JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يتم إنتاج BDNF المؤتلف الذي يحتوي على تسلسل Avi (BDNFAvi) في خلايا HEK293 بطريقة فعالة من حيث التكلفة ويتم تنقيته بواسطة الكروماتوغرافيا المتقاربة. ثم BDNFavi هو مباشرة أحادية الحيوية مع إنزيم BirA في أنبوب. يحتفظ BDNFavi و BDNFavi أحادية الفينيل البيولوجية بنشاطهم البيولوجي عند مقارنتها بـ BDNF المتوفرة تجاريًا.

Abstract

يتم إنتاج BDNF المؤتلفة التي تحتوي على تسلسل Avi (BDNFAvi) في خلايا HEK293 ثم تنقيتها بفعالية من حيث التكلفة بواسطة الكروماتوغرافيا التقاربية. تم تطوير بروتوكول قابل للاستنساخ مباشرة أحادية أحادية BDNFAvi مع إنزيم BirA في أنبوب. في هذا التفاعل، يحتفظ BDNFAvi أحادية الحيوية بنشاطه البيولوجي.

تعتبر المغذيات العصبية عوامل نمو مشتقة من الأهداف تلعب دورًا في تطوير الخلايا العصبية وصيانتها. وهي تتطلب آليات نقل سريعة على طول المسار الداخلي للسماح بالإشارة لمسافات طويلة بين مقصورات الخلايا العصبية المختلفة. وقد مكن تطوير الأدوات الجزيئية لدراسة الاتجار بالعقاقير العصبية من التتبع الدقيق لهذه البروتينات في الخلية باستخدام في تسجيل الجسم الحي. في هذا البروتوكول، قمنا بتطوير إجراء الأمثل وفعالة من حيث التكلفة لإنتاج BDNF أحادية الحيوية. يتم إنتاج متغير BDNF المؤتلف الذي يحتوي على تسلسل أفيين قابل لاتينيلية (BDNFAvi) في خلايا HEK293 في نطاق ميكروغرام ثم تنقيته في إجراء قابل للتطوير بسهولة باستخدام الكروماتوغرافيا التقارب. ويمكن بعد ذلك تنقية BDNF تكون monotinylated متجانسة من خلال رد فعل مباشرة في المختبر مع انزيم BirA في أنبوب. يمكن أن يكون النشاط البيولوجي لBDNF أحادية الحيوية (mbtBDNF) مترافقة إلى streptavidin-الاقتران مع مختلف الفلوروفوريس. تحتفظ BDNFAvi و mbtBDNF بنشاطهما البيولوجي الذي تم إثباته من خلال الكشف عن الأهداف الفوسفورية المصبّعة باستخدام البقع الغربية وتفعيل عامل النسخ CREB على التوالي. باستخدام نقاط الكم streptavidin، كنا قادرين على تصور ميغابايتBDNF استيعابية بالتزامن مع تفعيل CREB، الذي تم الكشف عنه مع جسم مضاد محدد فوسفو-كريب. بالإضافة إلى ذلك ، mbtBDNF مترافق إلى نقاط الكم streptavidin كانت مناسبة لتحليل النقل الرجعي في الخلايا العصبية القشرية التي تزرع في غرف microfluidic. وهكذا، في أنبوب إنتاج mbtBDNF هو أداة موثوقة لدراسة الفسيولوجية الإشارات ديناميات endosome والاتجار في الخلايا العصبية.

Introduction

الخلايا العصبية هي الوحدات الوظيفية للجهاز العصبي التي تمتلك مورفولوجيا معقدة ومتخصصة تسمح بالاتصال المتشابك ، وبالتالي ، فإن توليد السلوك المنسق والمعقد استجابة للمحفزات المتنوعة. الإسقاطات العصبية مثل dendrites والمحاور هي السمات الهيكلية الحرجة المشاركة في الاتصالات العصبية، وs neurotrophins هي اللاعبين الحاسمة في تحديد مورفولوجيا ودالة1. المغذيات العصبية هي عائلة من عوامل النمو المفرزة التي تشمل NGF، NT-3، NT-4، وعامل التغذية العصبية المستمدة من الدماغ (BDNF)2. في الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، تشارك BDNF في عمليات بيولوجية متنوعة بما في ذلك نقل الأعصاب ، التشجير ، نضوج العمود الفقري المتجني ، التقوية على المدى الطويل ، من بين أمور أخرى3،4. لذلك، BDNF يلعب دورا حاسما في تنظيم وظيفة الخلايا العصبية.

عمليات الخلوية المتنوعة تنظم ديناميات BDNF ووظيفته. على سطح الخلايا العصبية, BDNF يربط مستقبلات التروبوميوسين كيناز B (TrkB) و / أو مستقبلات المغذيات العصبية P75 (p75). يتم endocytosed BDNF-TrkB و BDNF-p75 complexs وفرزها في مختلف العضيات endocytic5,6,7,8. مطلوب الاتجار الصحيح داخل الخلايا من مجمع BDNF / TrkB لإشارات BDNF المناسبة في دوائر الخلايا العصبية المختلفة9,10,11. ولهذا السبب، فإن الفهم العميق لديناميات الاتجار بـ BDNF وتعديلاتها الموجودة في العمليات الفيزيولوجية المرضية أمر ضروري لفهم إشارات BDNF في الصحة والمرض. وسيساعد تطوير أدوات جزيئية جديدة ومحددة لرصد هذه العملية على دفع هذا المجال إلى الأمام والسماح بفهم أفضل للآليات التنظيمية المعنية.

هناك العديد من الأدوات المتاحة لدراسة الاتجار BDNF في الخلايا العصبية. تتضمن المنهجية الشائعة الاستخدام انتقال BDNF المؤتلف الموسومة بجزيئات الفلورسنت مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) أو البديل أحادي الميل الفلوري الأحمر المتحول من GFP mCherry12،13. ومع ذلك، عيب كبير من إفراط BDNF هو أنه يلغي إمكانية تقديم تركيزات معروفة من هذا neurotrophin. أيضا، قد يؤدي إلى السمية الخلوية، الغموض تفسير النتائج14. استراتيجية بديلة هي transfection من TrkB الموسومة epitope، مثل العلم-TrkB. هذه المنهجية تسمح لدراسة TrkB ديناميات استيعاب15، لكنه ينطوي أيضا على transfection ، والتي قد تؤدي إلى تغيير وظيفة TrkB والسمية الخلوية. للتغلب على هذه العقبات المنهجية، تم تطوير المتغيرات المؤتلفة من NGF و BDNF التي تحتوي على تسلسل Avi (BDNFAvi)، والتي يمكن أن تكون أحادية البيوتينات بواسطة إنزيم بييرا ثنائيات البيوتين،16،17. يمكن أن يقترن BDNF المؤتلفة من الاقتران مع أدوات مختلفة مرتبطة بالسنتبيدين ، والتي تشمل الفلوروفهورات والخرز والجسيمات النانوية شبه المغناطيسية وغيرها للكشف عنها. من حيث التصوير الخلايا الحية، أصبحت النقاط الكمومية (QD) تستخدم كثيرا fluorophores، كما لديهم خصائص مرغوب فيه لتتبع الجسيمات المفردة، مثل زيادة السطوع ومقاومة لphotobleaching بالمقارنة مع الفلوروفوريس جزيء صغير18.

وقد تم إنتاج ثنائيات أحادية BDNF (mbtBDNF) باستخدام BDNFAvi عن طريق co-transfection من plasmids القيادة التعبير عن BDNFAvi وبيرا، تليها تنقية البروتين المؤتلف عن طريق الكروماتوغرافيا تقارب مع غلة 1-2 ميكروغرام من BDNF لكل 20 مل من HEK293 وسائل الإعلام ثقافة مكيفة17. هنا، نقترح تعديل هذا البروتوكول الذي يسمح لتنقية BDNFAvi من 500 مل من وسائل الإعلام HEK293 مكيفة، والتي تسعى إلى تحقيق أقصى قدر من الانتعاش البروتين في بروتوكول قائم على عمود الكروماتوغرافيا لسهولة التلاعب. وكيل transfection المستخدمة، البولي ايثيلينمين (PEI)، يضمن طريقة فعالة من حيث التكلفة دون التضحية العائد transfection. وقد تم تكييف خطوة أحادية ثنائي الفينيل إلى تفاعل في المختبر لتجنب المضاعفات المرتبطة بالانباتات المشتركة ولضمان وضع علامات متجانسة من BDNF. وقد تجلى النشاط البيولوجي لـ mbtBDNF من خلال تجارب المجهر لطخة الغربية وفلوريسنس، بما في ذلك تنشيط pCREB والتصوير الحي للخلايا لدراسة النقل المحوري الرجعي لـ BDNF في الغرف الدقيقة الفلورية. استخدام هذا البروتوكول يسمح للإنتاج الأمثل، عالية الإنتاجية من متجانسة أحادية الحيوية و BDNF النشطة بيولوجيا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وقد أجريت جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية المعتمدة للجنة الوطنية الشيلية للبحوث العلمية والتكنولوجية. وقد وافقت على البروتوكولات المستخدمة في هذه الدراسة من قبل لجان الأمن البيولوجي وأخلاقيات البيولوجيا ورعاية الحيوان التابعة جامعة كاتالونيا في شيلي. وقد وافقت لجنة أخلاقيات البيولوجيا ورعاية الحيوان التابعة لمنظمة "الجامعة البابوية الكاثوليكية في شيلي" على إجراء تجارب تشمل الفقاريات.

ملاحظة: تم تصميم البروتوكول التالي لتنقية BDNFAvi من حجم إجمالي 500 مل من المتوسط مكيفة المنتجة في خلايا HEK293. كمية المتوسط المشروطة التي يتم إنتاجها ومعالجتها لتنقية BDNFAvi يمكن أن يكون أعلى أو تحان حسب الحاجة. ومع ذلك، قد يكون من الضروري تحقيق مزيد من التحسين في ظل هذه الظروف. ويمكن الاطلاع على تكوين وسائط الثقافة والمخازن العازلة المستخدمة في جميع أجزاء البروتوكول في مواد تكميلية.

1. إنتاج وتنقية BDNFAvi من HEK293-مكيفة وسائل الإعلام

  1. نقل خلايا HEK293
    1. تنمو خلايا HEK293 إلى التقاء 70٪ في 15 تكملة DMEM المتوسطة (10٪ مصل الجنين البقري، 1x تكملة الغلوتامات، 1x المضادات الحيوية / المضادة للصم) في 15 سم الأطباق ثقافة في 37 درجة مئوية.
    2. تغيير الوسيطة إلى المخزن المؤقت transfection.
    3. إعداد خليط بي أي-الدنا لتحول. استخدام اثنين من أنابيب المخروطية 15 مل مختلفة لتخفيف الحمض النووي وجزيرة الأمير إدوارد 25 K، على التوالي. تمييع 20 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد في حجم النهائي من 500 ميكرولتر في أنبوب واحد. تخفيف 60 ميكروغرام من 25K PEI خطي في حجم النهائي من 500 ميكرولتر في أنبوب آخر. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    4. بعناية ماصة حل الحمض النووي في أنبوب PEI، خلط مرة واحدة عن طريق أعلى إلى أسفل الحركة. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة.
    5. بالتنقيط 1 مل من خليط بي اي-الحمض النووي في جميع أنحاء كل طبق 15 سم. احتضان الخلايا مع خليط بي أي-الحمض النووي لمدة 3 ساعة في 37 درجة مئوية.
    6. تغيير وسيطة إلى عازلة حضانة جديدة.
  2. جمع الوسائط وتخزينها
    1. جمع المتوسطة من جميع الأطباق 48 ساعة بعد transfection من خلايا HEK293. إعداد الأرصدة المركزة من الحلول الموصوفة في قسم "العازلة التعديل الفائقة" من الملف التكميلي 1 وإضافتها إلى عظمى HEK293 لتحقيق التركيزات النهائية المذكورة.
      ملاحظة: يمكن تجاهل الخلايا أو استردادها لمزيد من التحليل.
    2. احتضان المتوسطة في الجليد لمدة 15 دقيقة.
    3. Aliquot الوسط في أنابيب الطرد المركزي.
    4. جهاز طرد مركزي في المتوسط 10،000 س ز لمدة 45 دقيقة في جهاز طرد مركزي 4 °C. هذه الخطوة تسمح بإزالة حطام الخلية والخلايا الميتة المعلقة في وسائل الإعلام.
    5. جمع ااابر، إضافة BSA بتركيز نهائي من 0.1٪. ثم تخزين في -20 درجة مئوية. ويمكن نقل وسائل الإعلام قبل تجميد لذوبان أسرع خلال خطوة تنقية.
      ملاحظة: أوقات التخزين من الوسائط المُعدّلة المجمدة التي تصل إلى شهرين قد أسفرت عن نتائج إيجابية، لم يتم تقييم أوقات التخزين الأطول.
  3. تركيز وسائل الإعلام وتنقيتها
    1. ذوبان وسائل الإعلام في 37 درجة مئوية حمام thermoregulated.
    2. Aliquot وسائل الإعلام في أنابيب الطرد المركزي.
    3. جهاز طرد مركزي متوسط ل 1 ساعة في 3,500 x ز في جهاز طرد مركزي مبرد 4 °C. وتسمح هذه الخطوة بإزالة بقايا حطام الخلايا لضمان التدفق الكافي عبر عمود الكروماتوغرافيا.
    4. استخدام المكثفات البروتين مع قطع 10 كيلو Da للحد من وسائل الإعلام من 500 مل إلى 100 مل. اتبع معلمات الطرد المركزي الموصى بها من قبل الشركة المصنعة للحصول على التركيز الأمثل.
    5. إضافة 500 μL من ني NTA أنغروس الخرز إلى وسائل الإعلام المركزة واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في الروك.
    6. تجميع جهاز الكروماتوغرافيا وصب وسائل الإعلام في ذلك. السماح لها بقية لمدة 5 دقائق ثم فتح stopcock 2-الاتجاه للسماح للتدفق المتوسط من خلال.
    7. غسل الخرز مع 5 مل من مخزن الغسيل لمدة 5 دقائق. تأكد من إعادة تعليق الخرز في العمود. استنزاف المخزن المؤقت من خلال فتح stopcock 2-way. كرر 3 مرات.
    8. إضافة 1 مل من العازلة elution إلى العمود. تأكد من إعادة تعليق الخرز في العمود. احتضان لمدة 15 دقيقة، ومن ثم جمع eluate في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. كرر هذه الخطوة 3 مرات ل elution كاملة من BDNFAvi.
    9. تحميل 5 ميكرولتر من كل مُلَزات وتركيزات مختلفة من BDNF المتاحة تجارياً (40-160 نانوغرام) في هلام بولي كلريد بنسبة 15%. الكشف عن البروتين النقي عن طريق النشاف الغربية باستخدام المضادة BDNF المضادة.
    10. تحديد تركيز BDNFAvi المنقى في كل مُلَح باستخدام منحنى التركيز المعد مع BDNF المتوفرة تجاريًا.
    11. Aliquot وتخزين BDNFAvi المنقى في -80 درجة مئوية.

2. في المختبر أحادية ثنائي الفينيل من BDNFAvi باستخدام انزيم بيرا

  1. في المختبر أحادية التفاعل البيولوجي
    1. إعداد حلول المخزون المركزة من الكواشف العازلة biotinylation. استخدام الأسهم المركزة سوف يقلل من تخفيف البروتين المؤتلف.
    2. خذ aliquot من 800 نانوغرام من BDNFAvi وإضافة الكواشف العازلة biotinylation و BirA انزيم في علاقة 1:1 الضرس إلى BDNF. على سبيل المثال، لحجم التفاعل النهائي 200 μL إضافة; 100 ميكرولتر من الحل الذي يحتوي على 800 نانوغرام من BDNFAvi، 20 ميكرولتر بيسين 0.5 م 8.3، 20 ميكرولتر ATP 100 mM، 20 ميكرولتر MgOAc 100 مل م، 20 ميكرولتر د-البيوتين 500 ميكرومتر، 0.8-1 ميكروغرام إلى 1 ميكرولتر من BirA-GST، وكاملة إلى 200 ميكرولتر مع المياه فائقة الخطورة.
      ملاحظة: تم إجراء تفاعلات اتينيل ناجحة مع 400 ميكروغرام من 400 ميكرولتر تحتوي على تركيز حوالي 30 نانوغرام / ميكرولتر BDNFAvi ، مما أدى إلى BDNFAvi ثنائي حيوي متجانس إلى تركيز نهائي من ~ 20 نانوغرام / ميكرولتر في التفاعل النهائي.
    3. احتضان الخليط في 30 درجة مئوية في فرن التهجين لمدة 1 ساعة. اخلط المحتوى عن طريق انعكاس الأنبوب كل 15 دقيقة.
    4. إضافة نفس وحدة التخزين من ATP و BirA كما في الخطوة 2.1.2 وكرر الخطوة 2.1.3.
    5. يُخزن عند -80 درجة مئوية لإجراء التحليلات المستقبلية أو الاحتفاظ به على الجليد للاستخدام الفوري (على سبيل المثال، مراقبة جودة المعالجة البيولوجية).
  2. تحليل ثنائيات البيوت
    1. كتلة 30 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي streptavidin لكل عينة BDNF في 1 مل من العازلة حظر. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة في أنبوب microcentrifuge الدوار.
    2. عجلت الخرز المغناطيسي باستخدام رف فصل المغناطيسي لمدة 3 إلى 5 دقائق أو حتى المخزن يظهر تماما مسح الخرز وتجاهل العازلة حظر.
    3. إضافة 50 ميكرولتر من العازلة منع جديدة و 80 نانوغرام من أحادية الحيوية BDNFAvi (mbtBDNF) عينة إلى الخرز، مع التأكد من resuspend لهم تماما عن طريق pippeting.
    4. احتضان في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في دوار أنبوب microcentrifuge الغزل في حوالي 20 دورة في الدقيقة.
    5. جمع الخرز باستخدام رف الفصل المغناطيسي لمدة 3 إلى 5 دقائق، وجمع افرا، والحفاظ على aliquot 30 ميكرولتر للتحليل.
    6. غسل الخرز مرة واحدة مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، ومن ثم جمعها باستخدام رف الفصل المغناطيسي لمدة 3 إلى 5 دقائق. استرداد فائقة والحفاظ على aliquot 30 ميكرولتر للتحليل.
    7. إضافة 10 μL من 4x تحميل العازلة إلى الخرز.
    8. سخني العينات إلى 97 درجة مئوية لمدة 7 دقائق لـ mbute mbtBDNF.
    9. كشف mbtBDNF باستخدام المضادة المضادة BDNF محددة19.

3 - التحقق من النشاط البيولوجي لـ mbtBDNF

  1. الكشف عن pTrkB وperk بواسطة لطخة الغربية.
    1. بذور 2 مليون الخلايا العصبية القشرية الفئران في أطباق ثقافة 60 ملم.
    2. ثقافة الخلايا العصبية لمدة 7 أيام (DIV7). ثم، تغيير متوسطة إلى غير مكملة االأصبي المتوسط عند بدء التجربة.
    3. بعد ساعة واحدة من التغيير المتوسط، أضف mbtBDNF إلى تركيز نهائي قدره 50 نانوغرام/مل. احتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية. الحفاظ على طبق التحكم السلبي (غير محفزة مع BDNF) وطبق تحكم إيجابي (تعامل مع 50 نانوغرام / مل من BDNF المتاحة تجاريا).
    4. جمع المتوسطة وغسل بلطف كل طبق مع 1X برنامج تلفزيوني. جمع وتجاهل 1X برنامج تلفزيوني.
    5. ضع الأطباق على الجليد وأضف 50-80 ميكرولتر من عازلة التحلل إلى كل طبق. استخدام مكشطة الخلية لlyse الخلايا.
      ملاحظة: يجب تنفيذ خطوة التحلل بأسرع وقت ممكن لتجنب dephosphorylation البروتين وتدهور. 1-2 دقيقة من الكشط قوية كافية لتصور البروتينات من الفائدة من قبل النشاف الغربية.
    6. جمع العازلة تحلل ويحرك في خلاط دوامة في أعلى سرعة لمدة 5 s.
    7. الطرد المركزي العازلة تحلل في 14،000 س ز (4 درجة مئوية) لمدة 10 دقيقة. جمع supernatant.
    8. كمي محتوى البروتين من عظمى من قبل بروتوكول الكم البروتين BCA20.
    9. إضافة العازلة التحميل إلى aliquot التي تحتوي على 30-50 ميكروغرام من البروتين لكل حالة وتحميله في هلام بولياكريلاميد 12٪ لنشاف الغربية. الكشف عن pTrkB وperK باستخدام أجسام مضادة فوسفو محددة للتحقق من النشاط البيولوجي BDNFAvi.
  2. التحقق من النشاط البيولوجي BDNF-QD بواسطة pCREB من الفلورا المناعية.
    1. البذور 40،000 الخلايا العصبية القشرية الفئران في 10 ملم يغطي، سابقا autoclaved وتعامل مع بولي-L-ليسين كما وصف سابقا21.
    2. ثقافة الخلايا العصبية لمدة 7-8 أيام في العازلة صيانة الخلايا العصبية (انظر المواد التكميلية) في 37 ºC.
    3. لبدء التجربة، قم بتغيير الوسط المتوسط إلى المتوسط العصبي غير المُؤدّن وحضن في 37 درجة مئوية لمدة ساعة.
    4. إعداد mbtBDNF مترافق إلى نقاط الكم (BDNF-QD) عن طريق إضافة إلى mbtBDNF aliquot، وحجم اللازمة من نقطة الكم streptavidin conjugate (Streptavidin-QD) لتحقيق 1:1 BDNF-QD ضروس النسبة. ثم، تخفيف إلى 20 ميكرولتر مع المتوسطة العصبية. التفاف أنبوب في رقائق الألومنيوم لحمايته من الضوء.
      ملاحظة: إعداد أنبوب آخر مع نفس حجم نقطة الكم streptavidin conjugate وتمييعه إلى 20 ميكرولتر مع المتوسطة العصبية كتحكم سلبي.
    5. احتضان mbtBDNF / streptavidin QD خليط لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الروك.
    6. تخفيف BDNF QD إلى التركيز النهائي المطلوب (200 pM و 2 nM) في الوسط العصبي.
    7. بعد 1 ح من الحضانة مع غير مكملة العصبية المتوسطة، وتحفيز الخلايا العصبية مع BDNF-QD أو Streptavidin-QD (السيطرة) إلى تركيز نهائي من 200 pM و 2 nM من BDNF لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.
    8. غسل الأغطية 3 مرات مع 1X برنامج تلفزيوني (37 درجة مئوية) وإصلاح الخلايا لمدة 15 دقيقة عن طريق علاج غطاء مع 4٪ حل شبهformaldehyde تحتوي على مثبطات فوسفاتاز.
    9. غسل الخلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني، ومن ثم احتضان مع حظر / permeabilization العازلة (BSA 5٪، تريتون X-100 0.5٪، 1x فوسفاتاز المانع) لمدة 1 ساعة.
    10. احتضان مع الأجسام المضادة pCREB 1:500 (في 3٪ BSA، 0.1٪ تريتون X-100) بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
    11. في اليوم التالي، اغسل 3 مرات مع 1x PBS، واحتضان لمدة 1 ساعة مع الأجسام المضادة الثانوية 1:500 (3٪ BSA، 0.1٪ تريتون X-100).
    12. غسل 3 مرات مع 1X PBS. إضافة حل البقع النووية Hoechst (5 ميكروغرام / مل) لمدة 7 دقائق.
    13. غسل 3 مرات مع 1X برنامج تلفزيوني وجبل.
  3. التصور من النقل المحوري الرجعية من BDNF QD في الخلايا العصبية الحية
    1. إعداد غرف microfluidic والخلايا العصبية البذور كما هو موضح سابقا16.
    2. بعد 7-8 أيام في الثقافة، وتغيير المتوسطة إلى غير مكملة العصبي المتوسط.
    3. إعداد mbtBDNF مترافق إلى نقاط الكم (BDNF-QD) عن طريق إضافة إلى mbtBDNF aliquot، وحجم اللازمة من نقطة الكم streptavidin conjugate (Streptavidin-QD) لتحقيق 1:1 BDNF-QD ضروس النسبة. ثم، تخفيف إلى 20 ميكرولتر مع المتوسطة العصبية. التفاف أنبوب في رقائق الألومنيوم لحمايته من الضوء.
      ملاحظة: إعداد أنبوب آخر مع نفس حجم نقطة الكم streptavidin conjugate وتمييعه إلى 20 ميكرولتر مع المتوسطة العصبية كأداة تحكم.
    4. احتضان mbtBDNF / streptavidin QD خليط لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الروك.
    5. تخفيف BDNF QD إلى التركيز النهائي المطلوب (2 ن م).
    6. بعد 1 ساعة من الحضانة مع المتوسطة العصبية غير مكملة إضافة BDNF QD أو خليط التحكم في مقصورات محور عصبي من غرفة microfluidic. احتضان لمدة 210 دقيقة في 37 درجة مئوية لضمان النقل العكسي صافي BDNF QD.
    7. للتصوير الخلية الحية، تصور نقل الوراء المحوري في الجزء من microgrooves التي هي قريبة إلى مقصورة الجسم الخلية باستخدام هدف 100x باستخدام مجهر مناسب لهذه الغرض (37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون). الحصول على الصور في 1 إطار / ثانية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

استخدام بروتوكول يستند إلى عمود الكروماتوغرافي يسمح بمعالجة كميات كبيرة من وسائط HEK293 مكيفة. في الشكل 1، تظهر نتائج تنقية BDNFAvi من 500 مل من وسائل الإعلام المكيفة. elutions متتالية من BDNFAvi من ني NTA أغاروز الخرز العائد انخفاض تركيزات BDNFAvi (الشكل 1A). بعد أربعة من التلمي?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في هذه المقالة، يتم وصف منهجية الأمثل لإنتاج وتنقية mbtBDNF في إجراء قائم على اللونية تقارب، استنادا إلى عمل سونغ والمتعاونين17. وتشمل التحسينات استخدام كاشف نقل فعال من حيث التكلفة (PEI) مع الحفاظ على كفاءة أساليب نقل أكثر تكلفة مثل الدهون. ويترجم هذا التحسين إلى تخفيض كبير في تكلف...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

الكتاب الاعتراف بامتنان الدعم المالي من Fondecyt (1171137) (FCB) ، ومركز القاعدية للتميز في العلوم والتكنولوجيا (AFB 170005) (FCB) ، Millenium - Nucleus (AFB 170005) ، ميلينيوم - نيوكليوس (AFB) P07/011-F( FCB)، وجائزة ويلكوم تراست لكبار المحققين (107116/Z/15/Z) (GS) وجائزة مؤسسة معهد بحوث الخرف في المملكة المتحدة (GS). وقد دعم هذا العمل اتحاد الميكروسكوبيا أفانزادا UC .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2 way stopcockBioRad7328102Chromatography apparatus component
2-mercaptoethanolSigmaM6250BDNF elution buffer
Acrylamide/BisacrylamideBioRad1610154SDS-PAGE gel preparation
Amicon Ultra-15 10KMilliporeUFC901024BDNF concentration
Ammonium PersulfateSigmaA9164SDS-PAGE gel preparation
anti B-III-Tubulin antibodySigmaT8578Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti BDNF antibodyAlomoneAGP-021Western blot assays for BDNF quantification
anti BDNF antibodyAlomoneANT-010Western blot assays for BDNF quantification
Anti ERK antibodyCell Signaling9102Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pCREB antibody (S133)Cell Signaling9198Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pERK antibody (T202, Y204)Cell Signaling4370Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pTrkB antibody (Y515)Abcamab109684Western blot assays for BDNF biological activity detection
Antibiotic/AntimycoticGibco15240-062HEK293 maintenance
ATPSigmaA26209BDNF monobiotinylation buffer
B-27 SupplementGibco17504-044Neuron maintenance
BicineSigmaB3876BDNF monobiotinylation buffer
BirA-GSTBPS Bioscience70031Enzyme for BDNF AviTag monobiotinylation
Bovine Fetal SerumHyCloneHC.SH30396.02HEK293 maintenance
Bovine Serum AlbuminJackson ImmunoResearch001-000-162BDNF buffer modification component, blocking buffer for western blot and immunofluorescence
D-BiotinSigmaB4639BDNF monobiotinylation buffer
DMEM High Glucose MediumGibco11965-092Neuron seeding
DMEM MediumGibco11995-081HEK293 maintenance
Econo Column FunnelBioRad7310003Chromatography apparatus component
EDTAMerck108418
EZ-ECL KitBiological Industries1633664Protein detection by western blotting
GlutamaxGibco35050-061Neuron and HEK293 maintenance
GlycerolMerck104094BDNF elution buffer, lysis buffer for western blot assays
Hettich Rotina 46R CentrifugeHettichDiscontinuedCentrifuge used for clearing the medium of debris
Hettich Universal 32R CentrifugeHettichDiscontinuedCentrifuge used for protein concentrator centrifugation
Horse SerumGibco16050-122Neuron seeding
ImageQuant LAS 500GE Healthcare Life Sciences29005063Western blot image acquisition
ImidazoleSigmaI55513BDNF buffer modification component
KClWinklerBM-1370PBS component
KH2PO4Merck104873PBS component
LamininInvitrogen23017-015Cover coating for compartmentalized neurons
Luer Tubing AdaptorBioRad7323245Chromatography apparatus component
Luminata™ Forte Western HRP SubstrateMilliporeWBLUF0100Protein detection by western blotting
Mg(CH3COO)2Merck105819BDNF monobiotinylation buffer
Mowiol 4-88Calbiochem475904Mounting reagent for immunofluorescence assays
MyOne C1 Streptavidin Magnetic BeadsInvitrogen65001Biotinylation verification
Na2HPO4Merck106586BDNF buffer modification component
NaClWinklerBM-1630PBS component, BDNF buffer modification component
NaH2PO4Merck106346BDNF buffer modification component
Neurobasal MediumGibco21103-049Neuron maintenance
Ni-NTA Agarose BeadsQiagen30210BDNF AviTag purification
Nikon Ti2-ENikonMicroscope for fluorescence imaging
Nitrocellulose MembraneBioRad1620115Protein transfer for western blotting
ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS cameraHamamatsuC13440-20CUCamera for epifluorescence imaging
P8340 Protease Inhibitor CocktailSigmaP8340BDNF buffer modification component
ParaformaldehydeMerck104005Fixative for immunofluorescence assays
Penicillin/StreptomycinGibco15140-122Neuron maintenance
Poli-D-LysineCorningDLW354210Cover coating for compartmentalized neurons
Poli-L-LysineMilliporeP2363Cover coating for non-compartmentalized neurons
Poly-Prep Chromatography ColumnBioRad7311550Chromatography apparatus component
Polyethyleneimine 25KPolysciences Inc.PLY-0296HEK293 transfection
Quantum Dots 655 streptavidin conjugateInvitrogenQ10121MPMonobiotinylated BDNF AviTag label for live and fixed cell experiments
SaponinSigmaS4521Detergent for immunofluorescence assays
Syldgard 184 silicone elastomer basePoirot4019862Microfluidic chamber preparation
TEMEDSigmaT9281SDS-PAGE gel preparation
TrisWinklerBM-2000Lysis buffer component
Triton X100Merck108603Cell permeabilization in immunofluorescence and western blot assays
Trypsin-EDTA 0.5%Gibco15400-054HEK293 passaging

References

  1. Huang, E., Reichardt, L. Neurotrophins: Roles in Neuronal Development and Function. Annual Review of Neuroscience. 24, 677-736 (2001).
  2. Skaper, S. D. The neurotrophin family of neurotrophic factors: an overview. Methods in Mollecular Biology. 846, 1-12 (2012).
  3. Gonzalez, A., Moya-Alvarado, G., Gonzalez-Billault, C., Bronfman, F. C. Cellular and molecular mechanism regulating neuronal growth by brain-derived neurotrophic factor. Cytoskeleton. 73 (10), 612-628 (2016).
  4. Cunha, C., Brambilla, R., Thomas, K. A simple role for BDNF in learning and memory. Frontiers in Mollecular Neuroscience. 3, 1(2010).
  5. Bronfman, F. C., Lazo, O. M., Flores, C., Escudero, C. A. Spatiotemporal intracelular dynamics of neurotrophin and its receptors. Implications for neurotrophin signaling and neuronal function. Neurotrophic Factor. Handbook of Experimental Pharmacology. Lewin, G., Carter, B. 220, Springer. Berlin, Heidelberg. (2014).
  6. Ascano, M., Bodmer, D., Kuruvilla, R. Endocytic trafficking of neurotrophins in neural development. Trends in Cell Biology. 22 (5), 266-273 (2012).
  7. Deinhardt, K., Salinas, S., Verastegui, C., Watson, R., Worth, D., Hanrahan, S., Bucci, C., Schiavo, G. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52 (2), 293(2006).
  8. Escudero, C. A., et al. c-Jun N-terminal kinase (JNK)-dependent internalization and Rab5-dependent endocytic sorting medaited long-distance retrograde neuronal death induced by axonal BDNF-p75 signaling. Scientific Reports. 9, 6070(2019).
  9. Vrabec, J. P., Levin, L. A. The neurobiology of cell death in glaucoma. Eye. 21, Suppl 1 11-14 (2007).
  10. Liot, G., Zala, D., Pla, P., Mottet, G., Piel, M., Saudou, F. Mutant huntingtin alters retrograde transport of TrkB receptors in striatal dendrites. Journal of Neuroscience. 33 (15), 6298-6309 (2013).
  11. Zhou, B., Cai, Q., Xie, Y., Sheng, Z. H. Snapin recruits dynein to BDNF-TrkB signaling endosomes for retrograde axonal transport and is essential for dendrite growth of cortical neurons. Cell Reports. 2 (1), 42-51 (2012).
  12. Haubensak, W., Narz, F., Heumann, R., Lessmann, V. BDNF-GFP containing secretory granules are localized in the vicinity of synaptic junctions of cultured cortical neurons. Journal of Cell Science. 111 (11), 1483-1493 (1998).
  13. Adachi, N., et al. Glucocorticoid affects dendritic transport of BDNF-containing vesicles. Scientific Reports. 5, 12684(2015).
  14. Biocompare: The Buyer's Guide for Life Scientists. Mirus Bio. Cellular Toxicity Caused by Transfection: Why is it important. , Available from: https://www.biocompare.com/Bench-Tips/121111-Cellular-Toxicity-Caused-by-Transfection-Why-is-it-important/ (2012).
  15. Zhao, L., et al. Mechanism underlying activity-dependent insertion of TrkB into the neuronal surface. Journal of Cell Science. 122 (17), 3123-3136 (2009).
  16. Zhao, X., Zhou, Y., Weissmiller, A., Pearn, M., Mobley, W., Wu, C. Real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled BDNF in primary neurons. Journal of Visualized Experiments. 91, 51899(2014).
  17. Sung, K., Maloney, M., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of Neuroscience Methods. 200 (2), 121-128 (2011).
  18. Deerinck, T. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
  19. Unsain, N., Nuñez, N., Anastasia, A., Mascó, D. H. Status epilepticus induces a TrkB to p75 neurotrophin receptor switch and increases brain-derived neurotrophic factor interaction with p75 neurotrophon receptor: an initial event in neuronal injury induction. Neuroscience. 154 (3), 978-993 (2008).
  20. Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).
  21. Moya-Alvarado, G., Gonzalez, A., Stuardo, N., Bronfman, F. C. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) regulates Rab5-positive early endosomes in hippocampal neurons to induce dendritic branching. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 493(2018).
  22. Sasi, M., Vignoli, B., Canossa, M., Blum, R. Neurobiology of local and intercellular BDNF signaling. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 469 (5), 593-610 (2017).
  23. Gonzalez, A., Lazo, O. M., Bronfman, F. C. The Rab5-Rab11 endosomal pathway is required for BDNF-induced CREB transcriptional regulation in neurons. , Available from: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/844720v1 (2019).
  24. Mowla,, et al. Biosynthesis and post-translational processing of the precursor to brain-derived neurotrophic factor. Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12660-12666 (2001).
  25. Longo, P., Kavran, J., Kim, M. S., Leahy, D. Transient Mammalian Cell Transfection with Polyethyleneimine (PEI). Methods in Enzymology. 529, 227-240 (2013).
  26. Raymond, C., Tom, R., Perret, S., Moussouami, P., L'Abbé, D., St-Laurent, G., Durocher, Y. A simplified polyethyleneimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods. 55 (1), 44-51 (2011).
  27. Dalton, A., Barton, W. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).
  28. Hunter, M., Yuan, P., Vavilala, D., Fox, M. Optimization of protein expression in mammalian cells. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 77(2019).
  29. Stepanenko, A. A., Heng, H. H. Transient and stable vector transfection: Pitfalls, off-target effects, artifacts. Mutation Research. 773, 91-103 (2017).
  30. Guerzoni, L. P., Nicolas, V., Angelova, A. In vitro modulation of TrkB receptor signaling upon sequential delivery of curcumin-DHA loaded carriers towards promoting neuronal survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
  31. Angelova, A., Angelov, B. Dual and multi-drug delivery nanoparticles towards neuronal survival and synaptic repair. Neural Regeneration Research. 12 (6), 886-889 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

161 BDNF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved