Method Article
Метод описывается для одновременной изоляции миоцитов и немиоцитов как от атрии, так и от желудочков сердца одной взрослой мыши. Этот протокол приводит к последовательной урожайности высоко жизнеспособных сердечных миоцитов и немиоцитов и детали оптимальных клеточных условий культуры для фенотипирования и анализа in vitro.
Изоляция и культивирование сердечных миоцитов у мышей имеет важное значение для дальнейшего понимания сердечной физиологии и патофизиологии. Хотя изоляция миоцитов от неонатальных сердец мыши относительно проста, миоциты из сердца взрослого мурина являются предпочтительными. Это потому, что по сравнению с неонатальными клетками, взрослые миоциты более точно повторить функцию клеток, как это происходит во взрослом сердце in vivo. Тем не менее, это технически трудно изолировать взрослых мыши сердечных миоцитов в необходимых количествах и жизнеспособности, что способствует экспериментальной тупик. Кроме того, опубликованные процедуры специфичны для изоляции либо предсердий или желудочков миоцитов за счет предсердий и желудочковой немиоцитов клеток. Описано здесь подробный метод для изоляции как предсердий и желудочков сердечных миоцитов, наряду с предсердий и желудочков, не-миоцитов, одновременно от одного сердца мыши. Также предусмотрены детали для оптимальных методов культивирования клеток, которые повышают жизнеспособность и функцию клеток. Данный протокол направлен не только на ускорение процесса изоляции клеток сердца взрослого мурина, но и на повышение урожайности и жизнеспособности клеток для исследования предсердий и желудочков сердечных клеток.
Культура первичных клеток является неотъемлемым ресурсом, который предлагает контролируемую среду для детального механистического исследования функции сердечного миоцита. Из-за их более прочный характер и легкость изоляции, неонатальной крысы предсердий и желудочков миоцитов были общим источником таких клеточныхкультур 1. Тем не менее, взрослые мыши предсердий и желудочковых миоцитов (AMAMs и AMVMs) являются весьма желательными для исследований in vitro, потому что их молекулярные и функциональные характеристики лучше имитировать взрослых клеток сердца. Таким образом, они стали актуальными для исследований, связанных с сердечными патологиями, большинство из которых развиваются увзрослых 2.
Кроме того, наличие и использование трансгенных и болезней мыши модели расширяет полезность изолированных взрослых миоцитов сердца. Протоколы изоляции и культуры мыши AMVMs для краткосрочных и долгосрочных исследований были описаны вмногочисленных предыдущих публикациях 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Для сравнения было описано несколько протоколов об изоляции АМАМ. Кроме того, те, которые описаны в первую очередь оптимизированы для острых исследований свежеисположенных клеток, без долгосрочного протокола культивирования,описанного на сегодняшний день 11,12,13. Таким образом, протоколы изоляции AMAM не были разработаны для обеспечения полезности и универсальности опубликованных протоколов для изоляции и культуры AMVMs. Кроме того, хотя новаторские исследования по изоляции AMAMs и AMVMs оказались находчивыми, нет протоколов для оптимальной одновременной изоляции и культуры как AMAMs, так и AMVMs, что приводит к эффективному использованию всего сердца для каждой подготовки.
До сих пор опубликованные протоколы изоляции AMAM и AMVM не были предназначены для одновременной изоляции обоих типов клеток, поскольку большинство исследований по функции предсердий и желудочков имеют камерный фокус. Например, АМАМ используются преимущественно для изучения электрофизиологии предсердий миоцитов, отчасти из-за интереса к мерцательной аритмии (АФ), наиболее распространенной сердечной аритмии в США. Тем не менее, АФ не является заболеванием, которое влияет на атрию в изоляции, и он был вовлечен как имеющие причинно-следственную роль в легкой и тяжелой дисфункции левогожелудочка 14. Кроме того, электрокардиограммы у пациентов с сердечной недостаточностью с сохранившейся фракцией выброса (HFpEF) показали, что размер левого предсердия является одним из сильнейших предикторов восприимчивости к сердечнойнедостаточности 15.
В дополнение к своей роли в электрофизиологии и контрактности, атриум также эндокринный орган, секреция кардиокинов (т.е. предсердий натриетарного пептида (ANP), которые гомеостатически регулируют кровяноедавление и объем 16,17. Кроме того, ANP (предположительно из предсердий миоцитов) имеет видную защитную и анти-гипертрофическую роль в желудочковыхмиоцитах 16,17. Хотя существует сильное влияние нейрогормональной связи между предтеч и желудочков в различных состояниях болезни, механизмы, лежащие в основе этой связи не были полностью изучены. Этот момент является еще одним примером всплеска исследований упором на 1) роль немиоцитов (в частности, сердечной фибробластов и иммунных клеток) в больном сердце и 2), как сердечной реконструкции в качестве функции болезни непосредственно влияет на сердечно-миоцитовжизнеспособности и глобальной сердечной функции 18,19,20,21,22. Таким образом, изучение сердечных клеток как из атрии, так и из желудочков является необходимым подходом, чтобы получить более полную картину их роли в кардио патофизиологии.
Следующий протокол описывает одновременное изоляцию предсердий и желудочков миоцитов и немиоцитов от сердца одной мыши в физиологических и патофизиологических условиях. Кроме того, этот метод является первым для описания оптимальных условий, необходимых для поддержания культур предсердий сердечных миоцитов, так как условия для поддержания культур желудочковых миоцитов уже опубликованы.
Все исследования, проведенные на мышах, о которых сообщается в настоящем документе, были рассмотрены и одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных SDSU и соответствуют Руководству по уходу и использованию лабораторных животных, опубликованному Национальным исследовательским советом.
1. Подготовка изоляционных и культурных средств массовой информации и покрытия
2. Изоляционный аппарат
3. Хирургическая процедура (не выживание)
4. Изоляция и культура предсердий
5. Изоляция желудочковых клеток и культура
Дикий тип 10-недельного C57b6/j мыши сердце обычно приводит к между 75000-150000 предсердий миоцитов и 1,0-1,5 х 106 желудочковых миоцитов, что приравнивается к приблизительной урожайности 30% -50% для предсердий и желудочковмиоцитов 18,19. Во время и сразу после изоляции, жизнеспособные сердечные миоциты должны появиться стержня формы и без контракта. Большинство изолированных сердечных миоцитов должны адаптировать эту морфологию, которая является признаком эффективной перфузии. Морфология формы стержня также может быть предиктором жизнеспособности. Протокол направлен на повышение урожайности и жизнеспособности миоцитов и немиоцитов, изолированных от больного сердца мыши. Кроме того, он был протестирован в модели давления перегрузки индуцированной сердечной недостаточности (данные не показаны).
Для подтверждения адекватной и реплицируемой изоляции миоцитов и немиоцитов от предсердий и желудочковой ткани, клетки наблюдались и фотографировались в различные дни в культуре(рисунок 2). Кроме того, была проведена количественная обратная транскрипционная полимеразная цепная реакция (qRT-PCR) для измерения уровней транскрипций, характерных для типа клеток. Тропонин сердечной мышцы T (Tnnt2) является маркером сердечных миоцитов и был надежно выражен как в предсердий и желудочковой сердечной культуры миоцитов(рисунок 3A). В отличие от предсердий натриуретического пептида (Nppa, который обычно выражается исключительно во взрослых предсердий сердечных миоцитов в физиологических условиях) и миозин световой цепи 2 (Myl2, который является желудочковой миоцитов специфический ген) были надежно и конкретно выражены в предсердий и желудочковой сердечной миоцитов культур, соответственно (Рисунок 3B,C).
Фибробласты маркеры, транскрипционный фактор 21 (Tcf21), тромбоцитов фактор роста рецептора A (Pdgfra), и моноцитов полученных клеточных маркеров кластера дифференциации 68 (Cd68) были исключительно выражены в немиоцитов культур, изолированных от предсердий и желудочковой камер (Рисунок 3ДЗФ). Подсчитано, что немиоциты компромисс 65% всех клеток сердца, и что большинство из них происходят из фибробласта или моноцитовполученных линии 18,19,23,24. Таким образом, маркеры для этих двух линий были выбраны в качестве репрезентативных, учитывая интерес к этим клеточным популяциям в исследованиях различных моделей и этиологии сердечной патологии.
Иммуностимулирование АМАМ и АМВМ для дигидропиридина т-трубного маркера (DHPR, который зависит от напряжения (L) типа кальция), а также рецептора райанодина (RYR2) продемонстрировали нетронутые т-трубы на протяжении всей изоляции и долгосрочнойкультуры (рисунок 4A,B). Обилие DHPR и локализации, которая была характерна и уникальна для предсердий и желудочков миоцитов, указывает на наличие т-труб. Кроме того, колокализация DHPR с помощью иммуностимулятора RYR2 является показателем нетронутых структур диада. Иммуностимация саркомерного белка альфа-актинина в предсердии и желудочковых сердечных миоцитах привела к ожидаемой саркомерной полосте. Саркомерная модель стриминга использовалась для оценки чистоты и жизнеспособности изолированных сердечных миоцитов в сочетании с морфологической формой в форме стержня и ядерным окрашиванием с TOPRO-3(рисунок 4C,D;фиолетовый и красный). Как и ожидалось, желудочковые сердечные миоциты были большими, выставляли среднюю длину 150 мм, в то время как предсердие сердечных миоцитов в среднем 75 мм. Кроме того, при иммуностепенинговом анализе миоциты предсердий (но не желудочковые сердечные миоциты) продемонстрировали надежное выражение предсердий натриуретического пептида (ANP) в окрашивание шаблона, который был характерен для локализации эндоплазмической ретикулум и секреторных гранул(рисунок 4C,D; зеленый).
Характеристикой уникально к предсердию сердечные миоциты своя классифицирование как эндокринная клетка в дополнение к контрактильной клетке. В то время как предсердие миоцитов выделяет ANP в базальных условиях, секреция увеличивается в ответ на сеньягог (т.е. альфа-адренаргический агонист, фенилэфрин (PE). Кроме того, предсердие сердечных миоцитов выделяют ANP и совместно обрабатывать часть гормона от его состояния предшественника (Pro-ANP, 15 кД) к продукту пептид (ANP 3kD)16,17. Эта секреторная способность может быть количественно через иммуноблот обнаружения АНП в средствах массовой информации изолированных предсердий сердечных миоцитов в ответ на острое лечение PE (Рисунок 4E). Было установлено, что эта секреторная и вычислительная способность предсердий сердечного миоцита чувствительна к условиям культивирования. Таким образом, крайне важно, чтобы предсердие миоцитов покрытие среды дополняется дексаметазон, инсулин, трансферрин, и селен.
Рисунок 1: Схематический обзор ретроградной перфузии сердца, пищеварения и изоляции клеток. Показаны основные шаги, связанные с изоляцией клеток от предсердий и желудочковой камер одновременно от сердца одной мыши. (A) Сердце одной мыши быстро cannulated через восходящую аорту и проникнуты в ретроградной манере. (B)Сердце разделено на предсердие и желудочковые ткани для дальнейшего пищеварения и физического разделения. (C)После адекватного пищеварения, клетки разделены через гравитационную фильтрацию в общей сложности четыре клеточные фракции, которые культурикулироваться для последующих экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Морфологический анализ изолированных предсердий и желудочков сердечных миоцитов и немиоцитов в культуре. (A) Изолированные взрослые мыши предсердий миоцитов(AMAMs),( B ) взрослых мыши предсердий немиоцитов(AMANMs),( C ) взрослых мыши желудочковых миоцитов(AMVMs),или ( D ) взрослых мыши желудочковых немиоцитов (AMVNMs) были покрыны на 5х 10 5 клеток / камеры на четырех-камерных (1,7 см) Фазические изображения были получены в указанные дни в культуре с помощью 10-х целей под микроскопом эпифлуоресценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Представитель qRT-PCR анализ изолированных клеточных культур. РНК была извлечена из недавно изолированных сердечных миоцитов и немиоцитов, а уровни мРНК для клеточных маркеров генов определялись qRT-PCR4. (A) Tnnt2, сердечная мышца тропонин T (сердечный маркер миоцитов); (B) Nppa , предсердиенатриуретического пептида (маркер миоцитов предсердий); (C) Myl2, световая цепь миозин 2 (желудочковый маркер миоцитов); (D) Tcf21, транскрипционный фактор 21 (фибробластный маркер); (E) Pdgfra, тромбоцитов, полученных рецептор фактора роста А (фибробласт маркер); (F) Cd68, кластер дифференциации 68 (моноцитов полученных клеточных маркеров). Данные представляют собой среднее ± SEM (на ≤ 0,05 евро отличается от всех других значений, определяемых ANOVA с последующим пост-специальным анализом Ньюмана Кеула). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Репрезентативный морфологический и функциональный анализ изолированных предсердий и желудочков сердечных миоктов. (A) AMAMs или ( B )AMVMsбыли поцарны на 5 х 105 ячеек / камеры на четырех камерах (1,7см 2) стеклянные слайды в соответствующих покрытия средств массовой информации в течение 1 ч, чтобы обеспечить адгезию. За этим последовало либо перекармливание предсердий миоцитов покрытие средств массовой информации или переход на желудочковый миоцит поддержания средств массовой информации дополняется blebbistatin для дополнительных 16 ч. Культуры были впоследствии зафиксированы затем иммунотели для RYR2 (фиолетовый), DHPR (зеленый), и ядерное пятно TOPRO-3 (красный). (C) AMAMs или ( D )AMVMsбыли изолированы и позолочены, затем иммунотелин для а-актинина (фиолетовый), ANP (зеленый), и TOPRO-3 (красный). Показаны два репрезентативных изображения для каждого типа ячейки. (E) AMAMs были поцаривания на 5 х 105 клеток / хорошо на 12 хорошо культуры блюдо для 16 ч в предсердий миоцитов покрытие средств массовой информации. АМАМ впоследствии лечились на 0,5 ч с помощью транспортного средства или секретагога ANP (фенилэфрин, 50 мМ), прежде чем средства массовой информации были собраны и подвергнуты иммуноблот-анализу для ННП. До анализа иммуноблота образцы средств массовой информации были центрифугированы на уровне 500 х г в течение 5 минут для удаления клеточного мусора и обеспечения того, чтобы наблюдаемый АНП был результатом активной секреции от АМАМ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Качество клеток, изолированных с помощью описанной здесь процедуры, определяемой выходом клеток и общим состоянием клеток в культуре, зависит от многочисленных контролируемых факторов. Начиная с самой мыши, было документально подтверждено, что стресс, наложенный на животное может негативно повлиять на урожайность клеток и жизнеспособность в культуре, предположительно из-за избыточного системного кортизола, катехоламинов, и гиперконтрактноесостояние сердечной ткани 2,5,7. По этим причинам следует принять меры, чтобы не насторожить животное перед жертвоприношением. Такие меры включают покрытие клетки животного и ограничение времени за пределами вивария до жертвоприношения. Гепарин и многие барбитураты, обычно используемые для эвтаназии, могут влиять на сигнальные пути; таким образом, оптимальный метод эвтаназии должен быть соответствующим образом настроен. Возраст животного оказывает значительное влияние на качество и жизнеспособность изолированных клеток, скорее всего, из-за прогрессивного накопления интерстициального фиброза, происходящего одновременно с процессом старения, который может повлиять на пищеварениетканей 25. В данных, не представленных здесь, в то время как метод, описанный выше, работает у мышей до 78 недель, качество клеток было ниже у этих старых животных.
Наиболее важным шагом в описанном процессе изоляции, а также других протоколах с аппаратом Лангендорфа для ретроградной перфузии является каннуляция и начальная перфузия сердца. Для достижения оптимальных результатов время от сердечной эксплантации до канюляции восходящей аорты и начала перфузии должно занять не более 90 с. Помимо времени, еще двумя важными факторами являются глубина канюли и возможность введения эмболии воздуха из перфузионные аппараты. Соответственно, канюлю следует продвинуть в восходящую аорту, чтобы не попасть в корень аорты и не мешать аортального клапана, что может повредить перфузию коронарных сосудов.
В процессе пищеварения важно регулярно тестировать жесткость сердца, чтобы избежать длительного воздействия пищеварительного фермента коллагеназы, который снижает толерантность к кальцию миоцитов сердца. Протокол, описанный выше для реинтродукции кальция в изолированных желудочковых миоцитов культур был разработан, чтобы ограничить сердечную смерть миоцитов через неуместный приток кальция через сохраненные управляемые каналы кальция. Следует отметить, что пошаговая реинтродукция кальция не должна проводиться для изолированных культур миоцитов предсердий, так как это будет способствовать гибели клеток во время краткосрочной идолгосрочной культуры 12. Для дальнейшей предосторожности, перфузии и пищеварения буферов, используемых здесь включают ингибитор сокращения сердечной мышцы butanedione моноксим (BDM), чтобы избежать гиперконтракции изолированных миоцитов, а также парадокс кальция, оба из которых влияют на жизнеспособностьмиоцитов 26. Тем не менее, переход от BDM к blebbistatin следует отметить, так как это предпочтительный анти-контрактильный агент в поддержании средств массовой информации для изолированных сердечных миоцитов. В данных не показано, blebbistatin придает большую жизнеспособность для долгосрочной культуры изолированных миоцитов сердца.
Сразу после изоляции важно учитывать последствия долгосрочной культуры сердечных клеток, особенно миоцитов. Описанная здесь сердечная изоляция немиоцитов и протокол культивирования основаны на общих методах, которые используют различные плотности и клеевые свойства различных сердечных клеток. Преимуществом немиоцитов является их высокий потенциал расширения в культуре; таким образом, в отличие от сердечных миоцитов, они подходят для прохода для увековечения. Тем не менее, известно, что культивирование условий, в том числе средних добавок с FBS, может повлиять на функциональность сердечного миоцита27. Описанные здесь культурные средства массовой информации были разработаны для оптимизации жизнеспособности и ограничения функциональных нарушений, особенно для изолированных миоцитов предсердий. Хотя никаких явных нарушений контрактильной способности наблюдалось в изолированных сердечных миоцитов после культуры в отсутствие blebbistatin добавок, исследования, которые сосредоточены на электрофизиологии, контрактности, и другие одноклеточные в виво основе молекулярной сигнализации должны быть выполнены вскоре после изоляции, когда саркомерная структура и молекулярная подпись по-прежнему имитирует, что из нетронутого сердца.
Отличительной чертой предсердий миоцита является его способность подрабатывать эндокринной клеткой с огромной секретной способностью, в дополнение к их контрактильной функции. В физиологических условиях, предсердий миоциты производят большое количество ANP, который хранится в эндоплазмической ретикулум и в больших плотных основных секреторных гранул, готовых к регулируемому экзоцитозу при получениистимула 16,17. Хотя многие изолированные исследования миоцитов предсердий сосредоточены на их уникальных электрофизиологических свойств, это первое исследование для разработки культуры средств массовой информации. Это обеспечивает долгосрочную жизнеспособность, а также содействие сохраненным функциям эндокринных и контрактильные свойства предсердий миоцитов. Этот новый метод культивирования, а также одновременной изоляции всех типов клеток от предсердий и желудочковых камер из сердца одной мыши будет полезен и эффективен для исследований физиологических и патофизиологических свойств как предсердий, так и желудочков миоцитов.
Авторов нечего раскрывать.
E.A.B. была поддержана Национальными институтами здравоохранения (1F31HL140850), Фондом ARCS, Inc., отделением Сан-Диего, и является Rees-Stealy Research Foundation Phillips Gausewitz, M.D. Scholar of the SDSU Heart Institute. E.A.B. и A.S.B. были поддержаны Фондом Инаямори. CCG (NIH) предоставляет R01 HL135893, R01 HL141463 и HL149931.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
(-)-Blebbistatin | Sigma-Aldrich | B0560 | |
1 Liter Water Jacketed Reservoir | Radnoti | 120142-1 | |
2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
5-0 Silk Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | |
Adenosine | Sigma-Aldrich | A9251 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A6003 | |
Bubble Trap Compliance Chamber | Radnoti | 130149 | |
Calcium Chloride Anhydrous | Fisher Scientific | C614-500 | |
Carnitine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C9500 | |
Collagenase type 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | |
Creatine | Sigma-Aldrich | C0780 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | |
DMEM/F12 (1:1; 1X) | Gibco | 11330-032 | |
Dumont #7 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
Epifluorescent micropscpe | Olympus X70 | IX70 | |
Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | Omega Scientific | FB-12 | Lot# 206018 |
Fine Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | |
Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
Headband Magnifiers | Fine Science Tools | 28030-04 | |
Hemacytometer (Bright-Line) | Hausser Scientific | 1475 | |
HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
Inosine | Sigma-Aldrich | I4125 | |
Insulin-Transferrin-Selenium-X | Gibco | 51500-056 | |
Isotemp 105 Water Bath | Fisher Scientific | NC0858659 | |
Isotemp 3006 | Fisher Scientific | 13-874-182 | |
Joklik Modified Minimum Essential Media | Sigma-Aldrich | M-0518 | |
Laminin (Natural, Mouse) | Gibco | 1795024 | Lot# 1735572 |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540 | |
Masterflex C/L Single-Channel Variable-Speed Compact Pump | Cole-Palmer | EW-77122-24 | |
Minimum Essential Medium (MEM 1X) | Gibco | 12350-039 | |
Molecular Biology Grade Water | Corning | 46-000-CM | |
Pen Strep Glutamine (100X) | Gibco | 10378-016 | |
Spring Scissors - 6mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15020-15 | |
Taurine | Sigma-Aldrich | T-8691 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены