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要約

Avi配列を含む組換えBDNF(BDNFAvi)は、コスト効率の高い方法でHEK293細胞で産生され、アフィニティークロマトグラフィーによって精製される。BDNFaviは、その後、チューブ内の酵素BirAで直接モノビオチン化されます。BDNFaviおよびモノビオチン化BDNFaviは、市販のBDNFと比較して生物学的活性を保持します。

要約

アビ配列を含む組換えBDNF(BDNFAvi)はHEK293細胞で産生され、次いでアフィニティークロマトグラフィーによりコスト効率よく精製される。再現性のあるプロトコルは、酵素BirAをチューブに含むBDNFAviを直接モノビチン化するために開発されました。この反応において、モノビオチン化BDNFAviは、その生物学的活性を保持する。

ニューロトロフィンは、神経細胞の発達と維持に役割を果たすターゲット由来の成長因子です。それらは異なった神経区画間の長距離シグナリングを可能にするために、エンドサイトーの経路に沿って急速な輸送メカニズムを要求する。ニューロトロフィンの密売を研究するための分子ツールの開発により、生体内記録を用いた細胞内のこれらのタンパク質の正確な追跡が可能になりました。このプロトコルでは、モノビチン化BDNFの生産に対する最適化された費用対効果の高い手順を開発しました。ビオチン化可能なアビ配列(BDNFAvi)を含む組換えBDNF変異体を、HEK293細胞内でマイクログラム範囲で産生し、次いでアフィニティークロマトグラフィーを用いて容易にスケーラブルな手順で精製する。精製されたBDNFは、チューブ中の酵素BirAとの直接インビトロ反応によって均質にモノビオチン化することができる。モノビチン化BDNF(mbtBDNF)の生物活性は、異なるフルオロフォアにストレプトアビジン共役に結合することができる。BDNFAviおよびmbtBDNFは、ウェスタンブロットを用いた下流リン酸化標的の検出および転写因子CREBの活性化を通じて実証された生物活性を保持する。ストレプトアビジン量子ドットを用いて、リン酸化特異的抗体で検出されたCREBの活性化と共にmbtBDNFのインターナリゼーションを可視化することができました。さらに、ストレプトアビジン量子ドットに結合したmbtBDNFは、マイクロ流体室で成長した皮質ニューロンにおける逆行輸送解析に適していた。このように、チューブで生成されたmbtBDNFは、生理的シグナル伝達の内在ダイナミクスおよびニューロンの人身売買を研究するための信頼できるツールである。

概要

ニューロンは、シナプスコミュニケーションを可能にする複雑で特殊な形態を有する神経系の機能的単位であり、したがって、多様な刺激に応答して協調的で複雑な行動の生成である。樹状突起や軸索などの神経突起は、神経伝達に関与する重要な構造的特徴であり、ニューロトロフィンは形態と機能1を決定する上で重要な役割を果たします。ニューロトロフィンは、NGF、NT-3、NT-4、および脳由来神経栄養因子(BDNF)2を含む分泌成長因子のファミリーである。2中枢神経系(CNS)において、BDNFは神経伝達、樹状樹状の樹状化、樹状脊椎の成熟、長期増強、3,44を含む多様な生物学的プロセスに関与する。したがって、BDNFは神経機能の調節において重要な役割を果たす。

多様な細胞プロセスは、BDNFのダイナミクスと機能を調節します。神経細胞表面では、BDNFはトロポミオシン受容体キナーゼB(TrkB)および/またはp75ニューロトロフィン受容体(p75)に結合する。BDNF-TrkBおよびBDNF-p75複合体は、エンドサイトース化され、異なるエンドサイトオルガネラ55、6、7、86,7,8に分類される。BDNF/TrkB複合体の正しい細胞内の人身売買は、異なる神経回路9、10、1110における適切9なBDNFシグナル伝達のために必要と11される。このため、BDNFの人身売買ダイナミクスと病態生理学的プロセスにおけるその変化を深く理解することは、健康と疾患におけるBDNFシグナル伝達を理解するために不可欠である。このプロセスを監視する新しい特定の分子ツールの開発は、この分野を前進させ、関係する規制メカニズムをよりよく把握するのに役立ちます。

ニューロンの BDNF 人身売買の研究に利用できるいくつかのツールがあります。.一般的に使用される方法論は、GFP mCherry12,13の緑色蛍光タンパク質(GFP)または単量体蛍光赤シフト変異型などの蛍光分子でタグ付けされた組換えBDNFのトランスフェクションを13含む。しかし、BDNF過剰発現の主な欠点は、このニューロトロフィンの既知の濃度を提供する可能性を排除することです。また、細胞毒性をもたらし、結果14の解釈を隠す。別の戦略は、Flag-TrkBのようなエピトープタグ付きTrkBのトランスフェクションです。この方法論はTrkBの内在性ダイナミクス15の研究を可能にするが、それはまた、TrkB機能および細胞毒性の変化をもたらす可能性があるトランスフェクションを伴う。これらの方法論的ハードルを克服するために、ビオチンリガーゼ酵素BirAによって単一ビオチン化することができるアビ配列(BDNFAvi)を含むNGFおよびBDNFの組換え変異体が16,17,17に開発された。ビオチン化組換えBDNFは、フルオロフォア、ビーズ、常磁性ナノ粒子などを検出するための異なるストレプトアビジン結合ツールに結合することができる。ライブセルイメージングの面では、量子ドット(QD)は、小分子フルオロフォア18と比較した場合の光漂白に対する輝度および耐性の増加などの単粒子追跡に望ましい特性を有するため、頻繁に使用されるようになっている。

BDNFAviを用いたモノビオチン化BDNF(mbtBDNF)の生産は、BDNFAviとBirAの発現を駆動するプラスミドの共トランスフェクションによって達成され、続いて、10mLあたりBDNFの収率1〜2μgのBDNFの収率を有するアフィニティークロマトグラフィーによる組換えタンパク質の精製が行われた。ここでは、500 mLのHEK293コンディションメディアからのBDNFAvi精製を可能にするこのプロトコルの改変を提案し、操作を容易にするためのクロマトグラフィーカラムベースのプロトコルでタンパク質回収を最大化することを目指す。使用されたトランスフェクション剤、ポリエチレンイミン(PEI)は、トランスフェクション収率を犠牲にすることなく費用対効果の高い方法を保証する。モノビオチン化ステップは、共トランスフェクションに関連する合併症を回避し、BDNFの均質な標識を確実にするために、インビトロ反応に適応されています。mbtBDNFの生物活性は、微小流体室におけるBDNFの逆行軸索輸送を研究するためのpCREBおよび生細胞イメージングの活性化を含む、ウェスタンブロットおよび蛍光顕微鏡実験によって実証された。このプロトコルを使用すると、均質なモノビオチン化および生物学的に活性なBDNFの最適化された高収率生産が可能になります。

プロトコル

すべての実験は、CONICYT(チリ国家科学技術研究委員会)の承認されたガイドラインに従って行われました。本研究で使用されたプロトコルは、ポンティフィシア大学カトリカ・デ・チリのバイオセキュリティおよび生物倫理的および動物福祉委員会によって承認された。脊椎動物を含む実験は、ポンティフィシア大学カトリカ・デ・チリの生物倫理・動物福祉委員会によって承認されました。

注:次のプロトコルは、HEK293細胞で産生されるコンディション培地の合計体積500 mLからBDNFAviを浄化するように設計されました。BDNFAviを精製するために製造および処理されるコンディショルドされた培地の量は、必要に応じて増減することができます。ただし、このような状況では、さらなる最適化が必要になる場合があります。プロトコル全体で使用される培養培地およびバッファーの組成は、補足資料に記載されています。

1. HEK293コンディショナティングメディアからのBDNFAviの製造と精製

  1. HEK293細胞のトランスフェクション
    1. ヘク293細胞を、37 ºCで15cm培養皿で、補充されたDMEM培地(10%ウシ胎児血清、1xグルタミン酸サプリメント、1x抗生物質/抗ミコティック)で70%の合流点に成長させます。
    2. 媒体をトランスフェクションバッファーに変更します。
    3. PEI-DNA混合物をトランスフェクション用に準備します。DNAとPEI 25 Kを希釈するために、2つの異なる15 mL円錐管を使用します。プラスミドDNAを20μgの最終体積500μLで1本のチューブに希釈します。他のチューブの最終容積500μLで60μgのリニアPEI 25Kを希釈します。室温で5分間インキュベートします。
    4. DNA溶液をPEIチューブに慎重にピペットし、アップダウン動作で1回混合します。室温で25分間インキュベートします。
    5. 各15cmの皿全体にPEI-DNA混合物の1 mLを滴下する。37 ºCで3時間のPEI-DNA混合物で細胞をインキュベートします。
    6. 培地をフレッシュインキュベーションバッファに変更します。
  2. メディアの収集と保存
    1. HEK293細胞のトランスフェクション後、すべての皿48時間から培地を収集します。補足ファイル1の「上清修飾バッファー」セクションに記載されている溶液の濃縮在庫を準備し、一覧表示された最終濃度を達成するためにHEK293上清にそれらを追加します。
      メモ:セルは、さらなる分析のために廃棄または回収することができます。
    2. 培地を氷の中で15分間インキュベートします。
    3. 遠心分離管に媒体をアリコート。
    4. 4°C遠心分離機で45分間10,000xgで培地を遠心分離します。 gこのステップは、培地に懸濁した細胞デブリおよび死細胞の除去を可能にする。
    5. 上清を収集し、0.1%の最終濃度でBSAを追加します。そして-20°Cで保管する。メディアは、浄化ステップ中に迅速な解凍のために凍結する前にアリクォートすることができます。
      注:最大2ヶ月の凍結されたコンディションされたメディアの保管時間は肯定的な結果をもたらし、より長い貯蔵時間は評価されていない。
  3. メディアの濃縮と精製
    1. 37°Cの熱調節浴槽でメディアを解凍します。
    2. 遠心分離管にメディアをアリコート。
    3. 4°C冷却遠心分離機で3,500xggで1時間の培地を遠心分離する。このステップは、クロマトグラフィーカラムを通る適切な流れを確保するために残りの細胞デブリの除去を可能にする。
    4. 10 kDa カットオフのタンパク質濃縮器を使用して、媒体を 500 mL から 100 mL に減らします。最適な濃度を得るための、メーカーの推奨遠心調整パラメータに従ってください。
    5. 500 μL の Ni-NTA アガロースビーズを濃縮培地に加え、ロッカーで一晩 4 °C でインキュベートします。
    6. クロマトグラフィー装置を組み立て、媒体を注ぎます。5分間休ませてから、2ウェイストップコックを開けて、中程度の流れを通します。
    7. 5 mLの洗浄バッファーでビーズを5分間洗います。2方向の栓を開けて洗浄バッファーを排出します。3回繰り返します。
    8. 1 mL の溶出バッファーをカラムに追加します。列のビーズを再中断してください。15分間インキュベートし、1.5 mLマイクロ遠心チューブに溶出物を回収します。BDNFAvi の完全な溶出のためにこのステップを 3 回繰り返します。
    9. 各溶出物の5 μLおよび市販のBDNF(40-160 ng)の異なる濃度を15%ポリアクリルアミドゲルにロードする。抗BDNF抗体を用いてウェスタンブロッティングにより精製タンパク質を検出する。
    10. 市販のBDNFで調製した濃度曲線を用いて各溶出物中の精製BDNFAviの濃度を決定する。
    11. アリコートを、精製されたBDNFAviを-80°Cで保管します。

2. ビラ酵素を用いたBDNFAviのインビトロモノビオチン化

  1. インビトロモノビオチン化反応
    1. バイオチン化緩衝試薬の濃縮ストック溶液を調製する。濃縮ストックの使用は、組換えタンパク質の希釈を最小限に抑えます。
    2. 800 ngのBDNFAviを取り、ビオチン化緩衝試薬と酵素BirAをBDNFとの1:1モル関係で添加します。例えば、200 μL の最終反応量の追加。BDNFAvi 800 ngを含む溶液の100 μL、20 μL ビシン 0.5 M pH 8.3、20 μL ATP 100 mM、20 μL MgOAc 100 mM、20 μL d-ビオチン 500 μM、0.8-1 μg ~1 μL の超純水を含む
      注:成功したビオチン化反応は、約30 ng / μL BDNFAviの濃度を含む400 μLのアリコートで行われ、最終的な反応において、均質にビオチン化されたBDNFAviを最終濃度〜20 ng/μLに導いた。
    3. 30 °Cの混合物をハイブリダイゼーションオーブンで1時間インキュベートし、15分ごとにチューブ反転によって内容を混ぜます。
    4. ステップ 2.1.2 と同じボリュームの ATP および BirA を追加し、ステップ 2.1.3 を繰り返します。
    5. 将来の分析のために-80 °Cで保管するか、すぐに使用するために氷の上に保管してください(例えば、バイオタイニル化品質管理)。
  2. ビオチン化分析
    1. ブロックバッファーの1 mLでBDNFサンプルあたりのストレプトアビジン磁気ビーズのブロック30 μL。マイクロ遠心チューブ回転器で室温で1時間インキュベートします。
    2. 磁気分離ラックを使用して磁気ビーズを沈殿させ、3~5分間、またはバッファーがビーズから完全にクリアされ、ブロッキング バッファを廃棄します。
    3. 50 μLの新鮮なブロッキングバッファーと80 ngのモノビチン化 BDNFAvi(mbtBDNF)サンプルをビーズに加え、ピペット処理で完全に再中断します。
    4. マイクロ遠心チューブ回転回転器で約20RPMで回転する4°Cで1時間インキュベートします。
    5. 磁気分離ラックを使用してビーズを3~5分間回収し、上清を収集して、分析のために30 μLアリコを保持します。
    6. 500 μL の PBS でビーズを 1 回洗い、磁気分離ラックを使用して 3 ~ 5 分間回収します。上清を回収し、分析のために30 μLアリコを保持します。
    7. ビーズに4xローディングバッファの10 μLを追加します。
    8. サンプルを97°Cに加熱して7分間加熱し、mbtBDNFを溶出させます。
    9. 抗BDNF特異的抗体19を用いてmbtBDNFを検出する。

3. mbtBDNF生物活性の検証

  1. ウェスタンブロットによるpTrkBおよびpERKの検出
    1. 60 mm培養皿に200万個のラット皮質ニューロンを種付け。
    2. 7日間のニューロンを培養する(DIV7)。次いで、実験を開始するときに培地を非補充神経基底メディオンに変更する。
    3. 培地交換の1時間後、50 ng/mLの最終濃度にmbtBDNFを加えます。37 ºCで30分間インキュベートします。ネガティブコントロールディッシュ(BDNFで刺激されない)とポジティブコントロールディッシュ(市販BDNFの50 ng /mLで処理)を保ちます。
    4. 媒体を収集し、1x PBSですべての皿を静かに洗います。1x PBS を収集して破棄します。
    5. 皿を氷の上に置き、各皿に50〜80 μLのリシスバッファーを加えます。細胞スクレーパーを使用して細胞を取り上けます。
      注:タンパク質脱リン酸化や分解を避けるために、できるだけ迅速に分解ステップを実行する必要があります。1~2分の激しい掻き取りは、ウェスタンブロッティングにより目的のタンパク質を可視化するのに十分です。
    6. 溶液バッファーを収集し、5 sの最高速度で渦ミキサーでかき混ぜます。
    7. 14,000 x g (4 °C) で 14,000 x g (4 °C) でリシス バッファーを遠心分離します。
    8. BCAタンパク質定量プロトコル20により上清のタンパク質含有量を定量する。
    9. 条件ごとに30〜50 μgのタンパク質を含むアリコートに負荷バッファーを追加し、ウェスタンブロッティング用に12%ポリアクリルアミドゲルにロードします。特定のホスホ抗体を用いてpTrkBおよびpERKを検出し、BDNFAviの生物学的活性を検証します。
  2. pCREB免疫蛍光によるBDNF-QD生物学的活性の検証
    1. シード40,000ラット皮質ニューロンは、10mmのカバーリップで、以前にオートクレーブされ、先に説明したポリL-リジンで処理された21。
    2. ニューロンを37ºCで神経維持バッファー(補足材料を参照)で7〜8日間培養します。
    3. 実験を開始するには、培地を非補充神経基底培地に変更し、37ºCで1時間インキュベートします。
    4. mbtBDNFアリコートに加えて、量子ドットストレプトアビジンコンジュゲート(ストレプトアビジン-QD)の必要量を1:1 BDNF-QDモル比を達成することにより、量子ドット(BDNF-QD)に結合して調製します。その後、神経基底培地で20μLに希釈する。チューブをアルミニウム箔で包み、光から保護します。
      注:同じ量の量子ドットストレプトアビジンコンジュゲートで別のチューブを準備し、陰性対照として神経基底培地で20μLに希釈します。
    5. ロッカーで室温で30分間、mbtBDNF/ストレプトアビジン-QD混合物をインキュベートします。
    6. BDNF-QDを神経基底培地で所望の最終濃度(200pMおよび2nM)に希釈する。
    7. 非補充神経基底培地で1時間のインキュベーションを行った後、37°Cで30分間、BDNF-QDまたはストレプトアビジン-QD(対照)でニューロンを刺激し、200pMおよび2nMのBDNFを最終濃度にする。
    8. カバーリップを1x PBS(37°C)で3回洗浄し、ホスファターゼ阻害剤を含む4%パラホルムアルデヒド溶液でカバースリップを処理して15分間細胞を固定します。
    9. 細胞をPBSで3回洗浄し、ブロッキング/透過バッファー(BSA 5%、トリトンX-100 0.5%、1xホスファターゼ阻害剤)で1時間インキュベートする。
    10. 抗pCREB抗体をインキュベート 1:500 (3% BSA で, 0.1% トリトン X-100) 4 °C で一晩.
    11. 翌日、1x PBSで3回洗浄し、2次抗体1:500で1時間インキュベートする(3%BSA、0.1%トリトンX-100)。
    12. 1倍のPBSで3回洗います。7分間、Hoechst核染色液(5 μg/mL)を加えます。
    13. 1x PBSで3回洗浄し、マウントします。
  3. 生きたニューロンにおけるBDNF-QDの逆行軸索輸送の可視化
    1. 前述のようにマイクロ流体室および種子ニューロンを準備する16.
    2. 培養で7〜8日後、培地を非補充神経基底培地に変更する。
    3. mbtBDNFアリコートに加えて、量子ドットストレプトアビジンコンジュゲート(ストレプトアビジン-QD)の必要量を1:1 BDNF-QDモル比を達成することにより、量子ドット(BDNF-QD)に結合して調製します。その後、神経基底培地で20μLに希釈する。チューブをアルミニウム箔で包み、光から保護します。
      注:同じ量の量子ドットストレプトアビジンコンジュゲートで別のチューブを準備し、コントロールとして神経基底媒体で20 μLに希釈します。
    4. ロッカーで室温で30分間、mbtBDNF/ストレプトアビジン-QD混合物をインキュベートします。
    5. BDNF-QDを望ましい最終濃度(2 nM)まで希釈します。
    6. 非補充神経基底培地による1時間のインキュベーションの後、マイクロ流体室の軸索コンパートメントにBDNF-QDまたは対照混合物を加える。BDNF-QDの正味逆行輸送を確実にするために37°Cで210分間インキュベート。
    7. 生細胞イメージングの場合、これらの目的に適した顕微鏡(37°Cおよび5%CO2)を用いて100x目的を用いて、細胞体区画に近いマイクロ溝のセグメントにおける軸索逆行輸送を可視化する。1 フレーム/sで画像を取得します。

結果

クロマトグラフィーカラムベースのプロトコルを使用することで、HEK293コンディションメディアの大量処理が可能になります。図1に、500mLのコンディションされた培地からBDNFAviを精製した結果が示されている。Ni-NTAアガロースビーズからのBDNFAviの連続溶出は、BDNFAviの濃度を減少させる(図1A)。4回連続の溶出(それぞれ15分)後、ビーズによって捕捉?...

ディスカッション

本稿では、親和クロマトグラフィーベースの手順におけるmbtBDNFの生成および精製のための最適化された方法論が、Sungおよび共同研究者17の研究に基づいて説明される。最適化には、リポフェクタミンなどのより高価なトランスフェクション方法の効率を維持しながら、費用対効果の高いトランスフェクション試薬(PEI)の使用が含まれます。この最適化により、プロトコルの?...

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

著者らは、フォンデサイト(1171137)(FCB)、科学技術基礎優秀センター(AFB 170005)(FCB)、ミレニアム核(P07/011-F)(FCB)、ウェルカム・トラスト上級研究員賞(107116/Z/15/Z)からの財政的支援を感謝して認めている。この研究は、ウニダード・デ・ミクロスコフィア・アバンザダUC(UMA UC)によって支えられた。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
2 way stopcockBioRad7328102Chromatography apparatus component
2-mercaptoethanolSigmaM6250BDNF elution buffer
Acrylamide/BisacrylamideBioRad1610154SDS-PAGE gel preparation
Amicon Ultra-15 10KMilliporeUFC901024BDNF concentration
Ammonium PersulfateSigmaA9164SDS-PAGE gel preparation
anti B-III-Tubulin antibodySigmaT8578Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti BDNF antibodyAlomoneAGP-021Western blot assays for BDNF quantification
anti BDNF antibodyAlomoneANT-010Western blot assays for BDNF quantification
Anti ERK antibodyCell Signaling9102Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pCREB antibody (S133)Cell Signaling9198Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pERK antibody (T202, Y204)Cell Signaling4370Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pTrkB antibody (Y515)Abcamab109684Western blot assays for BDNF biological activity detection
Antibiotic/AntimycoticGibco15240-062HEK293 maintenance
ATPSigmaA26209BDNF monobiotinylation buffer
B-27 SupplementGibco17504-044Neuron maintenance
BicineSigmaB3876BDNF monobiotinylation buffer
BirA-GSTBPS Bioscience70031Enzyme for BDNF AviTag monobiotinylation
Bovine Fetal SerumHyCloneHC.SH30396.02HEK293 maintenance
Bovine Serum AlbuminJackson ImmunoResearch001-000-162BDNF buffer modification component, blocking buffer for western blot and immunofluorescence
D-BiotinSigmaB4639BDNF monobiotinylation buffer
DMEM High Glucose MediumGibco11965-092Neuron seeding
DMEM MediumGibco11995-081HEK293 maintenance
Econo Column FunnelBioRad7310003Chromatography apparatus component
EDTAMerck108418
EZ-ECL KitBiological Industries1633664Protein detection by western blotting
GlutamaxGibco35050-061Neuron and HEK293 maintenance
GlycerolMerck104094BDNF elution buffer, lysis buffer for western blot assays
Hettich Rotina 46R CentrifugeHettichDiscontinuedCentrifuge used for clearing the medium of debris
Hettich Universal 32R CentrifugeHettichDiscontinuedCentrifuge used for protein concentrator centrifugation
Horse SerumGibco16050-122Neuron seeding
ImageQuant LAS 500GE Healthcare Life Sciences29005063Western blot image acquisition
ImidazoleSigmaI55513BDNF buffer modification component
KClWinklerBM-1370PBS component
KH2PO4Merck104873PBS component
LamininInvitrogen23017-015Cover coating for compartmentalized neurons
Luer Tubing AdaptorBioRad7323245Chromatography apparatus component
Luminata™ Forte Western HRP SubstrateMilliporeWBLUF0100Protein detection by western blotting
Mg(CH3COO)2Merck105819BDNF monobiotinylation buffer
Mowiol 4-88Calbiochem475904Mounting reagent for immunofluorescence assays
MyOne C1 Streptavidin Magnetic BeadsInvitrogen65001Biotinylation verification
Na2HPO4Merck106586BDNF buffer modification component
NaClWinklerBM-1630PBS component, BDNF buffer modification component
NaH2PO4Merck106346BDNF buffer modification component
Neurobasal MediumGibco21103-049Neuron maintenance
Ni-NTA Agarose BeadsQiagen30210BDNF AviTag purification
Nikon Ti2-ENikonMicroscope for fluorescence imaging
Nitrocellulose MembraneBioRad1620115Protein transfer for western blotting
ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS cameraHamamatsuC13440-20CUCamera for epifluorescence imaging
P8340 Protease Inhibitor CocktailSigmaP8340BDNF buffer modification component
ParaformaldehydeMerck104005Fixative for immunofluorescence assays
Penicillin/StreptomycinGibco15140-122Neuron maintenance
Poli-D-LysineCorningDLW354210Cover coating for compartmentalized neurons
Poli-L-LysineMilliporeP2363Cover coating for non-compartmentalized neurons
Poly-Prep Chromatography ColumnBioRad7311550Chromatography apparatus component
Polyethyleneimine 25KPolysciences Inc.PLY-0296HEK293 transfection
Quantum Dots 655 streptavidin conjugateInvitrogenQ10121MPMonobiotinylated BDNF AviTag label for live and fixed cell experiments
SaponinSigmaS4521Detergent for immunofluorescence assays
Syldgard 184 silicone elastomer basePoirot4019862Microfluidic chamber preparation
TEMEDSigmaT9281SDS-PAGE gel preparation
TrisWinklerBM-2000Lysis buffer component
Triton X100Merck108603Cell permeabilization in immunofluorescence and western blot assays
Trypsin-EDTA 0.5%Gibco15400-054HEK293 passaging

参考文献

  1. Huang, E., Reichardt, L. Neurotrophins: Roles in Neuronal Development and Function. Annual Review of Neuroscience. 24, 677-736 (2001).
  2. Skaper, S. D. The neurotrophin family of neurotrophic factors: an overview. Methods in Mollecular Biology. 846, 1-12 (2012).
  3. Gonzalez, A., Moya-Alvarado, G., Gonzalez-Billault, C., Bronfman, F. C. Cellular and molecular mechanism regulating neuronal growth by brain-derived neurotrophic factor. Cytoskeleton. 73 (10), 612-628 (2016).
  4. Cunha, C., Brambilla, R., Thomas, K. A simple role for BDNF in learning and memory. Frontiers in Mollecular Neuroscience. 3, 1 (2010).
  5. Bronfman, F. C., Lazo, O. M., Flores, C., Escudero, C. A., Lewin, G., Carter, B. Spatiotemporal intracelular dynamics of neurotrophin and its receptors. Implications for neurotrophin signaling and neuronal function. Neurotrophic Factor. Handbook of Experimental Pharmacology. 220, (2014).
  6. Ascano, M., Bodmer, D., Kuruvilla, R. Endocytic trafficking of neurotrophins in neural development. Trends in Cell Biology. 22 (5), 266-273 (2012).
  7. Deinhardt, K., Salinas, S., Verastegui, C., Watson, R., Worth, D., Hanrahan, S., Bucci, C., Schiavo, G. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52 (2), 293 (2006).
  8. Escudero, C. A., et al. c-Jun N-terminal kinase (JNK)-dependent internalization and Rab5-dependent endocytic sorting medaited long-distance retrograde neuronal death induced by axonal BDNF-p75 signaling. Scientific Reports. 9, 6070 (2019).
  9. Vrabec, J. P., Levin, L. A. The neurobiology of cell death in glaucoma. Eye. 21, 11-14 (2007).
  10. Liot, G., Zala, D., Pla, P., Mottet, G., Piel, M., Saudou, F. Mutant huntingtin alters retrograde transport of TrkB receptors in striatal dendrites. Journal of Neuroscience. 33 (15), 6298-6309 (2013).
  11. Zhou, B., Cai, Q., Xie, Y., Sheng, Z. H. Snapin recruits dynein to BDNF-TrkB signaling endosomes for retrograde axonal transport and is essential for dendrite growth of cortical neurons. Cell Reports. 2 (1), 42-51 (2012).
  12. Haubensak, W., Narz, F., Heumann, R., Lessmann, V. BDNF-GFP containing secretory granules are localized in the vicinity of synaptic junctions of cultured cortical neurons. Journal of Cell Science. 111 (11), 1483-1493 (1998).
  13. Adachi, N., et al. Glucocorticoid affects dendritic transport of BDNF-containing vesicles. Scientific Reports. 5, 12684 (2015).
  14. Biocompare: The Buyer's Guide for Life Scientists. Mirus Bio. Cellular Toxicity Caused by Transfection: Why is it important Available from: https://www.biocompare.com/Bench-Tips/121111-Cellular-Toxicity-Caused-by-Transfection-Why-is-it-important/ (2012)
  15. Zhao, L., et al. Mechanism underlying activity-dependent insertion of TrkB into the neuronal surface. Journal of Cell Science. 122 (17), 3123-3136 (2009).
  16. Zhao, X., Zhou, Y., Weissmiller, A., Pearn, M., Mobley, W., Wu, C. Real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled BDNF in primary neurons. Journal of Visualized Experiments. 91, 51899 (2014).
  17. Sung, K., Maloney, M., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of Neuroscience Methods. 200 (2), 121-128 (2011).
  18. Deerinck, T. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
  19. Unsain, N., Nuñez, N., Anastasia, A., Mascó, D. H. Status epilepticus induces a TrkB to p75 neurotrophin receptor switch and increases brain-derived neurotrophic factor interaction with p75 neurotrophon receptor: an initial event in neuronal injury induction. Neuroscience. 154 (3), 978-993 (2008).
  20. Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).
  21. Moya-Alvarado, G., Gonzalez, A., Stuardo, N., Bronfman, F. C. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) regulates Rab5-positive early endosomes in hippocampal neurons to induce dendritic branching. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 493 (2018).
  22. Sasi, M., Vignoli, B., Canossa, M., Blum, R. Neurobiology of local and intercellular BDNF signaling. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 469 (5), 593-610 (2017).
  23. . The Rab5-Rab11 endosomal pathway is required for BDNF-induced CREB transcriptional regulation in neurons Available from: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/844720v1 (2019)
  24. Mowla, , et al. Biosynthesis and post-translational processing of the precursor to brain-derived neurotrophic factor. Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12660-12666 (2001).
  25. Longo, P., Kavran, J., Kim, M. S., Leahy, D. Transient Mammalian Cell Transfection with Polyethyleneimine (PEI). Methods in Enzymology. 529, 227-240 (2013).
  26. Raymond, C., Tom, R., Perret, S., Moussouami, P., L'Abbé, D., St-Laurent, G., Durocher, Y. A simplified polyethyleneimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods. 55 (1), 44-51 (2011).
  27. Dalton, A., Barton, W. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).
  28. Hunter, M., Yuan, P., Vavilala, D., Fox, M. Optimization of protein expression in mammalian cells. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 77 (2019).
  29. Stepanenko, A. A., Heng, H. H. Transient and stable vector transfection: Pitfalls, off-target effects, artifacts. Mutation Research. 773, 91-103 (2017).
  30. Guerzoni, L. P., Nicolas, V., Angelova, A. In vitro modulation of TrkB receptor signaling upon sequential delivery of curcumin-DHA loaded carriers towards promoting neuronal survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
  31. Angelova, A., Angelov, B. Dual and multi-drug delivery nanoparticles towards neuronal survival and synaptic repair. Neural Regeneration Research. 12 (6), 886-889 (2017).

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