פרוטוקול משופר כדי לטהר ו מונו ישירות-Biotinylate BDNF בתוך צינור ללימודי סחר בתאי הסלולר בנוירונים

Nicolás Stuardo; Guillermo Moya-Alvarado; Carolina Ramírez; Giampietro Schiavo; Francisca  C. Bronfman

doi:10.3791/61262

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

רקומביננטי BDNF המכיל רצף Avi (Bdnפאבאני) מופק בתאים HEK293 באופן חסכוני ומטוהר על ידי כרומטוגרפיה של זיקה. לאחר מכן BDNFavi באופן ישיר מונו-biotinylated עם בירה אנזים בשפופרת. Bdn, ו מונו-biotinylbdni שמירה על הפעילות הביולוגית שלהם בהשוואה BDNF זמין מסחרית.

Abstract

רקומביננטי BDNF המכיל רצף Avi (Bdnפאבאני) מופק בתאי HEK293 ולאחר מכן מטוהרים ביעילות על ידי כרומטוגרפיה של זיקה. פרוטוקול התפתחות פותחה כדי ישירות מונו-biotinylate אוחר Bdn, עם בירה אנזים בצינור. בתגובה זו, שומרת על הפעילות הביולוגית של מונו-ביוטיליס.

Neurotrophins הם מטרה נגזר גורמי הצמיחה לשחק תפקיד בפיתוח עצבי ותחזוקה. הם דורשים מנגנוני הובלה מהירה לאורך השביל endocytic כדי לאפשר איתות למרחקים ארוכים בין תאים עצביים שונים. התפתחות של כלים מולקולריים כדי ללמוד את הסחר של neurotrophins אפשרה מעקב מדויק של חלבונים אלה בתא באמצעות הקלטה vivo . בפרוטוקול זה פיתחנו הליך מיטבי וחסכוני לייצור BDNF מונו-biotinylated. משתנה bdnf רקומביננטי המכיל רצף avi biotinylable (bdnפאבאני) מופק בתאי HEK293 בטווח יקרוגרם ולאחר מכן מטוהרים בהליך מדרגי בקלות באמצעות כרומטוגרפיה זיקה. BDNF מטוהרים לאחר מכן יכול להיות מונו הומוגנזיס ביולוגי על ידי תגובה ישירה באמצעות מבחנה עם בירה אנזים בצינור. הפעילות הביולוגית של BDNF מונו-biotinated (mbtBDNF) יכול להיות מצומדת כדי streptavidin-מעלה מעלה לתוך fluorophores שונים. BDNFAvi ו בmbtbdnf לשמור על הפעילות הביולוגית שלהם הפגינו באמצעות זיהוי של מטרות זרחתי במורד הזרם באמצעות הכתם המערבי והפעלה של מקדם שעתוק CREB, בהתאמה. באמצעות streptavidin-הנקודות הקוואנטום, היינו מסוגלים לדמיין את הקשר באמצעות הפנמה במקביל עם ההפעלה של CREB, אשר זוהה עם נוגדן מסוים פוספהו-CREB. בנוסף, mbtBDNF מעלה מצועם streptavidin-הנקודות הקוונטיות היה מתאים לניתוח הובלה נסיגה בנוירונים בקליפת הבית הגדול בתאי מיקרופלואידיג. כך, בצינור המיוצר mbtBDNF הוא כלי אמין כדי לחקור את הדינמיקה של איתות פיזיולוגי אנדוכמה וסחר בנוירונים.

Introduction

נוירונים הם יחידות תפקודית של מערכת העצבים בעל מורפולוגיה מורכבת ומיוחדת המאפשרת תקשורת סינפטית, ולכן, הדור של התנהגות מתואמת ומורכבת בתגובה לגירויים שונים. התחזיות הנוירואליות כגון דנדריטים ואקאונים הן תכונות מבניות קריטיות המעורבות בתקשורת עצבית, ונוירוטרופלנים הם שחקנים קריטיים בקביעת המבנה והתפקוד שלהם¹. Neurotrophins הם משפחה של גורמי צמיחה מופרש הכוללים NGF, NT-3, NT-4, ואת המוח נגזר neurotrophic factor (BDNF)². במערכת העצבים המרכזית (cn), bdnf משתתפת בתהליכים ביולוגיים מגוונים, כולל neurotransmission, הארבוריזציה הדנדריטי, התבגרות של השדרה הדנדריטי, פוטנציאל לטווח ארוך, בין השאר³^,⁴. לכן, BDNF משחק תפקיד קריטי בוויסות תפקוד עצבי.

