre, kanül, aort köküne girmemek ve koroner damarların perfüzyonunu bozacak aort kapakçığını engellemek için yükselen aort içine ilerletilmelidir.

Sindirim işlemi sırasında, kardiyak miyosit kalsiyum toleransını azaltan sindirim enzimi kollajenazine uzun süre maruz kalmamak için kalbin sertliğini düzenli olarak test etmek önemlidir. İzole ventrikül miyosit kültürlerine kalsiyumun yeniden kazandırılması için yukarıda açıklanan protokol, mağaza tarafından işletilen kalsiyum kanalları aracılığıyla uygunsuz kalsiyum akını yoluyla kardiyak miyosit ölümünü sınırlamak için tasarlanmıştır. İzole atriyal miyosit kültürleri için adım adım kalsiyum reintrodüksiyonun yapılmaması gerektiği belirtilmelidir, çünkü bu kısa ve uzun vadeli kültür sırasında hücre ölümünü teşvik edecektir¹². Daha fazla önlem için, burada kullanılan perfüzyon ve sindirim tamponları, izole miyositlerin hiperkositlerini önlemek için kardiyak kas kas kası inhibitörü butanedione monoksim (BDM) ve her ikisi de miyosit canlılığını etkileyen kalsiyum paradoksunu içerir²⁶. Bununla birlikte, BDM'den blebbistatin'e geçiş, izole kardiyak miyositler için ortamın korunmasında tercih edilen sözleşme karşıtı ajan olduğu için not edilmelidir. Gösterilmeyen verilerde, blebbistatin izole kardiyak miyositlerin uzun süreli kültürü için daha fazla canlılık sağlar.

İzolasyondan hemen sonra, başta miyositler olmak üzere uzun süreli kardiyak hücre kültürünün sonuçlarını göz önünde bulundurmak önemlidir. Burada açıklanan kardiyak miyosit dışı izolasyon ve kült oluşturma protokolü, farklı kardiyak hücrelerin farklı yoğunluklarından ve yapışkan özelliklerinden yararlanan yaygın yöntemlere dayanmaktadır. Miyosit olmayanların yararı, kültürdeki yüksek genişleme potansiyelleridir; bu nedenle, kardiyak miyositlerin aksine, süreklilik için geçmeye elverişlidirler. Bununla birlikte, FBS ile orta takviye de dahil olmak üzere kültleme koşullarının kardiyak miyosit işlevselliğini etkileyebileceği bilinmektedir²⁷. Burada açıklanan kültür medyası, özellikle izole edilmiş atriyal miyositler için canlılığı optimize etmek ve fonksiyonel dengesizlikleri sınırlamak için tasarlanmıştır. Blebbistatin takviyesinin yokluğunda kültürden sonra izole kardiyak miyositlerde aşırı bozulmuş kontrendikasyon yeteneği gözlenmezken, elektrofizyoloji, kontrtiyas ve diğer tek hücreli in vivo bazlı moleküler sinyalizasyona odaklanan çalışmalar, sarkolerik yapı ve moleküler imzanın hala sağlam kalbi taklit ettiği izolasyondan kısa bir süre sonra yapılmalıdır.

Atriyal miyositin ayırt edici bir özelliği, sözleşme işlevlerine ek olarak muazzam salgı kapasitesine sahip bir endokrin hücre olarak ay ışığına sahip olmasıdır. Fizyolojik koşullar altında, atriyal miyositler, endoplazmik retikülumda ve^16,17uyaranı aldıktan sonra düzenlenmiş eksositoz için hazırlanmış büyük yoğun çekirdekli salgı granüllerinde depolanan büyük miktarlarda ANP üretir. Birçok izole atriyal miyosit çalışması benzersiz elektrofizyolojik özelliklerine odaklanırken, bu bir kültür medyası tasarlayacak ilk çalışmadır. Bu, uzun süreli canlılığın yanı sıra atriyal miyositlerin endokrin ve kontrtil özelliklerinin sürdürülen işlevlerinin teşvik edilmesini sağlar. Kültleme için bu yeni yöntemin yanı sıra tüm hücre tiplerinin atriyal ve ventrikül odalarından tek bir fare kalbinden eşzamanlı izolasyonu, hem atriyal hem de ventriküler miyositlerin fizyolojik ve patofizyolojik özellikleri üzerine yapılacak çalışmalar için yararlı ve etkili olacaktır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
(-)-Blebbistatin	Sigma-Aldrich	B0560
1 Liter Water Jacketed Reservoir	Radnoti	120142-1
2,3-Butanedione monoxime	Sigma-Aldrich	B0753
5-0 Silk Suture Thread	Fine Science Tools	18020-50
Adenosine	Sigma-Aldrich	A9251
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A6003
Bubble Trap Compliance Chamber	Radnoti	130149
Calcium Chloride Anhydrous	Fisher Scientific	C614-500
Carnitine hydrochloride	Sigma-Aldrich	C9500
Collagenase type 2	Worthington Biochemical Corporation	LS004176
Creatine	Sigma-Aldrich	C0780
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915
DMEM/F12 (1:1; 1X)	Gibco	11330-032
Dumont #7 - Fine Forceps	Fine Science Tools	11274-20
Epifluorescent micropscpe	Olympus X70	IX70
Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated)	Omega Scientific	FB-12	Lot# 206018
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-09
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11051-10
Headband Magnifiers	Fine Science Tools	28030-04
Hemacytometer (Bright-Line)	Hausser Scientific	1475
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
Inosine	Sigma-Aldrich	I4125
Insulin-Transferrin-Selenium-X	Gibco	51500-056
Isotemp 105 Water Bath	Fisher Scientific	NC0858659
Isotemp 3006	Fisher Scientific	13-874-182
Joklik Modified Minimum Essential Media	Sigma-Aldrich	M-0518
Laminin (Natural, Mouse)	Gibco	1795024	Lot# 1735572
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G8540
Masterflex C/L Single-Channel Variable-Speed Compact Pump	Cole-Palmer	EW-77122-24
Minimum Essential Medium (MEM 1X)	Gibco	12350-039
Molecular Biology Grade Water	Corning	46-000-CM
Pen Strep Glutamine (100X)	Gibco	10378-016
Spring Scissors - 6mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15020-15
Taurine	Sigma-Aldrich	T-8691