用于神经元细胞贩运研究的管子中纯化和直接单生物素重组BDNF的改进协议

摘要

含有 Avi 序列 （BDNFAvi） 的重组 BDNF 以经济高效的方式在 HEK293 细胞中生产，并通过亲和色谱进行纯化。然后，BDNFavi 与管中的酶 BirA 直接单生物素化。与市售的BDNF相比，BDNFavi和单生物素化BDNFavi保留了其生物活性。

摘要

含有 Avi 序列 （BDNFAvi） 的重组 BDNF 在 HEK293 细胞中生产，然后通过亲和力色谱进行经济高效地纯化。一种可重复的协议被开发成直接单生物素BDNFAvi与酶BirA在管中。在这个反应中，单生物素化BDNFAvi保持其生物活性。

神经营养素是靶源生长因子，在神经元发育和维持中起着一定的作用。它们需要沿着内分泌通路的快速传输机制，以便在不同的神经元隔间之间进行远距离信号。开发分子工具，研究神经营养素的贩运，使这些蛋白质在细胞使用体内记录精确跟踪。在该协议中，我们为单生物基化BDNF的生产开发了一个优化且经济高效的程序。含有生物素可 avi 序列 （BDNFAvi） 的重组 BDNF 变种在微克范围内的 HEK293 细胞中产生，然后使用亲和力色谱在易于分量的程序中纯化。然后，纯化的BDNF可以通过与管中的BirA酶直接体外反应来均匀地进行单生物素化。单生物基化BDNF（mbtBDNF）的生物活性可以与与不同荧光团结合的链球菌结合。BDNFAvi和mbtBDNF分别通过利用西方印迹检测下游磷酸化靶点和活化转录因子CREB来保持其生物活性。使用链球菌素量子点，我们能够可视化 mbtBDNF 内化伴随激活 CREB，该激活与磷-CREB特异性抗体一起检测。此外，与链球菌素量子点结合的mbtBDNF适用于微流体室中生长的皮质神经元的逆行性传输分析。因此，在管生产mbtBDNF是一个可靠的工具，研究生理信号内位动力学和神经元的贩运。

引言

神经元是神经系统的功能单位，具有复杂和专门的形态，允许突触通信，因此，产生协调和复杂的行为，以回应不同的刺激。神经元投影，如树突和轴突是参与神经元交流的关键结构特征，神经营养素是决定其形态和功能^{1的关键参与者}。神经营养素是一个分泌生长因子的家族，包括NGF、NT-3、NT-4和脑源神经营养因子^{（BDNF）2。}在中枢神经系统（CNS），BDNF参与不同的生物过程，包括神经传学，树突状，树突脊柱的成熟，长期强权，^{等等3，4。3,}因此，BDNF在调节神经元功能方面起着至关重要的作用。

不同的细胞过程调节BDNF动力学和功能。在神经元表面，BDNF结合肌蛋白酶受体激酶B（TrkB）和/或p75神经营养素受体（p75）。BDNF-TrkB和BDNF-p75复合物被内分泌和排序在不同的内分泌细胞器^{5，6，7，8。,6,7,8}BDNF/TrkB复合物的细胞内贩运需要在不同的神经元^,电路^9、10、11,中发出正确的^BDNF信号。¹⁰因此，深入了解BDNF贩运动态及其在病理生理过程中的变化对于了解BDNF在健康和疾病中的信号至关重要。开发新的和特定的分子工具来监测这一过程将有助于推动这一领域向前发展，并更好地掌握所涉及的监管机制。

有几个工具可用于研究BDNF贩运神经元。常用的方法涉及转染重组BDNF与荧光分子标记，如绿色荧光蛋白（GFP）或单体荧光红移变种的GFP mCherry^{12，13。,13}然而，BDNF过度表达的一个主要缺点是，它消除了提供这种神经营养素的已知浓度的可能性。此外，它可能会导致细胞毒性，掩盖了结果^14的解释。另一种策略是表位标记的TrkB的转染，如旗-TrkB。这种方法允许研究TrkB内化动力学^15，但它也涉及转染，这可能会导致TrkB功能和细胞毒性的改变。为了克服这些方法障碍^{，16，17，}开发了含有Avi序列（BDNFAvi）的NGF和BDNF的重组变种，这种变异可以由生物素-利加酶BirA^单生物素^化。生物基化重组BDNF可与不同的链球菌结合工具耦合，这些工具包括荧光团、珠子、顺磁纳米粒子等，用于检测。在活细胞成像方面，量子点（QD）已成为常用的荧光团，因为它们具有单粒子跟踪的可取特性，如与小分子荧光团¹⁸相比，亮度增加，光漂白的抵抗力增强。

使用BDNFAvi的单生物基化BDNF（mbtBDNF）的产生是通过对驱动BDNFAvi和BirA表达的质粒进行共生共进，然后通过亲和力色谱纯化重组蛋白，每20mL的 HEK293条件培养基¹⁷产生1-2μg的BDNF。在这里，我们建议修改该协议，允许BDNFAvi纯化从500 mL的 HEK293 条件介质，寻求最大限度地提高蛋白质回收在色谱柱为基础的协议，以方便操作。用过的转染剂聚乙烯胺 （PEI） 可确保在不牺牲转染产量的情况下采用经济高效的方法。单生物素化步骤已适应体外反应，以避免与共创相关的并发症，并确保BDNF的均匀标记。mbtBDNF的生物活性通过西方的印迹和荧光显微镜实验得到证明，包括pCREB的活化和活细胞成像，以研究BDNF在微流体室中的逆行性。使用该协议允许优化，高产生产同质单生物基化和生物活性BDNF。

研究方案

所有实验都是按照智利国家科学和技术研究委员会（智利国家科学技术研究委员会）核准的准则进行的。本研究中使用的议定书得到智利大学生物安全和生物伦理及动物福利委员会的批准。涉及脊椎动物的实验得到智利大学生物伦理和动物福利委员会的批准。

注:以下协议旨在从 HEK293 细胞中产生的 500 mL 条件介质的总体积中纯化 BDNFAvi。为净化BDNFAvi而生产并加工的有条件介质量可以根据需要向上或缩小。但是，在这种情况下可能需要进一步优化。在整个协议中使用的培养媒体和缓冲区的组成可以在补充材料中找到。

1. 从 HEK293 空调介质生产和纯化 BDNFAvi

1. HEK293细胞的转染
   1. 在37 oC的15厘米培养皿中，在15厘米培养皿中生长 HEK293 细胞至 70% 汇合（10% 牛胎儿血清、1x 谷氨酸补充剂、1x 抗生素/抗肌理）。
   2. 将介质更改为转染缓冲液。
   3. 准备PEI-DNA混合物进行转染。分别使用两种不同的 15 mL 锥形管稀释 DNA 和 PEI 25 K。在一个管中稀释20μg质粒DNA，最终体积为500μL。在其它管中，以500μL的最终体积稀释60μg的线性PEI 25K。在室温下孵育5分钟。
   4. 小心地将脱氧核糖核酸溶液移液到PEI管中，通过上下运动混合一次。在室温下孵育25分钟。
   5. 在每个 15 厘米的培养皿中滴落 1 mL 的 PEI-DNA 混合物。在37oC下用PEI-DNA混合物孵育细胞3小时。
   6. 将介质更改为新的孵育缓冲液。
2. 媒体收集和存储
   1. HEK293细胞转染后48小时从所有菜肴中收集介质。准备补充文件1"超常修改缓冲区"部分中描述的溶液的集中库存，并将其添加到 HEK293 上流液中，以实现列出的最终浓度。
      注:可以丢弃或恢复细胞以作进一步分析。
   2. 在冰中孵育介质15分钟。
   3. 将介质等到离心管中。
   4. 在 4 °C 离心机中以 10，000 x g离心介质 45 分钟。此步骤允许消除悬浮在介质中的细胞碎片和死细胞。
   5. 收集超自然，加入BSA的最终浓度为0.1%。然后在-20°C储存。介质可以在冻结前等分，以便于纯化步骤中更快地解冻。
      注:冷冻条件介质的存储时间长达2个月，取得了积极效果，较长的存储时间尚未评估。
3. 介质浓度和纯化
   1. 在 37 °C 热调节浴中解冻介质。
   2. 将介质分成离心管。
   3. 在 4°C 冷却离心机中，以 3，500 x g将介质离心 1 小时。此步骤允许消除剩余的细胞碎片，以确保通过色谱柱的足够流量。
   4. 使用具有 10 kDa 截止的蛋白质浓缩器将介质从 500 mL 降低至 100 mL。按照制造商推荐的离心参数进行最佳浓度。
   5. 将500μL的Ni-NTA红糖珠加入浓缩介质，在4°C的摇杆中孵育过夜。
   6. 组装色谱仪并倒入介质中。让它休息 5 分钟，然后打开双向停止，让介质流过。
   7. 用 5 mL 的洗涤缓冲液清洗珠子 5 分钟。确保重新在柱中重新填充珠子。通过打开双向止损口排空洗涤缓冲液。重复3次。
   8. 向列添加 1 mL 的洗脱缓冲区。确保重新暂停列中的珠子。孵育15分钟，然后在1.5 mL微离心管中收集水卢酸盐。重复此步骤 3 次，以完成 BDNFAvi 的洗脱。
   9. 在 15% 聚丙烯酰胺凝胶中，每种 Eluate 和不同浓度的商用 BDNF （40-160 ng） 中加载 5 μL。使用抗BDNF抗体检测西方印迹的纯化蛋白质。
   10. 使用市售BDNF准备的浓度曲线，确定纯化BDNFAvi在每个紫菜中的浓度。
   11. 在-80°C下将纯化的BDNFAvi储存。

2. 使用BirA酶对BDNFAvi进行体外单生物基化

1. 体外单生物素化反应
   1. 准备生物素化缓冲剂试剂的浓缩库存溶液。使用浓缩库存将最大限度地减少重组蛋白的稀释。
   2. 以800ng的BDNFAvi等分，加入生物素化缓冲试剂和酶BirA，与BDNF的1:1摩尔关系。例如，对于 200 μL 的最终反应量添加;100 μL 溶液含有 800 ng 的 BDNFAvi，20 μL Bicine 0.5 M pH 8.3， 20 μL ATP 100 mM，20 μL MgOAc 100 mM，20 μL d-生物素500μM，0.8-1μg至1 μL的BirA-GST，并完成至200μL的超纯水。
      注:成功进行生物素化反应，在400μL的等分中，其浓度约为30纳克/μL BDNFAvi，最终反应中，生物素化BDNFAvi最终浓度为±20纳克/μL。
   3. 在杂交烤箱中，在30°C下孵育混合物1小时，每15分钟通过管反转混合一次。
   4. 添加与步骤 2.1.2 相同的 ATP 和 BirA 卷，并重复步骤 2.1.3。
   5. 储存在-80°C，用于未来分析或立即放在冰上使用（例如，生物仿生质量控制）。
2. 生物基化分析
   1. 每个BDNF样品在1 mL的阻滞缓冲液中阻断30μL的链球菌磁性珠。在室温下在微离心管旋转器中孵育1小时。
   2. 使用磁分离机架沉淀磁珠 3 至 5 分钟，或直到缓冲器完全清除磁珠并丢弃阻塞缓冲器。
   3. 向珠子中加入 50 μL 的新鲜阻尼缓冲液和 80 ng 的单生物基化 BDNFAvi （mbtBDNF） 样品，确保通过管道完全重新暂停。
   4. 在4°C下孵育1小时，在约20 RPM的微离心管旋转器中孵育。
   5. 使用磁性分离架收集磁珠 3 至 5 分钟，并收集上光，保持 30 μL 等分进行分析。
   6. 用 500 μL PBS 清洗珠子一次，然后使用磁性分离架收集珠子 3 到 5 分钟。恢复上一液，并保留 30 μL 等分进行分析。
   7. 向珠子添加 10 μL 的 4 倍加载缓冲液。
   8. 将样品加热至97°C7分钟，以加热mbtBDNF。
   9. 使用抗BDNF特异性抗体¹⁹检测mbtBDNF。

3. 核查 mbtBDNF 生物活性

1. 通过西部印迹检测 pTrkB 和 pERK。
   1. 种子200万大鼠皮质神经元在60毫米培养皿。
   2. 培养神经元7天（DIV7）。然后，在开始实验时将介质更改为非补充神经基础。
   3. 介质变化一小时后，将 mbtBDNF 添加到 50 ng/mL 的最终浓度中。在37°C下孵育30分钟。保持负对盘（非刺激与BDNF）和正对盘（处理与50纳克/mL的商用BDNF）。
   4. 收集介质，用 1x PBS 轻轻清洗每道菜。收集并丢弃 1x PBS。
   5. 将盘子放在冰上，并在每道菜中加入50-80μL的解液缓冲液。使用细胞刮刀对细胞进行回线。
      注:应尽快执行解解步骤，以避免蛋白质脱磷和降解。1-2分钟的剧烈刮擦足以想象西方印迹所感兴趣的蛋白质。
   6. 收集解液缓冲液，以最高速度在涡流混合器中搅拌5 s。
   7. 将解液缓冲液在 14，000 x g （4 °C） 下离心 10 分钟，收集上流液。
   8. 通过BCA蛋白质定量协议20量化上清液的^{蛋白质含量}。
   9. 将加载缓冲液添加到每个条件含有 30-50 μg 蛋白质的等分物中，并将其加载到 12% 聚丙烯酰胺凝胶中，用于西印。使用特定的磷抗体检测 pTrkB 和 pERK 以验证 BDNFAvi 生物活性。
2. 通过pCREB免疫荧光验证BDNF-QD生物活性。
   1. 种子40，000大鼠皮质神经元在10毫米盖玻片，以前自 <3>克拉，并处理与聚L-莱辛，如前面^所述21。
   2. 培养神经元7-8天在神经元维持缓冲液（见补充材料）在37oC。
   3. 要开始实验，将介质更改为未松松的神经基础介质，并在 37 oC 下孵育 1 小时。
   4. 通过添加 mbtBDNF 等等项（量子点链素结合量（链球菌素-QD）来准备与量子点 （BDNF-QD） 结合的 mbtBDNF，以实现 1:1BDNF-QD 摩尔比。然后，用神经基础介质稀释至20μL。用铝箔包裹管子，保护管子免受光线的腐蚀。
      注:准备另一个管与相同体积的量子点链球菌素结合，并稀释到20μL与神经基础介质作为负对。
   5. 在摇杆的室温下，孵育 mbtBDNF/ 链球菌素-QD混合物 30 分钟。
   6. 在神经基础介质中将BDNF-QD稀释至所需的最终浓度（200 pM和2nM）。
   7. 使用非补充神经基础介质孵育1小时后，用BDNF-QD或链球菌素-QD（控制）刺激神经元最终浓度为200 pM，BDNF为2nM，在37°C下为30分钟。
   8. 用 1x PBS （37 °C） 清洗盖玻片 3 次，用含有磷酸酶抑制剂的 4% 甲醛溶液处理盖玻片，将细胞固定 15 分钟。
   9. 用PBS清洗细胞3次，然后用阻尼/渗透缓冲液（BSA 5%，Triton X-100 0.5%，1x磷酸酶抑制剂）孵育1小时。
   10. 在4°C下用抗pCREB抗体1:500（3%BSA，0.1%Triton X-100）过夜孵育。
   11. 第二天，用1x PBS洗涤3次，用二次抗体1:500孵育1小时（3%BSA，0.1%Triton X-100）。
   12. 用 1 倍 PBS 洗涤 3 次。加入 Hoechst 核染色溶液 （5 μg/mL） 7 分钟。
   13. 用 1x PBS 清洗 3 次并安装。
3. 活神经元中BDNF-QD逆行的斧弓传输的可视化
   1. 准备微流体室和种子神经元，如前面描述^的16。
   2. 在培养7-8天后，将培养基更改为非补充神经基础介质。
   3. 通过添加 mbtBDNF 等等项（量子点链素结合量（链球菌素-QD）来准备与量子点 （BDNF-QD） 结合的 mbtBDNF，以实现 1:1BDNF-QD 摩尔比。然后，用神经基础介质稀释至20μL。用铝箔包裹管子，保护管子免受光线的腐蚀。
      注:准备另一个管与相同体积的量子点链球菌素结合，并稀释到20μL与神经基础介质作为控制。
   4. 在摇杆的室温下，孵育 mbtBDNF/ 链球菌素-QD混合物 30 分钟。
   5. 将 BDNF-QD 稀释到所需的最终浓度 （2 nM）。
   6. 使用非补充神经基基孵育1小时后，将BDNF-QD或控制混合物加入微流体室的气动室。在37°C下孵育210分钟，以确保BDNF-QD的净逆行运输。
   7. 对于活细胞成像，使用适合这些目的的显微镜（37°C 和 5% CO2），使用 100 倍目标的微毛体片段中可视化轴向逆行传输。以 1 帧/s 速率获取图像。

结果

使用基于色谱柱的协议可以处理大量 HEK293 条件介质。在图1中，显示了从500mL的调节介质中纯化BDNFAvi的结果。从Ni-NTA agarose珠连续洗脱BDNFAvi产生BDNFAvi浓度下降（图1A）。经过四次连续洗脱（每次持续15分钟），珠子捕获的大多数BDNF被恢复。Eluates 的浓度范围为 6 至 28 ng/μL，总产量约为 BDNFAvi 的 60 μg（表 1）。然后，由BirA-GST调解的体外反应...

讨论

本文根据宋和合作者17的工作，描述了在基于亲和力色谱的工艺中生产和纯化mbtBDNF的^优化方法。优化包括使用具有成本效益的转染试剂 （PEI），同时保持更昂贵的转染方法（如脂氨基胺）的效率。这种优化可显著降低协议成本，实现可扩展性，同时保持高成本效益。该协议还包括易用性考虑，包括冻结有条件介质长达2个月。这些优化使程序适应每个实验室的需求，提高成本效?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 way stopcock	BioRad	7328102	Chromatography apparatus component
2-mercaptoethanol	Sigma	M6250	BDNF elution buffer
Acrylamide/Bisacrylamide	BioRad	1610154	SDS-PAGE gel preparation
Amicon Ultra-15 10K	Millipore	UFC901024	BDNF concentration
Ammonium Persulfate	Sigma	A9164	SDS-PAGE gel preparation
anti B-III-Tubulin antibody	Sigma	T8578	Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti BDNF antibody	Alomone	AGP-021	Western blot assays for BDNF quantification
anti BDNF antibody	Alomone	ANT-010	Western blot assays for BDNF quantification
Anti ERK antibody	Cell Signaling	9102	Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pCREB antibody (S133)	Cell Signaling	9198	Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pERK antibody (T202, Y204)	Cell Signaling	4370	Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pTrkB antibody (Y515)	Abcam	ab109684	Western blot assays for BDNF biological activity detection
Antibiotic/Antimycotic	Gibco	15240-062	HEK293 maintenance
ATP	Sigma	A26209	BDNF monobiotinylation buffer
B-27 Supplement	Gibco	17504-044	Neuron maintenance
Bicine	Sigma	B3876	BDNF monobiotinylation buffer
BirA-GST	BPS Bioscience	70031	Enzyme for BDNF AviTag monobiotinylation
Bovine Fetal Serum	HyClone	HC.SH30396.02	HEK293 maintenance
Bovine Serum Albumin	Jackson ImmunoResearch	001-000-162	BDNF buffer modification component, blocking buffer for western blot and immunofluorescence
D-Biotin	Sigma	B4639	BDNF monobiotinylation buffer
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
DMEM High Glucose Medium	Gibco	11965-092	Neuron seeding
DMEM Medium	Gibco	11995-081	HEK293 maintenance
Econo Column Funnel	BioRad	7310003	Chromatography apparatus component
EDTA	Merck	108418
EZ-ECL Kit	Biological Industries	1633664	Protein detection by western blotting
Glutamax	Gibco	35050-061	Neuron and HEK293 maintenance
Glycerol	Merck	104094	BDNF elution buffer, lysis buffer for western blot assays
Hettich Rotina 46R Centrifuge	Hettich	Discontinued	Centrifuge used for clearing the medium of debris
Hettich Universal 32R Centrifuge	Hettich	Discontinued	Centrifuge used for protein concentrator centrifugation
Horse Serum	Gibco	16050-122	Neuron seeding
ImageQuant LAS 500	GE Healthcare Life Sciences	29005063	Western blot image acquisition
Imidazole	Sigma	I55513	BDNF buffer modification component
KCl	Winkler	BM-1370	PBS component
KH2PO4	Merck	104873	PBS component
Laminin	Invitrogen	23017-015	Cover coating for compartmentalized neurons
Luer Tubing Adaptor	BioRad	7323245	Chromatography apparatus component
Luminata™ Forte Western HRP Substrate	Millipore	WBLUF0100	Protein detection by western blotting
Mg(CH3COO)2	Merck	105819	BDNF monobiotinylation buffer
Mowiol 4-88	Calbiochem	475904	Mounting reagent for immunofluorescence assays
MyOne C1 Streptavidin Magnetic Beads	Invitrogen	65001	Biotinylation verification
Na2HPO4	Merck	106586	BDNF buffer modification component
NaCl	Winkler	BM-1630	PBS component, BDNF buffer modification component
NaH2PO4	Merck	106346	BDNF buffer modification component
Neurobasal Medium	Gibco	21103-049	Neuron maintenance
Ni-NTA Agarose Beads	Qiagen	30210	BDNF AviTag purification
Nikon Ti2-E	Nikon		Microscope for fluorescence imaging
Nitrocellulose Membrane	BioRad	1620115	Protein transfer for western blotting
ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera	Hamamatsu	C13440-20CU	Camera for epifluorescence imaging
P8340 Protease Inhibitor Cocktail	Sigma	P8340	BDNF buffer modification component
Paraformaldehyde	Merck	104005	Fixative for immunofluorescence assays
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	Neuron maintenance
Poli-D-Lysine	Corning	DLW354210	Cover coating for compartmentalized neurons
Poli-L-Lysine	Millipore	P2363	Cover coating for non-compartmentalized neurons
Poly-Prep Chromatography Column	BioRad	7311550	Chromatography apparatus component
Polyethyleneimine 25K	Polysciences Inc.	PLY-0296	HEK293 transfection
Quantum Dots 655 streptavidin conjugate	Invitrogen	Q10121MP	Monobiotinylated BDNF AviTag label for live and fixed cell experiments
Saponin	Sigma	S4521	Detergent for immunofluorescence assays
Sucrose	Merck	107687
Syldgard 184 silicone elastomer base	Poirot	4019862	Microfluidic chamber preparation
TEMED	Sigma	T9281	SDS-PAGE gel preparation
Tris	Winkler	BM-2000	Lysis buffer component
Triton X100	Merck	108603	Cell permeabilization in immunofluorescence and western blot assays
Trypsin-EDTA 0.5%	Gibco	15400-054	HEK293 passaging