תהליכים סלולאריים שונים מווסת דינמיקה BDNF ותפקוד. על פני השטח העצבי, BDNF מאגד את הקולטן הטרופויוסין קינאז B (TrkB) ו/או קולטן נוירוטרופין p75 (p75). Bdnf-trkb ו-bdnf-p75 מתחמי הם מסודרים וממוינות^בתוךמערכות endocytic שונים 5^,⁶^,⁷^,⁸. תקן סחר תאיים של מתחם bdnf/trkb נדרש עבור איתות bdnf נאות במעגלים עצביים שונים⁹^,¹⁰^,¹¹. מסיבה זו, הבנה עמוקה של הדינמיקה הסחר BDNF ושינויים שנמצאו בתהליכים pathפסלוגיים הוא חיוני כדי להבין את האיתות BDNF בריאות ומחלות. התפתחות הרומן והכלים המולקולריים הספציפיים לניטור תהליך זה יסייעו לנהוג בשדה זה קדימה ולאפשר תפיסה טובה יותר של מנגנוני הרגולציה המעורבים.

ישנם מספר כלים זמינים למחקר של סחר BDNF בנוירונים. מתודולוגיה בשימוש נפוץ כוללת את הרקומביננטי bdnf מתויג עם מולקולות פלורסנט כגון חלבון פלורסנט ירוק (gfp) או הווריאציה monomeric אדום העביר המשתנה של gfp mcherry¹²^,¹³. עם זאת, קיצור מרכזי של ביטוי overdnf הוא שזה מבטל את האפשרות של אספקת ריכוזים ידועים של נוירוטרופין זה. כמו כן, זה עלול לגרום רעילות הסלולר, מטשטש את הפרשנות של תוצאות¹⁴. אסטרטגיה חלופית היא העברה של מעבר החצייה של TrkB מתויג, כגון דגל-TrkB. מתודולוגיה זו מאפשרת ללמוד את הדינמיקה של TrkB הפנמה¹⁵, אבל זה כולל גם העברה, אשר עשוי לגרום לתפקוד שונה trkb ורעילות הסלולר. כדי להתגבר על מכשולים מתודולוגיים אלה, רקומביננטי משתנים של ngf ו bdnf המכיל רצף Avi (bdnפאבאני), אשר יכול להיות מונו-biotinated על ידי ביוטין-ligase אנזימים בירה, פותחו¹⁶^,¹⁷. Biotinylated רקומביננטי BDNF יכול להיות מצמידים כלים שונים מאוגד streptavidin, אשר כוללים fluorophores, חרוזים, חלקיקים פאראמגנטים בין היתר לאיתור. מבחינת הדמיה של תא חי, נקודות הקוונטים (QD) הפכו לעתים קרובות fluorophores, כפי שהם מאפיינים רצוי עבור מעקב יחיד חלקיק, כגון בהירות מוגברת ועמידות הלבנת כאשר לעומת מולקולה קטנה fluorophores¹⁸.

הייצור של מונו-biotinylated BDNF (mbtBDNF) באמצעות Bdnפאבאני הושגה על ידי העברת שיתוף של פלמידים הנהיגה ביטוי של Bdnפאבאני ובירה, ואחריו טיהור של חלבון רקומביננטי על ידי כרומטוגרפיה של אהדה עם תשואה של 1-2 μg של BDNF ל 20 מ ' של מדיה תרבותית ממוזגת¹⁷. כאן, אנו מציעים שינוי של פרוטוקול זה המאפשר את טיהור BDNFAvi מ 500 mL של מדיה ממוזג, אשר מבקש למקסם את ההתאוששות מחלבון בפרוטוקול מבוסס טור כרומטוגרפיה על קלות מניפולציה. הסוכן המשמש לזיהום, פוליאתילן, מבטיח שיטה חסכונית מבלי להקריב את התשואה החוצה. הצעד מונו-ביולציה הותאם לתגובת חוץ גופית כדי למנוע את הסיבוכים הקשורים בשיתוף פעולה ולהבטיח תוויות הומוגנית של BDNF. הפעילות הביולוגית של mbtbdnf הוכח על ידי כתמי המערבי וניסויים מיקרוסקופ פלואורסצנטית, כולל הפעלת pcreb ולחיות הדמיה תא ללמוד הובלה סיבי הנסיגה של bdnf בתאי microfluidic. השימוש בפרוטוקול זה מאפשר מיטוב, ייצור תשואה גבוהה של מונו הומוגנית-biotinylated ו פעילים ביולוגית BDNF.

Protocol

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות המאושרות של CONICYT (הנציבות הלאומית של צ'ילה למחקר מדעי וטכנולוגי). הפרוטוקולים ששימשו במחקר זה אושרו על ידי ועדות הביוסקיוריטי והביואתיקה ובעלי החיים של האוניברסיטה האפיפיורית קתליקה דה צ'ילה. הניסויים הכרוכים בבעלי חוליות אושרו על ידי ועדת הרווחה של ביואתי ובעלי החיים של האוניברסיטה האפיפיורית קתליקה דה צ'ילה.

הערה: הפרוטוקול הבא נועד לטהר את BDNFAvi מתוך נפח כולל של 500 mL של בינוני ממוזג המיוצר בתאי HEK293. כמות המדיום הממוזג המיוצר ומעובד כדי לטהר את BDNFAvi יכול להיות למעלה או להוריד את קנה המידה לפי הצורך. עם זאת, אופטימיזציה נוספת עשויה להיות נחוצה בנסיבות אלה. ניתן למצוא את הרכב המדיה התרבותית והמאגרים הנמצאים בשימוש בכל הפרוטוקול בחומרים משלימים.

1. ייצור וטיהור של BDNFAvi מתוך מדיה ממוזגת HEK293

העברה של תאי HEK293
1. לגדול HEK293 תאים 70% המפגש בתוספת DMEM בינונית (10% בסרום העובר, 1 x מגלוטמט מוסף, 1x אנטיביוטי/antimycotic) ב 15 ס מ מנות התרבות ב 37 º C.
2. שנה את המדיה הבינונית לחוצץ.
3. הכן את תערובת הדי. אנ. איי. לזיהום העור השתמש בשני שונים 15 מ ל צינורות חרוטי כדי לדלל דנ א ו פיי 40 K, בהתאמה. לדלל 20 μg של DNA פלמיד בנפח הסופי של 500 μL בשפופרת אחת. לדלל 60 μg של ליניארי פיי 25K בנפח הסופי של 500 μL בצינור השני. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות.
4. מערבב בזהירות את פתרון הדי-אן-איי. בצינור פיי, ערבוב פעם אחת בתנועה דגירה בטמפרטורת החדר עבור 25 דקות.
5. טפטוף 1 מ ל של התערובת הפיי-די-אן-איי במהלך כל 15 ס מ המנה. מודיית את התאים עם התערובת פיי-די-אן במשך 3 שעות ב 37 º C.
6. לשנות את המדיום לחיץ הדגירה טרי.
איסוף ואחסון מדיה
1. לאסוף את המדיום מכל הצלחות 48 h לאחר הגלגול של תאים HEK293. הכינו מלאי מרוכז של הפתרונות המתוארים בסעיף "מאגר השינויים supernatant" של קובץ משלים 1 והוסיפו אותם ל-HEK293-הסופראנט כדי להשיג את הריכוזים הסופיים המפורטים.
  הערה: ניתן להיפטר מתאים או לשחזר אותם לצורך ניתוח נוסף.
2. מודאת המדיום בקרח עבור 15 דקות.
3. מחלקים את המדיום לתוך צינורות צנטריפוגה.
4. צנטריפוגה את המדיום ב 10,000 x g עבור 45 דקות בצנטריפוגה 4 ° c. שלב זה מאפשר חיסול של פסולת תא ותאים מתים המושהים במדיה.
5. לאסוף את הסופרנטנים, להוסיף BSA בריכוז הסופי של 0.1%. ולאחר מכן לאחסן ב-20 ° c. התקשורת יכולה להיות מצוטט לפני הקפאה על הפשרה מהר יותר במהלך שלב הטיהור.
  הערה: זמני אחסון של מדיה ממוזגת הקפואה של עד 2 חודשים הניבו תוצאות חיוביות, שעות אחסון ארוכות יותר לא הוערכו.
ריכוז וטיהור מדיה
1. הפשרת אמצעי התקשורת באמבט של 37 ° c.
2. . מחלקים את המדיה לצינורות הצנטריפוגה
3. צנטריפוגה את המדיום עבור 1 h ב 3,500 x g ב 4 מעלות צלזיוס צנטריפוגה מקורר. שלב זה מאפשר חיסול של פסולת התא הנותרים כדי להבטיח זרימה נאותה דרך העמודה כרומטוגרפיה.
4. השתמש בריכוז חלבון עם הפסקת kDa 10 כדי להפחית את התקשורת מ 500 mL ל 100 mL. בצע את הפרמטרים הצנטריפוגה המומלצים של היצרן לצורך ריכוז אופטימלי.
5. הוסף 500 μL של Ni-נ. ת. ד. חרוזים למדיה מרוכזת ו מודדת לילה ב 4 ° c ב נדנדה.
6. הכנס את מכשיר הכרומטוגרפיה ושפוך את המדיה לתוכו. תן לו לנוח 5 דקות ולאחר מכן לפתוח את 2-הדרך רזלים תרנגול לתת את המדיום לזרום.
7. לשטוף את החרוזים עם 5 מ ל של מאגר לשטוף עבור 5 דקות. הקפד להשהות מחדש את החרוזים בעמודה. לנקז את מאגר לשטוף ידי פתיחת הפקק 2-כיוון. . אני חוזר 3 פעמים
8. הוסף 1 mL של מאגר הימנעות לעמודה. הקפד להשעות מחדש את החרוזים בעמודה. דגירה של 15 דקות, ולאחר מכן לאסוף את החומקת בשפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL. חזור על שלב זה 3 פעמים עבור הימנעות מוחלטת של BDNFAvi.
9. טען 5 μL של כל משחרו ריכוזים שונים של BDNF זמין מסחרית (40-160 ng) ב 15% פוליאקרילאמיד ג'ל. לזהות את החלבון הטהור על ידי הכתמים המערביים באמצעות נוגדן אנטי BDNF.
10. לקבוע את הריכוז של BDNFAvi מטוהרים בכל להתחמק באמצעות עקומת ריכוז מוכן עם BDNF זמין מסחרית.
11. הורדה ואחסון של BDNFAvi מטוהרים ב-80 ° c.

2. בתוך מונו-ביוקטילציה של BDNFAvi באמצעות אנזים בירה

תגובת מונו-ביונילציה מחוץ למבחנה
1. הכנת פתרונות מלאי מרוכזים של ריאגנטים מאגר biotinylation. השימוש במניות מרוכז יצמצם את הדילול של החלבון הרקומביננטי.
2. לקחת סדרת מחלקים 800 ng של bdnfavi ולהוסיף את מאגר ביולציה ריאגנטים ואת בירה האנזים ביחס הטוחנת 1:1 bdnf. לדוגמה, עבור הוספת נפח תגובה סופי של 200 μL; 100 μL של פתרון המכיל 800 ng של BDNFAvi, 20 μL Bicine 0.5 M pH 8.3, 20 μL ATP 100 mM, 20 μL MgOAc 100 mM, 20 μL d-biotin 500 μM, 0.8-1 μg עד 1 μL של בירה-GT, והשלם כדי 200 μL עם מים באולטרסאונד.
  הערה: התגובות biotinylation מוצלחת בוצעו עם aliquots של 400 μL המכיל ריכוז של כ 30 ng/μL BDNFAvi, וכתוצאה מכך bdnfavi באופן הומוגנטי ביולוגי לריכוז הסופי של ~ 20 ng/μL בתגובה הסופית.
3. מודקון את התערובת ב 30 ° c בתנור הכלאה עבור 1 h. לערבב את התוכן על ידי היפוך צינור כל 15 דקות.
4. הוסף את אותו כמות של ATP ובירה כמו בשלב 2.1.2 וחזור על 2.1.3 שלב.
5. חנות ב-80 ° צ' לניתוחים עתידיים או לשמור על קרח לשימוש מיידי (לדוגמה, בקרת איכות biotinylation).
ניתוח ביוטילציה
1. בלוק 30 μL של חרוזים מגנטיים streptavidin לדגימת BDNF ב 1 mL של חסימת מאגר. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 1 h בתוך מסובבי הצינורית מיקרוצנטריפוגה.
2. מזרז את החרוזים המגנטיים באמצעות מתלה הפרדה מגנטי במשך 3 עד 5 דקות או עד שהמאגר מופיע נקי לחלוטין מהחרוזים ומתעלם מהמאגר החוסם.
3. הוסף 50 μL של מאגר חסימות טרי ו 80 ng של מונו-biotinylated BDNFAvi (mbtBDNF) לדגום את החרוזים, והקפד להשעות אותם לגמרי על ידי ביצוע.
4. מודטה ב 4 ° c עבור 1 h בתוך מסובבי הצינורית מיקרוצנטריפוגה מסתובב כ 20 סל ד.
5. לאסוף את החרוזים באמצעות מתלה ההפרדה המגנטי עבור 3 כדי 5 דקות, ולאסוף את supernatant, שמירה על 30 μl סדרת מחלקים לניתוח.
6. לשטוף את החרוזים פעם אחת עם 500 μL של PBS, ולאחר מכן לאסוף אותם באמצעות מתלה ההפרדה המגנטי עבור 3 כדי 5 דקות. שחזר את הסופרנטאנט ושמור 30 μL לניתוח.
7. הוסף 10 μL של מאגר טעינת 4x לחרוזים.
8. מחממים את הדגימות עד 97 ° c במשך 7 דקות כדי לעבור את מתחת לשעון.
9. זיהוי מmbtbdnf באמצעות נוגדן אנטי-BDNF מסוים¹⁹.

3. אימות הפעילות הביולוגית של בmbtbdnf

זיהוי של pTrkB והטבה באבן חשופה מערבית.
1. זרעי 2,000,000 מנות לתרבות הקליפת העצב בשנת 60 מ"מ.
2. תרבות הנוירונים במשך 7 ימים (DIV7). לאחר מכן, לשנות את המדיום מדיה נוירובסיס שאינם בתוספת בעת הפעלת הניסוי.
3. שעה אחת לאחר שינוי בינוני, להוסיף mbtBDNF לריכוז סופי של 50 ng/mL. מודקון למשך 30 דקות ב 37 º C. שמור על צלחת שליטה שלילית (לא מגורה עם BDNF) ו צלחת בקרה חיובית (מטופלים עם 50 ng/mL של BDNF זמין מסחרית).
4. לאסוף את המדיום ולשטוף בעדינות כל צלחת עם 1x PBS. לאסוף ולמחוק את ה-1x PBS.
5. הניחו את הכלים על הקרח והוסיפו 50-80 μL של מאגר הליזה לכל מנה. השתמש במגרד התא כדי להפעיל את התאים.
  הערה: יש לבצע את שלב הליזה במהירות האפשרית כדי למנוע התדרדרות והשפלה של חלבונים. 1-2 דקות של גירוד נמרץ מספיק כדי לדמיין את החלבונים של עניין על ידי בלוק המערבי.
6. לאסוף את מאגר הליזה ומערבבים במיקסר מערבולת במהירות הגבוהה ביותר עבור 5 s.
7. צנטריפוגה את מאגר הליזה ב14,000 x g (4 ° c) עבור 10 דקות.. תאסוף את הסופרנטאנט
8. מכמת את תכולת החלבון של סופרנטנט על ידי פרוטוקול בדיקת חלבון BCA²⁰.
9. הוסף מאגר טעינת כדי סדרת מחלקים המכיל 30-50 μg של חלבון לכל מצב ולטעון אותו ב 12% אלקטרופורזה ג'ל עבור בלוק מערבי. זיהוי pTrkB והטבה באמצעות פוספפו-נוגדנים ספציפיים כדי לאמת את הפעילות הביולוגית של BDNFAvi.
אימות של פעילות ביולוגית של BDNF-QD על-ידי pCREB אימונוoforסנס.
1. זרע 40,000 הנוירונים בקליפת העצב בתוך 10 מ"מ שמיכות, בעבר אוטוקלבד וטיפל עם פולי-L-ליזין כפי שמתואר בעבר²¹.
2. תרבות הנוירונים ב7-8 ימים במאגר תחזוקה עצבי (ראה חומרים משלימים) ב 37 º C.
3. כדי להתחיל את הניסוי, לשנות את המדיום לבטל בינוני נוירובסיס neurobasal ב 37 º C עבור 1 h.
4. הכינו mbtBDNF מבצוחה לנקודות הקוונטים (BDNF-QD) על-ידי הוספה ל-mbtBDNF, הנפח הדרוש של נקודה קוונטית streptavidin המשלים (streptavidin-QD) כדי להשיג 1:1 BDNF-QD היחס הטוחנת. אז, לדלל 20 μL עם מדיום נוירובסיס. עוטפים את הצינור ברדיד אלומיניום כדי להגן עליו מפני האור.
  הערה: הכינו צינור אחר עם אותו כמות של נקודה קוונטית streptavidin המשלים ולדלל אותו 20 μL עם מדיום נוירוסיס כפקד שלילי.
5. מודחה את תערובת mbtBDNF/streptavidin-QD במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ברוקר.
6. לדלל את BDNF-QD לריכוז הסופי הרצוי (200 pM ו 2 ננומטר) במדיום neurobasal סיס.
7. לאחר 1 h של הדגירה עם בינונית נוירובסיס שאינם בתוספת, לעורר את הנוירונים עם BDNF-QD או streptavidin-QD (שליטה) לריכוז הסופי של 200 pM ו 2 ננומטר של BDNF עבור 30 דקות ב 37 ° c.
8. לשטוף את שמיכות 3 פעמים עם 1x PBS (37 ° c) ולתקן את התאים עבור 15 דקות על ידי טיפול coverslips עם 4% הפתרון פאראפורמלדהיד המכיל מעכבי פוספספטאז.
9. לשטוף את התאים 3 פעמים עם PBS, ולאחר מכן דגירה עם חסימה/חדירות מאגר (BSA 5%, טריטון X-100 0.5%, 1x פוספאטאז מעכבי) עבור 1 h.
10. דגירה עם נוגדן anti-pCREB 1:500 (ב 3% BSA, 0.1% טריטון X-100) לילה ב 4 ° c.
11. למחרת, לשטוף 3 פעמים עם ה-PBS 1x, ו הדגירה עבור 1 h עם הנוגדן המשני 1:500 (3% BSA, 0.1% טריטון X-100).
12. לשטוף 3 פעמים עם 1 x PBS. הוסף הואכסט פתרון כתמים גרעינית (5 μg/mL) עבור 7 דקות.
13. לשטוף 3 פעמים עם 1 x PBS ו הר.
ויזואליזציה של התחבורה הרטרוגרלית של BDNF-QD ב נוירונים חיים
1. הכינו תאי מיקרו-פלואידים ונוירונים בזרעים כמתואר בעבר¹⁶.
2. לאחר 7-8 ימים בתרבות, לשנות את המדיום למדיום נוירובסיס שאינו בתוספת.
3. הכינו mbtBDNF מבצוחה לנקודות הקוונטים (BDNF-QD) על-ידי הוספה ל-mbtBDNF, הנפח הדרוש של נקודה קוונטית streptavidin המשלים (streptavidin-QD) כדי להשיג 1:1 BDNF-QD היחס הטוחנת. אז, לדלל 20 μL עם מדיום נוירובסיס. עוטפים את הצינור ברדיד אלומיניום כדי להגן עליו מפני האור.
  הערה: הכינו צינור אחר עם אותו כמות של נקודה קוונטית streptavidin המשלים ולדלל אותו 20 μL עם מדיום נוירוסיס כפקד.
4. מודחה את תערובת mbtBDNF/streptavidin-QD במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ברוקר.
5. לדלל את BDNF-QD לריכוז הסופי הרצוי (2 ננומטר).
6. לאחר 1 h של דגירה עם בינוני נוירובסיס שאינו בתוספת להוסיף את bdnf-qd או את התערובת בקרת לתאי סיבי של החדר microfluidic. מודקון עבור 210 דקות ב 37 ° צ' כדי להבטיח הובלה נטו נסיגה של BDNF-QD.
7. עבור הדמיה של תא חי, באופן חזותי העברת התחבורה בקטע של המיקרוחריצים הנמצאים בראש תא הגוף התא באמצעות מטרה 100x באמצעות מיקרוסקופ המתאים למטרה זו (37 ° צ' צלזיוס ו-5% CO2). לרכוש תמונות ב 1 מסגרת/s.

תוצאות

השימוש בפרוטוקול מבוסס עמודות כרומטוגרפי מאפשר עיבוד של כמויות משמעותיות של מדיה ממוזגת HEK293. באיור 1, התוצאות של טיהור של BDNFAvi מ 500 mL של מדיה ממוזג מוצגים. הפרשות רצופות של BDNFAvi מ-Ni-נ. ת. ע. מחרוזת תשואה הפחתת ריכוזים של BDNFAvi (איור 1A). לאחר ארבע הפרשות רצופות (כל מ?...

Discussion

במאמר זה, מתודולוגיה ממוטבת לייצור וטיהור של mbtBDNF בהליך מבוסס כרומטוגרפיה הזיקה מתוארת, בהתבסס על עבודתם של סונג ומשתפי פעולה¹⁷. המיטובים כוללים את השימוש במיגיב התרגום החסכוני (פיי) תוך שמירה על יעילות של שיטות מעבר יקרות יותר כגון lipofectamine. מיטוב זה מיתרגם הפחתת עלות משמעותית ?...

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

המחברים בהכרת תודה התמיכה הפיננסית של Fondecyt (1171137) (FCB), מרכז בסיס של מצוינות במדע וטכנולוגיה (AFB 170005) (FCB), מילניום-גרעין (P07/011-F) (FCB), פרס החוקר הבכיר לאמון (107116/Z/15/Z) (GS) ו בבריטניה מחקר דמנציה פרס קרן (GS). העבודה הזאת נתמכת על ידי Unidad דה מיקרוצאדה Avanzada UC (UMA UC).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 way stopcock	BioRad	7328102	Chromatography apparatus component
2-mercaptoethanol	Sigma	M6250	BDNF elution buffer
Acrylamide/Bisacrylamide	BioRad	1610154	SDS-PAGE gel preparation
Amicon Ultra-15 10K	Millipore	UFC901024	BDNF concentration
Ammonium Persulfate	Sigma	A9164	SDS-PAGE gel preparation
anti B-III-Tubulin antibody	Sigma	T8578	Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti BDNF antibody	Alomone	AGP-021	Western blot assays for BDNF quantification
anti BDNF antibody	Alomone	ANT-010	Western blot assays for BDNF quantification
Anti ERK antibody	Cell Signaling	9102	Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pCREB antibody (S133)	Cell Signaling	9198	Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pERK antibody (T202, Y204)	Cell Signaling	4370	Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pTrkB antibody (Y515)	Abcam	ab109684	Western blot assays for BDNF biological activity detection
Antibiotic/Antimycotic	Gibco	15240-062	HEK293 maintenance
ATP	Sigma	A26209	BDNF monobiotinylation buffer
B-27 Supplement	Gibco	17504-044	Neuron maintenance
Bicine	Sigma	B3876	BDNF monobiotinylation buffer
BirA-GST	BPS Bioscience	70031	Enzyme for BDNF AviTag monobiotinylation
Bovine Fetal Serum	HyClone	HC.SH30396.02	HEK293 maintenance
Bovine Serum Albumin	Jackson ImmunoResearch	001-000-162	BDNF buffer modification component, blocking buffer for western blot and immunofluorescence
D-Biotin	Sigma	B4639	BDNF monobiotinylation buffer
DMEM High Glucose Medium	Gibco	11965-092	Neuron seeding
DMEM Medium	Gibco	11995-081	HEK293 maintenance
Econo Column Funnel	BioRad	7310003	Chromatography apparatus component
EDTA	Merck	108418
EZ-ECL Kit	Biological Industries	1633664	Protein detection by western blotting
Glutamax	Gibco	35050-061	Neuron and HEK293 maintenance
Glycerol	Merck	104094	BDNF elution buffer, lysis buffer for western blot assays
Hettich Rotina 46R Centrifuge	Hettich	Discontinued	Centrifuge used for clearing the medium of debris
Hettich Universal 32R Centrifuge	Hettich	Discontinued	Centrifuge used for protein concentrator centrifugation
Horse Serum	Gibco	16050-122	Neuron seeding
ImageQuant LAS 500	GE Healthcare Life Sciences	29005063	Western blot image acquisition
Imidazole	Sigma	I55513	BDNF buffer modification component
KCl	Winkler	BM-1370	PBS component
KH₂PO₄	Merck	104873	PBS component
Laminin	Invitrogen	23017-015	Cover coating for compartmentalized neurons
Luer Tubing Adaptor	BioRad	7323245	Chromatography apparatus component
Luminata™ Forte Western HRP Substrate	Millipore	WBLUF0100	Protein detection by western blotting
Mg(CH₃COO)₂	Merck	105819	BDNF monobiotinylation buffer
Mowiol 4-88	Calbiochem	475904	Mounting reagent for immunofluorescence assays
MyOne C1 Streptavidin Magnetic Beads	Invitrogen	65001	Biotinylation verification
Na₂HPO₄	Merck	106586	BDNF buffer modification component
NaCl	Winkler	BM-1630	PBS component, BDNF buffer modification component
NaH₂PO₄	Merck	106346	BDNF buffer modification component
Neurobasal Medium	Gibco	21103-049	Neuron maintenance
Ni-NTA Agarose Beads	Qiagen	30210	BDNF AviTag purification
Nikon Ti2-E	Nikon		Microscope for fluorescence imaging
Nitrocellulose Membrane	BioRad	1620115	Protein transfer for western blotting
ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera	Hamamatsu	C13440-20CU	Camera for epifluorescence imaging
P8340 Protease Inhibitor Cocktail	Sigma	P8340	BDNF buffer modification component
Paraformaldehyde	Merck	104005	Fixative for immunofluorescence assays
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	Neuron maintenance
Poli-D-Lysine	Corning	DLW354210	Cover coating for compartmentalized neurons
Poli-L-Lysine	Millipore	P2363	Cover coating for non-compartmentalized neurons
Poly-Prep Chromatography Column	BioRad	7311550	Chromatography apparatus component
Polyethyleneimine 25K	Polysciences Inc.	PLY-0296	HEK293 transfection
Quantum Dots 655 streptavidin conjugate	Invitrogen	Q10121MP	Monobiotinylated BDNF AviTag label for live and fixed cell experiments
Saponin	Sigma	S4521	Detergent for immunofluorescence assays
Syldgard 184 silicone elastomer base	Poirot	4019862	Microfluidic chamber preparation
TEMED	Sigma	T9281	SDS-PAGE gel preparation
Tris	Winkler	BM-2000	Lysis buffer component
Triton X100	Merck	108603	Cell permeabilization in immunofluorescence and western blot assays
Trypsin-EDTA 0.5%	Gibco	15400-054	HEK293 passaging

References

Huang, E., Reichardt, L. Neurotrophins: Roles in Neuronal Development and Function. Annual Review of Neuroscience. 24, 677-736 (2001).
Skaper, S. D. The neurotrophin family of neurotrophic factors: an overview. Methods in Mollecular Biology. 846, 1-12 (2012).
Gonzalez, A., Moya-Alvarado, G., Gonzalez-Billault, C., Bronfman, F. C. Cellular and molecular mechanism regulating neuronal growth by brain-derived neurotrophic factor. Cytoskeleton. 73 (10), 612-628 (2016).
Cunha, C., Brambilla, R., Thomas, K. A simple role for BDNF in learning and memory. Frontiers in Mollecular Neuroscience. 3, 1 (2010).
Bronfman, F. C., Lazo, O. M., Flores, C., Escudero, C. A., Lewin, G., Carter, B. Spatiotemporal intracelular dynamics of neurotrophin and its receptors. Implications for neurotrophin signaling and neuronal function. Neurotrophic Factor. Handbook of Experimental Pharmacology. 220, (2014).
Ascano, M., Bodmer, D., Kuruvilla, R. Endocytic trafficking of neurotrophins in neural development. Trends in Cell Biology. 22 (5), 266-273 (2012).
Deinhardt, K., Salinas, S., Verastegui, C., Watson, R., Worth, D., Hanrahan, S., Bucci, C., Schiavo, G. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52 (2), 293 (2006).
Escudero, C. A., et al. c-Jun N-terminal kinase (JNK)-dependent internalization and Rab5-dependent endocytic sorting medaited long-distance retrograde neuronal death induced by axonal BDNF-p75 signaling. Scientific Reports. 9, 6070 (2019).
Vrabec, J. P., Levin, L. A. The neurobiology of cell death in glaucoma. Eye. 21, 11-14 (2007).
Liot, G., Zala, D., Pla, P., Mottet, G., Piel, M., Saudou, F. Mutant huntingtin alters retrograde transport of TrkB receptors in striatal dendrites. Journal of Neuroscience. 33 (15), 6298-6309 (2013).
Zhou, B., Cai, Q., Xie, Y., Sheng, Z. H. Snapin recruits dynein to BDNF-TrkB signaling endosomes for retrograde axonal transport and is essential for dendrite growth of cortical neurons. Cell Reports. 2 (1), 42-51 (2012).
Haubensak, W., Narz, F., Heumann, R., Lessmann, V. BDNF-GFP containing secretory granules are localized in the vicinity of synaptic junctions of cultured cortical neurons. Journal of Cell Science. 111 (11), 1483-1493 (1998).
Adachi, N., et al. Glucocorticoid affects dendritic transport of BDNF-containing vesicles. Scientific Reports. 5, 12684 (2015).
Biocompare: The Buyer's Guide for Life Scientists. Mirus Bio. Cellular Toxicity Caused by Transfection: Why is it important Available from: https://www.biocompare.com/Bench-Tips/121111-Cellular-Toxicity-Caused-by-Transfection-Why-is-it-important/ (2012)
Zhao, L., et al. Mechanism underlying activity-dependent insertion of TrkB into the neuronal surface. Journal of Cell Science. 122 (17), 3123-3136 (2009).
Zhao, X., Zhou, Y., Weissmiller, A., Pearn, M., Mobley, W., Wu, C. Real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled BDNF in primary neurons. Journal of Visualized Experiments. 91, 51899 (2014).
Sung, K., Maloney, M., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of Neuroscience Methods. 200 (2), 121-128 (2011).
Deerinck, T. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
Unsain, N., Nuñez, N., Anastasia, A., Mascó, D. H. Status epilepticus induces a TrkB to p75 neurotrophin receptor switch and increases brain-derived neurotrophic factor interaction with p75 neurotrophon receptor: an initial event in neuronal injury induction. Neuroscience. 154 (3), 978-993 (2008).
Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).
Moya-Alvarado, G., Gonzalez, A., Stuardo, N., Bronfman, F. C. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) regulates Rab5-positive early endosomes in hippocampal neurons to induce dendritic branching. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 493 (2018).
Sasi, M., Vignoli, B., Canossa, M., Blum, R. Neurobiology of local and intercellular BDNF signaling. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 469 (5), 593-610 (2017).
. The Rab5-Rab11 endosomal pathway is required for BDNF-induced CREB transcriptional regulation in neurons Available from: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/844720v1 (2019)
Mowla, , et al. Biosynthesis and post-translational processing of the precursor to brain-derived neurotrophic factor. Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12660-12666 (2001).
Longo, P., Kavran, J., Kim, M. S., Leahy, D. Transient Mammalian Cell Transfection with Polyethyleneimine (PEI). Methods in Enzymology. 529, 227-240 (2013).
Raymond, C., Tom, R., Perret, S., Moussouami, P., L'Abbé, D., St-Laurent, G., Durocher, Y. A simplified polyethyleneimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods. 55 (1), 44-51 (2011).
Dalton, A., Barton, W. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).
Hunter, M., Yuan, P., Vavilala, D., Fox, M. Optimization of protein expression in mammalian cells. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 77 (2019).
Stepanenko, A. A., Heng, H. H. Transient and stable vector transfection: Pitfalls, off-target effects, artifacts. Mutation Research. 773, 91-103 (2017).
Guerzoni, L. P., Nicolas, V., Angelova, A. In vitro modulation of TrkB receptor signaling upon sequential delivery of curcumin-DHA loaded carriers towards promoting neuronal survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
Angelova, A., Angelov, B. Dual and multi-drug delivery nanoparticles towards neuronal survival and synaptic repair. Neural Regeneration Research. 12 (6), 886-889 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

161 BDNF vivo

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: