JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Avi dizisi (BDNFAvi) içeren rekombinant BDNF, HEK293 hücrelerinde uygun maliyetli bir şekilde üretilir ve afinite kromatografisi ile saflaştırılır. BDNFavi daha sonra doğrudan mono-biyotinylated enzim BirA ile bir tüp içinde. BDNFavi ve mono-biyotinylated BDNFavi ticari olarak kullanılabilir BDNF ile karşılaştırıldığında kendi biyolojik aktivitelerini korumak.

Özet

Avi dizisi (BDNFAvi) içeren rekombinant BDNF HEK293 hücrelerinde üretilir ve daha sonra afinite kromatografisi ile uygun maliyetli bir şekilde saflaştırılır. Bir tüpte BirA enzimi ile Doğrudan mono-biyotinylate BDNFAvi için tekrarlanabilir bir protokol geliştirilmiştir. Bu reaksiyonda, mono-biyotinylated BDNFAvi biyolojik aktivitesini korur.

Nörotrofinler nöronal gelişim ve bakımda rol oynayan hedef kaynaklı büyüme faktörleridir. Onlar farklı nöronal bölmeleri arasında uzun mesafe sinyal izin vermek için endositik yol boyunca hızlı taşıma mekanizmaları gerektirir. Nörotrofin lerin ticaretini incelemek için moleküler araçların geliştirilmesi, in vivo kayıt kullanarak hücredeki bu proteinlerin kesin olarak izlenmesini sağlamıştır. Bu protokolde, mono-biyotinylated BDNF üretimi için optimize edilmiş ve uygun maliyetli bir prosedür geliştirdik. Biyotentojen avi dizisi (BDNFAvi) içeren bir rekombinant BDNF varyantı mikrogram aralığındaki HEK293 hücrelerinde üretilir ve daha sonra afinite kromatografisi kullanılarak kolayca ölçeklenebilir bir işlemle saflaştırılır. Saflaştırılmış BDNF daha sonra homojen bir tüp içinde enzim BirA ile doğrudan in vitro reaksiyon ile mono-biyotinylated olabilir. Mono-biyotinylated BDNF biyolojik aktivitesi (mbtBDNF) farklı floroforlara streptavidin-konjuge konjuge olabilir. BDNFAvi ve mbtBDNF, sırasıyla batı blotunu kullanarak aşağı fosforile hedeflerin tespiti ve transkripsiyon faktörü CREB'nin aktivasyonu yoluyla gösterdikleri biyolojik aktivitelerini korumaktadırlar. Streptavidin-kuantum noktalarını kullanarak, fosfo-CREB spesifik antikor ile tespit edilen CREB aktivasyonu ile birlikte mbtBDNF içselleştirmeyi görselleştirebildik. Buna ek olarak, kontrtavidin-kuantum noktalarına konjuge mbtBDNF mikroakışkan odalarda yetişen kortikal nöronlarda retrograd taşıma analizi için uygundu. Bu nedenle, tüp üretilen mbtBDNF fizyolojik sinyal endozom dinamikleri ve nöronlarda ticareti incelemek için güvenilir bir araçtır.

Giriş

Nöronlar sinaptik iletişim sağlayan karmaşık ve özel morfolojisahip sinir sisteminin fonksiyonel birimleri, ve böylece, çeşitli uyaranlara yanıt olarak koordine ve karmaşık davranış nesil. Dendritler ve aksonlar gibi nöronal projeksiyonlar nöronal iletişimde yer alan kritik yapısal özelliklerdir ve nörotrofinler morfolojilerini ve fonksiyonlarını belirlemede önemli oyunculardır1. Nörotrofinler NGF, NT-3, NT-4 ve beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF)2dahil salgılanan büyüme faktörleri bir ailedir. Merkezi sinir sisteminde (CNS), BDNF nörotransmisyon, dendritik arborization, dendritik dikenlerin olgunlaşması, uzun vadeli potentiation, diğerleri arasında 3 dahil olmak üzere çeşitli biyolojik süreçlere katılır3,4. Bu nedenle, BDNF nöronal fonksiyonudüzenleyen kritik bir rol oynar.

Farklı hücresel süreçler BDNF dinamiklerini ve işlevini düzenler. Nöronal yüzeyde, BDNF tropomiyozin reseptörü kiazaz B (TrkB) ve / veya p75 nörotrofin reseptörü (p75) bağlanır. BDNF-TrkB ve BDNF-p75 kompleksleri endositonve farklı endositik organeller5,6,6,7,8sıralanır. Farklı nöronal devrelerde uygun BDNF sinyalizasyonu için BDNF/TrkB kompleksinin doğru hücre içi ticareti9,10,11'dir. Bu nedenle, BDNF kaçakçılık dinamiklerinin ve patofizyolojik süreçlerde bulunan değişikliklerin derinlemesine anlaşılması, sağlık ve hastalıkta BDNF sinyalinin anlaşılması esastır. Bu süreci izlemek için yeni ve özel moleküler araçların geliştirilmesi bu alanın ilerlemesine yardımcı olacak ve ilgili düzenleyici mekanizmaların daha iyi kavranmasını sağlayacaktır.

Nöronlarda BDNF ticareti çalışmaları için çeşitli araçlar mevcuttur. Yaygın olarak kullanılan bir metodoloji, yeşil floresan protein (GFP) veya GFP mCherry12monomerikfloresan kırmızı-shifted varyantı gibi floresan molekülleri ile etiketlenmiş rekombinant BDNF transfeksiyon içerir ,13. Ancak, BDNF aşırı ekspresyon önemli bir eksiklik bu nörotrofin bilinen konsantrasyonları teslim olasılığını ortadan kaldırır olmasıdır. Ayrıca, hücresel toksisite neden olabilir, sonuçların yorumlanması gizleme14. Alternatif bir strateji flag-TrkB gibi epitop etiketli TrkB, transfeksiyon olduğunu. Bu metodoloji TrkB içselleştirme dinamiklerinin incelenmesine izin verir15, ama aynı zamanda transfeksiyon içerir, hangi değişmiş TrkB fonksiyonu ve hücresel toksisite neden olabilir. Bu metodolojik engelleri aşmak için, biotin-ligaz enzimi BirA tarafından mono-biyotinylated olabilir bir Avi dizisi (BDNFAvi) içeren NGF ve BDNF rekombinant varyantları geliştirilmiştir16,17. Biyotinylated rekombinant BDNF farklı streptavidin bağlı araçlar, hangi floroforlar dahil birleştiğinde olabilir, boncuklar, algılama için diğerleri arasında paramanyetik nano tanecikleri. Canlı hücre görüntüleme açısından, kuantum nokta (QD) sık kullanılan floroforlar haline gelmiştir, onlar tek parçacık izleme için arzu özellikleri var gibi, küçük molekül floroforlar ile karşılaştırıldığında artan parlaklık ve fotobeyazrlama direnci gibi18.

Mono-biyotinylated BDNF üretimi (mbtBDNF) BDNFAvi kullanarak plazmidlerin co-transfection BDNFAvi ve BirA ifade sürüş elde edilmiştir, affinet kromatografi si ile rekombinant protein saflaştırma takip 20 mL başına BDNF 20 mL HEK293-koşullu kültür medya17. Burada, manipülasyon kolaylığı için kromatografi sütununa dayalı bir protokolde protein iyileşmesini en üst düzeye çıkarmayı amaçlayan 500 mL HEK293 şartlı ortamdan BDNFAvi arınmasını sağlayan bu protokolün bir modifikasyonunu öneriyoruz. Kullanılan transfeksiyon maddesi olan polietilenin (PEI), transfeksiyon veriminden ödün vermeden uygun maliyetli bir yöntem sağlar. Mono-biyotinylasyon adımı, ko-transfeksiyonlarla ilişkili komplikasyonları önlemek ve BDNF'nin homojen etiketlemesini sağlamak için in vitro reaksiyona uyarlanmıştır. MbtBDNF'nin biyolojik aktivitesi batı leke ve floresan mikroskopi deneyleri ile gösterilmiştir, pCREB aktivasyonu ve canlı hücre görüntülemesi de dahil olmak üzere mikroakışkan odalarda BDNF'nin retrograd aksonal naklini incelemek için. Bu protokolün kullanımı homojen mono-biyotinylated ve biyolojik olarak aktif BDNF optimize, yüksek verimli üretim sağlar.

Protokol

Tüm deneyler CONICYT (Şili Ulusal Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Komisyonu) onaylı yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada kullanılan protokoller Papalık Üniversitesi Biyogüvenlik ve Biyoetik ve Hayvan Refahı Komiteleri tarafından onaylanmıştır. Omurgalılarla ilgili deneyler Papalık Universidad Católica de Chile Biyoetik ve Hayvan Refahı Komitesi tarafından onaylandı.

NOT: Aşağıdaki protokol, BDNFAvi'yi HEK293 hücrelerinde üretilen toplam 500 mL klimalı ortam hacminden arındırmak için tasarlanmıştır. BDNFAvi'yi arındırmak için üretilen ve işlenen şartlı ortam miktarı gerektiği gibi yukarı veya küçültülmüş olabilir. Ancak, bu koşullar altında daha fazla optimizasyon gerekebilir. Protokol boyunca kullanılan kültür ortamı ve arabelleklerin bileşimi ek malzemelerde bulunabilir.

1. HeK293 şartlı ortamdan BDNFAvi üretimi ve saflaştırılması

  1. HEK293 hücrelerinin transfeksiyonu
    1. 37 ºC'de 15 cm kültür yemeklerinde HEK293 hücrelerini %70 oranında büyütün (%10 sığır fetal serumu, 1x glutamat takviyesi, 1x antibiyotik/antimikotik).
    2. Ortamı transfection arabelleği olarak değiştirin.
    3. Transfeksiyon için PEI-DNA karışımını hazırlayın. DNA ve PEI 25 K'yi seyreltmek için iki farklı 15 mL konik tüp kullanın. Bir tüpte 500°L'lik son hacimde 20 μg plazmid DNA seyreltin. Diğer tüpte 500 μL'lik son hacimde 60 μg lineer PEI 25K seyreltin. 5 dakika oda sıcaklığında kuluçka.
    4. DNA çözeltisini PEI tüpüne dikkatlice pipetleyerek yukarı-aşağı hareketederek bir kez karıştırın. 25 dakika oda sıcaklığında kuluçka.
    5. Her 15 cm çanak boyunca PEI-DNA karışımının 1 mL'sini damlatın. 37 ºC'de 3 saat pei-DNA karışımı ile hücreleri kuluçkaya yatırın.
    6. Ortamı taze kuluçka tamponuna çevirin.
  2. Medya toplama ve depolama
    1. HEK293 hücrelerinin transfeksiyonundan sonra tüm tabaklardan 48 saat ortatoplayın. Ek Dosya 1'in "supernatant modifikasyon tamponu" bölümünde açıklanan çözümlerin konsantre stoklarını hazırlayın ve listelenen son konsantrasyonları elde etmek için HEK293 supernatant'a ekleyin.
      NOT: Hücreler daha fazla analiz için atılabilir veya kurtarılabilir.
    2. 15 dakika buz içinde orta kuluçka.
    3. Aliquot santrifüj tüpler içine orta.
    4. 4 °C'lik bir santrifüjde 45 dakika boyunca 10.000 x g'de ortayı santrifüj edin. Bu adım, medyada asılı hücre enkaz ve ölü hücrelerin ortadan kaldırılmasına olanak sağlar.
    5. Supernatants toplamak,% 0.1 son konsantrasyonda BSA ekleyin. ve daha sonra -20 °C'de saklayabilirsiniz. Medya arınma adımı sırasında daha hızlı erime için donma önce aliquoted olabilir.
      NOT: 2 aya kadar dondurulmuş klimalı ortamların depolama süreleri olumlu sonuçlar vermiş, daha uzun depolama süreleri değerlendirilmemiştir.
  3. Ortam konsantrasyonu ve arınma
    1. 37 °C'lik bir termodere banyoda ortamı eritin.
    2. Aliquot medya santrifüj tüpler içine.
    3. 4 °C'lik soğutulmuş santrifüjde 3.500 x g'de 1 saat ortayı santrifüj edin. Bu adım, kromatografi sütunu ile yeterli akışı sağlamak için kalan hücre enkaz ortadan kaldırılmasısağlar.
    4. Ortamı 500 mL'den 100 mL'ye düşürmek için protein konsantratörlerini 10 kDa kesme ile kullanın. Optimum konsantrasyon için üreticinin önerilen santrifüj parametrelerini uygulayın.
    5. Konsantre ortama 500 μL Ni-NTA agarose boncuk ekleyin ve bir rocker 4 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
    6. Kromatografi cihazlarını birleştirin ve içine ortam dökün. 5 dakika dinlendirin ve sonra orta akmasını sağlamak için 2 yönlü stopcock açın.
    7. Boncukları 5 dk boyunca 5 mL yıkama tamponu ile yıkayın. 2 yönlü stopcock açarak yıkama tampon drenaj. 3 kez tekrarlayın.
    8. Sütuna 1 mL elüsasyon arabelleği ekleyin. Sütundaki boncukları askıya aldığından emin olun. 15 dakika kuluçka, ve sonra bir eluate toplamak 1.5 mL mikrosantrifüj tüp. BDNFAvi tam elution için bu adımı 3 kez tekrarlayın.
    9. %15 poliakrilamid jelde her bir eluat ve farklı konsantrasyonlarda ticari olarak kullanılabilen BDNF'yi (40-160 ng) yükleyin. Bir anti-BDNF antikor kullanarak batı lekeleme tarafından saflaştırılmış protein tespit edin.
    10. Ticari olarak kullanılabilir BDNF ile hazırlanan konsantrasyon eğrisini kullanarak her eluate saflaştırılmış BDNFAvi konsantrasyonu belirleyin.
    11. Aliquot ve -80 °C saflaştırılmış BDNFAvi saklayın.

2. BirA enzimi kullanılarak BDNFAvi in vitro mono-biyotinylation

  1. In vitro mono-biyotinylation reaksiyonu
    1. Biyotinylasyon tampon reaktiflerinin konsantre stok çözeltilerini hazırlayın. Konsantre stokların kullanımı rekombinant proteinseyreltilmesini en aza indirecektir.
    2. BDNFAvi 800 ng bir aliquot alın ve BDNF ile 1:1 molar ilişki içinde biyotinylation tampon reaktifler ve enzim BirA ekleyin. Örneğin, 200 μL son reaksiyon hacmi eklemek için; 100 μL bdNFAvi, 20 μL Bicine 0.5 M pH 8.3, 20 μL ATP 100 mM, 20 μL MgOAc 100 mM, 20 μL d-biotin 500 μM, 0.8-1 μg ila 1 μL BirA-GST ile 200 μL su içeren çözelti ultra saf su ile tamamlanmıştır.
      NOT: Başarılı biyotinylasyon reaksiyonları 400 μL'lik aliquots ile yaklaşık 30 ng / μL BDNFAvi konsantrasyonu içeren, homojen bir biyotinylated BDNFAvi son reaksiyonda ~ 20 ng / μL nihai konsantrasyon ile sonuçlanan yapılmıştır.
    3. Karışımı 30 °C'de bir melezleme fırınında 1 saat kuluçkaya yatırın.
    4. Adım 2.1.2'deki gibi ATP ve BirA'nın aynı hacmini ekleyin ve adım 2.1.3'ü tekrarlayın.
    5. Gelecekteki analizler için -80 °C'de saklayın veya hemen kullanım için buzda tutun (örn. biyotinylation kalite kontrolü).
  2. Biyotinylation analizi
    1. Blok 30 μL streptavidin manyetik boncuklar BDNF örnek başına 1 mL engelleme tampon. Bir mikrosantrifüj tüp rotator 1 saat oda sıcaklığında kuluçka.
    2. Manyetik boncukları manyetik ayırma rafını kullanarak 3 ila 5 dakika veya arabellek boncuklardan tamamen temizlenmiş görünene kadar çökün ve engelleme tamponunu atın.
    3. Boncuklara 50 μL taze engelleme tamponu ve 80 ng mono-biyotinylated BDNFAvi (mbtBDNF) numunesi ekleyerek borular ile tamamen askıya alın.
    4. Yaklaşık 20 RPM'de dönen mikrosantrifüj tüp rotator'da 4 °C'de 1 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
    5. 3 ila 5 dakika için manyetik ayırma rafkullanarak boncuk toplamak ve analiz için 30 μL aliquot tutarak, supernatant toplamak.
    6. Boncukları 500 μL PBS ile bir kez yıkayın ve manyetik ayırma rafını kullanarak 3-5 dakika toplayın. Supernatant'ı kurtarın ve analiz için 30 μL aliquot tutun.
    7. Boncuklara 10 μL yükleme tamponu ekleyin.
    8. MbtBDNF'yi ertelemek için numuneleri 7 dk için 97 °C'ye ısıtın.
    9. MbtBDNF'yi anti-BDNF spesifik antikor kullanarak tespit edin19.

3. mbtBDNF biyolojik aktivitenin doğrulanması

  1. PTrkB ve pERK'nin batı lekeile saptanması.
    1. Tohum 2 milyon sıçan kortikal nöronlar 60 mm kültür yemekleri.
    2. Kültür 7 gün (DIV7) için nöronlar. Daha sonra, deneye başlarken ortayı takviyesiz nörobazal mediun'a çevirin.
    3. Orta değişimden bir saat sonra mbtBDNF'yi 50 ng/mL'lik son konsantrasyona ekleyin. 37 ºC'de 30 dk kuluçka. Negatif kontrol çanak (BDNF ile uyarılmış olmayan) ve pozitif kontrol çanak (ticari olarak kullanılabilir BDNF 50 ng / mL ile tedavi) tutun.
    4. Orta toplamak ve yavaşça 1x PBS ile her çanak yıkayın. 1x PBS'yi toplayın ve atın.
    5. Yemekleri buzüzerine yerleştirin ve her çanağa 50-80 μL lysis tamponu ekleyin. Hücreleri lyse için bir hücre kazıyıcı kullanın.
      NOT: Protein defosforilasyonunu ve bozulmasını önlemek için lysis adımı mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır. 1-2 dakika dinç kazıma batı lekeleme ile ilgi proteinleri görselleştirmek için yeterlidir.
    6. Lysis tampon toplayın ve 5 s için en yüksek hızda bir girdap karıştırıcı karıştırın.
    7. 10 dk. için 14.000 x g (4 °C) lysis tampon santrifüj.
    8. BCA protein niceleme protokolü20ile süpernatant protein içeriğini ölçmek .
    9. Her koşulda 30-50 μg protein içeren bir aliquot yükleme tampon ekleyin ve batı lekeleme için% 12 poliakrilamid jel yükleyin. BDNFAvi biyolojik aktivitesini doğrulamak için spesifik fosfo-antikorlar kullanarak pTrkB ve pERK'yi saplayın.
  2. PCREB immünoresans ile BDNF-QD biyolojik aktivitesinin doğrulanması.
    1. Tohum 40.000 sıçan kortikal nöronlar 10 mm kapakları, daha önce otoklav ve poli-L-lizin ile tedavi daha önce açıklandığı gibi21.
    2. Kültür nöronal bakım tampon 7-8 gün boyunca nöronlar (ek malzemelere bakın) 37 ºC.
    3. Deneye başlamak için, orta yı tamamlanmamış nörobazal ortama çevirin ve 37 ºC'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
    4. MbtBDNF'ye (BDNF-QD) bir mbtBDNF aliquot ekleyerek, kuantum nokta streptavidin konjuge (streptavidin-QD) gerekli hacmini ekleyerek 1:1 BDNF-QD molar oranına ulaşmak için mbtBDNF'yi hazırlayın. Daha sonra, nörobazal orta ile 20 μL seyreltin. Boruyu ışıktan korumak için alüminyum folyoya sarın.
      NOT: Kuantum nokta streptavidin aynı hacimde başka bir tüp hazırlamak conjugate ve negatif kontrol olarak nörobazal orta ile 20 μL seyreltin.
    5. MbtBDNF/ streptavidin-QD karışımını oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir rocker'da kuluçkaya yatırın.
    6. BDNF-QD'yi nörobazal ortamda istenilen son konsantrasyona (200 pM ve 2 nM) seyreltin.
    7. Takviyesi olmayan nörobazal ortam ile kuluçka 1 saat sonra, BDNF-QD veya streptavidin-QD (kontrol) ile nöronları uyarmak 200 pM ve 2 nM BDNF son konsantrasyonu için 37 °C 30 dakika.
    8. Kapakları 1x PBS (37 °C) ile 3 kez yıkayın ve coverslip'i fosfataz inhibitörleri içeren %4 paraformaldehit çözeltisi ile tedavi ederek hücreleri 15 dakika boyunca düzeltin.
    9. Hücreleri PBS ile 3 kez yıkayın ve daha sonra bloke/permeabilizasyon tamponu (BSA %5, Triton X-100 %0.5, 1x fosfataz inhibitörü) ile 1 saat kuluçkaya yatırın.
    10. 4 °C'de anti-pCREB antikor 1:500 (%3 BSA, %0,1 Triton X-100) ile tüplü tüp.
    11. Ertesi gün, 1x PBS ile 3 kez yıkayın ve ikincil antikor 1:500 (%3 BSA, % 0.1 Triton X-100) ile 1 saat kuluçka.
    12. 1x PBS ile 3 kez yıkayın. 7 dakika boyunca Hoechst nükleer leke çözeltisi (5 μg/mL) ekleyin.
    13. 1x PBS ve montaj ile 3 kez yıkayın.
  3. Canlı nöronlarda BDNF-QD retrograd aksonal taşımanın görselleştirilmesi
    1. Daha önce açıklandığı gibi mikroakışkan odaları ve tohum nöronlar hazırlayın16.
    2. Kültürde 7-8 gün sonra, takviyesi olmayan nörobazal orta orta orta değiştirin.
    3. MbtBDNF'ye (BDNF-QD) bir mbtBDNF aliquot ekleyerek, kuantum nokta streptavidin konjuge (streptavidin-QD) gerekli hacmini ekleyerek 1:1 BDNF-QD molar oranına ulaşmak için mbtBDNF'yi hazırlayın. Daha sonra, nörobazal orta ile 20 μL seyreltin. Boruyu ışıktan korumak için alüminyum folyoya sarın.
      NOT: Kuantum nokta streptavidin aynı hacimde başka bir tüp hazırlamak conjugate ve bir kontrol olarak nörobazal orta ile 20 μL seyreltin.
    4. MbtBDNF/ streptavidin-QD karışımını oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir rocker'da kuluçkaya yatırın.
    5. BDNF-QD'yi istenilen son konsantrasyona (2 nM) seyreltin.
    6. Takviyesi olmayan nörobazal ortam ile kuluçka 1 saat sonra Mikroakışkan odaaksonal bölmeleri BDNF-QD veya kontrol karışımı ekleyin. BDNF-QD'nin net retrograd taşınmasını sağlamak için 37 °C'de 210 dk kuluçka.
    7. Canlı hücre görüntülemesi için, hücre vücut bölmesi için proksimal olan mikroolukların segmentinde aksonal retrograd taşımayı bu amaca uygun bir mikroskop kullanarak 100x nesnel kullanarak görselleştirin (37 °C ve %5 CO2). 1 kare/s az görüntü elde edin.

Sonuçlar

Kromatografik sütun tabanlı bir protokolün kullanılması, önemli hacimlerde HEK293 koşullu ortamın işlenmesine olanak tanır. Şekil1'de, 500 mL koşullu ortamdan BDNFAvi arınma sonuçları gösterilmiştir. Ni-NTA agarose boncuklardan BDNFAvi ardışık elutions BDNFAvi konsantrasyonları azalan verim (Şekil 1A). Art arda dört elutions sonra (her kalıcı 15 dk), Boncuklar tarafından yakalanan BDNF çoğunluğu kurtarılır. Eluatların konsantrasyo...

Tartışmalar

Bu makalede, sung veişbirlikçilerininçalışmalarına dayalı olarak mbtBDNF'nin bir yakınlık kromatografisi tabanlı prosedüründe üretimi ve arınması için optimize edilmiş bir metodoloji tanımlanmıştır. Optimizasyonlar, lipofektamin gibi daha pahalı transfeksiyon yöntemlerinin verimliliğini korurken uygun maliyetli bir transfeksiyon reaktifi (PEI) kullanımını içerir. Bu optimizasyon, yüksek maliyet etkinliğini korurken ölçeklenebilirlik sağlayan protokolde önemli bir ...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Yazarlar fondecyt (1171137) (FCB), Bazal Center of Excellence in Science and Technology (AFB 170005) (FCB), Millenium-Nucleus (P07/011-F) (FCB), Wellcome Trust Senior Investigator Award (107116/Z/15/Z) (GS) ve İngiltere Araştırma Enstitüsü (GS) tarafından mali destek kabul eder. Bu çalışma Unidad de Microscopía Avanzada UC (UMA UC) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
2 way stopcockBioRad7328102Chromatography apparatus component
2-mercaptoethanolSigmaM6250BDNF elution buffer
Acrylamide/BisacrylamideBioRad1610154SDS-PAGE gel preparation
Amicon Ultra-15 10KMilliporeUFC901024BDNF concentration
Ammonium PersulfateSigmaA9164SDS-PAGE gel preparation
anti B-III-Tubulin antibodySigmaT8578Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti BDNF antibodyAlomoneAGP-021Western blot assays for BDNF quantification
anti BDNF antibodyAlomoneANT-010Western blot assays for BDNF quantification
Anti ERK antibodyCell Signaling9102Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pCREB antibody (S133)Cell Signaling9198Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pERK antibody (T202, Y204)Cell Signaling4370Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pTrkB antibody (Y515)Abcamab109684Western blot assays for BDNF biological activity detection
Antibiotic/AntimycoticGibco15240-062HEK293 maintenance
ATPSigmaA26209BDNF monobiotinylation buffer
B-27 SupplementGibco17504-044Neuron maintenance
BicineSigmaB3876BDNF monobiotinylation buffer
BirA-GSTBPS Bioscience70031Enzyme for BDNF AviTag monobiotinylation
Bovine Fetal SerumHyCloneHC.SH30396.02HEK293 maintenance
Bovine Serum AlbuminJackson ImmunoResearch001-000-162BDNF buffer modification component, blocking buffer for western blot and immunofluorescence
D-BiotinSigmaB4639BDNF monobiotinylation buffer
DMEM High Glucose MediumGibco11965-092Neuron seeding
DMEM MediumGibco11995-081HEK293 maintenance
Econo Column FunnelBioRad7310003Chromatography apparatus component
EDTAMerck108418
EZ-ECL KitBiological Industries1633664Protein detection by western blotting
GlutamaxGibco35050-061Neuron and HEK293 maintenance
GlycerolMerck104094BDNF elution buffer, lysis buffer for western blot assays
Hettich Rotina 46R CentrifugeHettichDiscontinuedCentrifuge used for clearing the medium of debris
Hettich Universal 32R CentrifugeHettichDiscontinuedCentrifuge used for protein concentrator centrifugation
Horse SerumGibco16050-122Neuron seeding
ImageQuant LAS 500GE Healthcare Life Sciences29005063Western blot image acquisition
ImidazoleSigmaI55513BDNF buffer modification component
KClWinklerBM-1370PBS component
KH2PO4Merck104873PBS component
LamininInvitrogen23017-015Cover coating for compartmentalized neurons
Luer Tubing AdaptorBioRad7323245Chromatography apparatus component
Luminata™ Forte Western HRP SubstrateMilliporeWBLUF0100Protein detection by western blotting
Mg(CH3COO)2Merck105819BDNF monobiotinylation buffer
Mowiol 4-88Calbiochem475904Mounting reagent for immunofluorescence assays
MyOne C1 Streptavidin Magnetic BeadsInvitrogen65001Biotinylation verification
Na2HPO4Merck106586BDNF buffer modification component
NaClWinklerBM-1630PBS component, BDNF buffer modification component
NaH2PO4Merck106346BDNF buffer modification component
Neurobasal MediumGibco21103-049Neuron maintenance
Ni-NTA Agarose BeadsQiagen30210BDNF AviTag purification
Nikon Ti2-ENikonMicroscope for fluorescence imaging
Nitrocellulose MembraneBioRad1620115Protein transfer for western blotting
ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS cameraHamamatsuC13440-20CUCamera for epifluorescence imaging
P8340 Protease Inhibitor CocktailSigmaP8340BDNF buffer modification component
ParaformaldehydeMerck104005Fixative for immunofluorescence assays
Penicillin/StreptomycinGibco15140-122Neuron maintenance
Poli-D-LysineCorningDLW354210Cover coating for compartmentalized neurons
Poli-L-LysineMilliporeP2363Cover coating for non-compartmentalized neurons
Poly-Prep Chromatography ColumnBioRad7311550Chromatography apparatus component
Polyethyleneimine 25KPolysciences Inc.PLY-0296HEK293 transfection
Quantum Dots 655 streptavidin conjugateInvitrogenQ10121MPMonobiotinylated BDNF AviTag label for live and fixed cell experiments
SaponinSigmaS4521Detergent for immunofluorescence assays
Syldgard 184 silicone elastomer basePoirot4019862Microfluidic chamber preparation
TEMEDSigmaT9281SDS-PAGE gel preparation
TrisWinklerBM-2000Lysis buffer component
Triton X100Merck108603Cell permeabilization in immunofluorescence and western blot assays
Trypsin-EDTA 0.5%Gibco15400-054HEK293 passaging

Referanslar

  1. Huang, E., Reichardt, L. Neurotrophins: Roles in Neuronal Development and Function. Annual Review of Neuroscience. 24, 677-736 (2001).
  2. Skaper, S. D. The neurotrophin family of neurotrophic factors: an overview. Methods in Mollecular Biology. 846, 1-12 (2012).
  3. Gonzalez, A., Moya-Alvarado, G., Gonzalez-Billault, C., Bronfman, F. C. Cellular and molecular mechanism regulating neuronal growth by brain-derived neurotrophic factor. Cytoskeleton. 73 (10), 612-628 (2016).
  4. Cunha, C., Brambilla, R., Thomas, K. A simple role for BDNF in learning and memory. Frontiers in Mollecular Neuroscience. 3, 1 (2010).
  5. Bronfman, F. C., Lazo, O. M., Flores, C., Escudero, C. A., Lewin, G., Carter, B. Spatiotemporal intracelular dynamics of neurotrophin and its receptors. Implications for neurotrophin signaling and neuronal function. Neurotrophic Factor. Handbook of Experimental Pharmacology. 220, (2014).
  6. Ascano, M., Bodmer, D., Kuruvilla, R. Endocytic trafficking of neurotrophins in neural development. Trends in Cell Biology. 22 (5), 266-273 (2012).
  7. Deinhardt, K., Salinas, S., Verastegui, C., Watson, R., Worth, D., Hanrahan, S., Bucci, C., Schiavo, G. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52 (2), 293 (2006).
  8. Escudero, C. A., et al. c-Jun N-terminal kinase (JNK)-dependent internalization and Rab5-dependent endocytic sorting medaited long-distance retrograde neuronal death induced by axonal BDNF-p75 signaling. Scientific Reports. 9, 6070 (2019).
  9. Vrabec, J. P., Levin, L. A. The neurobiology of cell death in glaucoma. Eye. 21, 11-14 (2007).
  10. Liot, G., Zala, D., Pla, P., Mottet, G., Piel, M., Saudou, F. Mutant huntingtin alters retrograde transport of TrkB receptors in striatal dendrites. Journal of Neuroscience. 33 (15), 6298-6309 (2013).
  11. Zhou, B., Cai, Q., Xie, Y., Sheng, Z. H. Snapin recruits dynein to BDNF-TrkB signaling endosomes for retrograde axonal transport and is essential for dendrite growth of cortical neurons. Cell Reports. 2 (1), 42-51 (2012).
  12. Haubensak, W., Narz, F., Heumann, R., Lessmann, V. BDNF-GFP containing secretory granules are localized in the vicinity of synaptic junctions of cultured cortical neurons. Journal of Cell Science. 111 (11), 1483-1493 (1998).
  13. Adachi, N., et al. Glucocorticoid affects dendritic transport of BDNF-containing vesicles. Scientific Reports. 5, 12684 (2015).
  14. Biocompare: The Buyer's Guide for Life Scientists. Mirus Bio. Cellular Toxicity Caused by Transfection: Why is it important Available from: https://www.biocompare.com/Bench-Tips/121111-Cellular-Toxicity-Caused-by-Transfection-Why-is-it-important/ (2012)
  15. Zhao, L., et al. Mechanism underlying activity-dependent insertion of TrkB into the neuronal surface. Journal of Cell Science. 122 (17), 3123-3136 (2009).
  16. Zhao, X., Zhou, Y., Weissmiller, A., Pearn, M., Mobley, W., Wu, C. Real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled BDNF in primary neurons. Journal of Visualized Experiments. 91, 51899 (2014).
  17. Sung, K., Maloney, M., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of Neuroscience Methods. 200 (2), 121-128 (2011).
  18. Deerinck, T. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
  19. Unsain, N., Nuñez, N., Anastasia, A., Mascó, D. H. Status epilepticus induces a TrkB to p75 neurotrophin receptor switch and increases brain-derived neurotrophic factor interaction with p75 neurotrophon receptor: an initial event in neuronal injury induction. Neuroscience. 154 (3), 978-993 (2008).
  20. Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).
  21. Moya-Alvarado, G., Gonzalez, A., Stuardo, N., Bronfman, F. C. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) regulates Rab5-positive early endosomes in hippocampal neurons to induce dendritic branching. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 493 (2018).
  22. Sasi, M., Vignoli, B., Canossa, M., Blum, R. Neurobiology of local and intercellular BDNF signaling. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 469 (5), 593-610 (2017).
  23. . The Rab5-Rab11 endosomal pathway is required for BDNF-induced CREB transcriptional regulation in neurons Available from: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/844720v1 (2019)
  24. Mowla, , et al. Biosynthesis and post-translational processing of the precursor to brain-derived neurotrophic factor. Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12660-12666 (2001).
  25. Longo, P., Kavran, J., Kim, M. S., Leahy, D. Transient Mammalian Cell Transfection with Polyethyleneimine (PEI). Methods in Enzymology. 529, 227-240 (2013).
  26. Raymond, C., Tom, R., Perret, S., Moussouami, P., L'Abbé, D., St-Laurent, G., Durocher, Y. A simplified polyethyleneimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods. 55 (1), 44-51 (2011).
  27. Dalton, A., Barton, W. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).
  28. Hunter, M., Yuan, P., Vavilala, D., Fox, M. Optimization of protein expression in mammalian cells. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 77 (2019).
  29. Stepanenko, A. A., Heng, H. H. Transient and stable vector transfection: Pitfalls, off-target effects, artifacts. Mutation Research. 773, 91-103 (2017).
  30. Guerzoni, L. P., Nicolas, V., Angelova, A. In vitro modulation of TrkB receptor signaling upon sequential delivery of curcumin-DHA loaded carriers towards promoting neuronal survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
  31. Angelova, A., Angelov, B. Dual and multi-drug delivery nanoparticles towards neuronal survival and synaptic repair. Neural Regeneration Research. 12 (6), 886-889 (2017).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 161BDNFmono biyotinylasyonquatum noktaaksonal ticaretiprotein ar nmasendoskopik dinamiklerin vivo izleme

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır