JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Рекомбинантный BDNF, содержащий последовательность Ави (BDNFAvi), производится в клетках HEK293 экономически эффективным образом и очищается с помощью хроматографии сродства. BDNFavi после этого сразу mono-biotinylated с энзимом BirA в пробке. BDNFavi и моно-биотинилированные BDNFavi сохраняют свою биологическую активность по сравнению с коммерчески доступным BDNF.

Аннотация

Рекомбинантный BDNF, содержащий последовательность Ави (BDNFAvi), производится в клетках HEK293, а затем экономически эффективно очищается с помощью хроматографии сродства. Воспроизводимый протокол был разработан непосредственно для непосредственно моно-биотинилата BDNFAvi с ферментом BirA в трубке. В этой реакции моно-биотинилированный БДФФАВИ сохраняет свою биологическую активность.

Нейротрофины являются целевыми факторами роста, играющими роль в развитии и поддержании нейронов. Они требуют быстрых транспортных механизмов вдоль эндоцитного пути, чтобы позволить междугородной сигнализации между различными нейронными отсеками. Разработка молекулярных инструментов для изучения оборота нейротрофинов позволила точно отслеживать эти белки в клетке с помощью записи in vivo. В этом протоколе мы разработали оптимизированную и экономически эффективную процедуру производства моно-биотинилированного БДФ. Рекомбинантный вариант BDNF, содержащий биотинилизируемую последовательность ави (BDNFAvi), производится в клетках HEK293 в диапазоне микрограммов, а затем очищается в легко масштабируемой процедуре с помощью хроматографии сродства. Очищенный BDNF может быть однородно моно-биотинилирован прямой реакцией в пробирке с ферментом BirA в трубке. Биологическая активность моно-биотинилированных БДНФ (mbtBDNF) может быть сопряжена с стрептавидин-конъюгирована с различными фторфорами. BDNFAvi и mbtBDNF сохраняют свою биологическую активность, продемонстрированную путем обнаружения фосфорилированных целей ниже по течению с использованием западной помарки и активации транскрипцио-фактора CREB, соответственно. Используя стрептавидин-квантовые точки, мы смогли визуализировать интернализации mbtBDNF, сопутствующей активации CREB, которая была обнаружена с помощью фонофо-КРИБ специфического антитела. Кроме того, mbtBDNF, сопряженный со стрептавидин-квантовыми точками, подходит для ретроградного транспортного анализа в корковых нейронах, выращенных в микрофлюидных камерах. Таким образом, в трубке производится mbtBDNF является надежным инструментом для изучения физиологических сигнальных эндосомной динамики и оборота в нейронах.

Введение

Нейроны являются функциональными единицами нервной системы, обладающими сложной и специализированной морфологией, которая позволяет синаптической коммуникации, и, таким образом, генерации скоординированного и сложного поведения в ответ на различные раздражители. Нейронные проекции, такие как дендриты и аксоны являются критическими структурными особенностями, участвующими в нейрональной коммуникации, и нейротрофины являются ключевыми игроками в определении их морфологии и функции1. Нейротрофины являются семейство выделяется факторов роста, которые включают NGF, NT-3, NT-4, и мозг полученных нейротрофический фактор (BDNF)2. В центральной нервной системе (ЦНС) БДНТ участвует в различных биологических процессах, включая нейротрансмиссию, дендритную арборизацию, созревание дендритных шипов, долгосрочную потенцию, среди прочих3,4. Таким образом, BDNF играет важную роль в регулировании нейронных функций.

Разнообразные клеточные процессы регулируют динамику и функцию BDNF. На нейрональной поверхности, BDNF связывает тропомиозин рецептор киназы B (TrkB) и / или рецептора нейротрофина p75 (p75). Комплексы BDNF-TrkB и BDNF-p75 до конца сортируются и сортируются в различных эндоцитных органеллах5,,6,,7,,8. Правильный внутриклеточный оборот комплекса BDNF/TrkB необходим для правильной сигнализации BDNF в различных нейрональных схемах9,,10,,11. По этой причине для понимания BDNF сигнализации в области здоровья и болезней необходимо глубокое понимание динамики оборота БДНФ и ее изменений, обнаруженных в патофизиологических процессах. Разработка новых и конкретных молекулярных инструментов для мониторинга этого процесса поможет продвинуть вперед эту область и позволит лучше понять соответствующие механизмы регулирования.

Есть несколько инструментов, доступных для изучения BDNF торговли нейронами. Широко используемая методология включает в себя трансфекцию рекомбинантного BDNF, помеченного флуоресцентнымимолекулами,такими как зеленый флуоресцентный белок (GFP) или мономерный флуоресцентный красно-сдвинутый вариант GFP mCherry12,13. Однако основным недостатком переэкспрессии BDNF является то, что он исключает возможность доставки известных концентраций этого нейротрофина. Кроме того, это может привести к клеточной токсичности, заслоняя интерпретацию результатов14. Альтернативной стратегией является трансфекция TrkB с эпитопом, например Flag-TrkB. Эта методология позволяет изучать динамику интернализации TrkB15,но она также включает в себя трансфекцию, которая может привести к изменению функции TrkB и клеточной токсичности. Для преодоления этих методологических препятствий были разработаны рекомбинантные варианты NGF и BDNF, содержащие последовательность Ави (BDNFAvi), которые могут быть моно-биотинилированные биотин-лигазным ферментом BirA, были разработаны16,17. Биотиниолетированные рекомбинантные BDNF могут быть соединены с различными стрептавидин-связанных инструментов, которые включают фторфоры, бусы, парамагнитные наночастицы среди других для обнаружения. С точки зрения изображения живых клеток, квантовые точки (ЗД) стали часто использоваться фторфоры, так как они имеют желательные характеристики для одночастичего отслеживания, такие как повышенная яркость и устойчивость к фотоотмоблы по сравнению с небольшой молекулы фторфоров18.

Производство моно-биотинилированных BDNF (mbtBDNF) с использованием BDNFAvi было достигнуто путем котрансляции плазмидов, движущих выражение BDNFAvi и BirA, а затем очистка рекомбинантного белка сродством хроматографии с выходом 1-2 г BDNF на 20 мл HEK293-кондиционированных культурных носителей17. Здесь мы предлагаем модификацию этого протокола, которая позволяет для очистки BDNFAvi от 500 мЛ HEK293-кондиционированных средств массовой информации, которая стремится к максимальному восстановлению белка в хроматографии-колонке протокол для простоты манипуляции. Используемый трансфекционный агент, полиэтиленимин (PEI), обеспечивает экономичный метод без ущерба для трансфекционного выхода. Моно-биотинилирование шаг был адаптирован к реакции in vitro, чтобы избежать осложнений, связанных с со-трансфекции и обеспечить однородную маркировку BDNF. Биологическая активность mbtBDNF была продемонстрирована западными экспериментами по микро- и флуоресценции, включая активацию pCREB и изображения живых клеток для изучения ретроградного аксонального переноса БДНФ в микрофлюидных камерах. Использование этого протокола позволяет оптимизировать, высокодоходное производство однородного моно biotinylated и биологически активных BDNF.

протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с утвержденными руководящими принципами КОНИКИТ (Чилийская национальная комиссия по научно-техническим исследованиям). Протоколы, используемые в данном исследовании, были одобрены Комитетами по биобезопасности и биоэтике и защите животных Папского университета Католики де Чили. Эксперименты с участием позвоночных были одобрены Комитетом по биоэтике и защите животных Папского университета Католики де Чили.

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол был разработан для очистки BDNFAvi от общего объема 500 мЛ обусловленного носителя, произведенного в клетках HEK293. Количество обусловленной среды, которая производится и обрабатывается для очистки BDNFAvi может быть вверх или вниз по мере необходимости. Однако в этих условиях может потребоваться дальнейшая оптимизация. Состав культурных носителей и буферов, используемых на протяжении всего протокола, можно найти в дополнительных материалах.

1. Производство и очистка BDNFAvi от HEK293-условией средств массовой информации

  1. Трансфекция клеток HEK293
    1. Выращивайте клетки HEK293 до 70% сливаются в дополненной среде DMEM (10% сыворотки плода крупного рогатого скота, 1x добавка глутамата, 1x антибиотик/антимикотический) в 15 см культуры блюда при 37 oC.
    2. Измените средний на трансфекционный буфер.
    3. Подготовка смеси PEI-ДНА для трансфекции. Используйте две различные конические трубки 15 мЛ, чтобы разбавить ДНК и PEI 25 K, соответственно. Разбавить 20 мкг плазмидной ДНК в окончательном объеме 500 мл в одной трубке. Разбавить 60 мкг линейного PEI 25K в окончательном объеме 500 мл в другой трубе. Инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин.
    4. Тщательно пипени ДНК раствор в трубку PEI, смешивая один раз вверх-вниз движения. Инкубировать при комнатной температуре в течение 25 мин.
    5. Протешить 1 мЛ смеси PEI-ДНА на каждом 15-сантиметровом блюде. Инкубировать клетки смесью PEI-ДНА на 3 ч при 37 oC.
    6. Измените средний и свежий инкубационный буфер.
  2. Сбор и хранение мультимедиа
    1. Соберите носитель из всех блюд 48 ч после трансфекции клеток HEK293. Подготовьте концентрированные запасы решений, описанных в разделе "супернатантный буфер модификации" Дополнительного файла 1, и добавьте их в супернатант HEK293 для достижения перечисленных окончательных концентраций.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут быть отброшены или восстановлены для дальнейшего анализа.
    2. Инкубировать среду во льду в течение 15 мин.
    3. Aliquot среды в центрифуги труб.
    4. Центрифуга средний на 10000 х г в течение 45 мин в центрифуге 4 градусов по Цельсию. Этот шаг позволяет устранить клеточный мусор и мертвые клетки, взвешенные в средствах массовой информации.
    5. Соберите супернатанты, добавьте BSA с окончательной концентрацией 0,1%. а затем хранить при -20 градусов по Цельсию. Средства массовой информации могут быть заготовлены перед замораживанием для более быстрого оттаивания во время шага очищения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время хранения замороженных условных носителей сроком до 2 месяцев дало положительные результаты, более длительное время хранения не было оценено.
  3. Концентрация и очистка средств массовой информации
    1. Оттепель средств массовой информации в 37 кк терморегулируемой ванне.
    2. Aliquot средств массовой информации в центрифуги труб.
    3. Центрифуга средний на 1 ч при 3500 х г в 4 градусов по Цельсию охлажденной центрифуги. Этот шаг позволяет устранить оставшийся клеточный мусор для обеспечения адекватного потока через столбец хроматографии.
    4. Используйте белковые концентраторы с отсечки 10 кДа, чтобы уменьшить количество носителей с 500 мл до 100 мл. Для оптимальной концентрации следуйте рекомендуемым от производителем параметрам центрифугации.
    5. Добавьте 500 мл бисера Ni-NTA agarose в концентрированные носители и инкубировать на ночь при 4 градусах в рокере.
    6. Соберите хроматографию аппарата и залить средства массовой информации в него. Пусть он отдыхает в течение 5 минут, а затем открыть 2-путь stopcock, чтобы средний поток через.
    7. Вымойте бисер с 5 мл буфера мытья в течение 5 мин. Убедитесь в том, чтобы восстановить бисер в колонке. Слейте буфер мыть, открыв 2-путь stopcock. Повторите 3 раза.
    8. Добавьте 1 мл буфера elution к столбцу. Убедитесь в том, чтобы восстановить бисер в колонке. Инкубировать в течение 15 мин, а затем собрать элуат в 1,5 мл микроцентрифуги трубки. Повторите этот шаг 3 раза для полного elution BDNFAvi.
    9. Нагрузка 5 МЛ каждого элуата и различных концентраций коммерчески доступных BDNF (40-160 нг) в 15% полиакриламид гель. Обнаружить очищенный белок с помощью западного blotting с помощью анти-BDNF антитела.
    10. Определите концентрацию очищенного BDNFAvi в каждом eluate используя кривую концентрации подготовленную с коммерчески имеющимся BDNF.
    11. Aliquot и хранить очищенные BDNFAvi при -80 градусов по Цельсию.

2. Мономотинобрия BDNFAvi с использованием фермента BirA

  1. Реакция моно-биотинилирования в пробирке
    1. Подготовка концентрированных стоковых растворов биотинилирования буферных реагентов. Использование концентрированных запасов позволит свести к минимуму разбавление рекомбинантного белка.
    2. Возьмите aliquot 800 нг BDNFAvi и добавьте биотинилирование буферных реагентов и фермента BirA в 1:1 моляр отношение к BDNF. Например, для добавления объема окончательной реакции на 200 МЛ; 100 МЛ раствора, содержащего 800 нг BDNFAvi, 20 мл бицина 0,5 М рН 8,3, 20 мл АТР 100 мМ, 20 мл MgOAc 100 мМ, 20 мл д-биотина 500 мкМ, 0,8-1 мкг к 1 мл BirA-GST, а также до 200 мл с ультрапурной водой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Успешные реакции биотинилирования были выполнены с aliquots 400 qL, содержащих концентрацию около 30 нг / L BDNFAvi, в результате чего однородно биотинилированных BDNFAvi к окончательной концентрации 20 нг / ЗЛ в окончательной реакции.
    3. Инкубировать смесь при температуре 30 градусов в духовке гибридизации на 1 ч. Смешайте содержимое с помощью инверсии трубки каждые 15 мин.
    4. Добавьте тот же объем ATP и BirA, что и в шаге 2.1.2 и повторите шаг 2.1.3.
    5. Хранить при -80 градусов по Цельсию для будущих анализов или держать на льду для немедленного использования (например, биотиниляция контроля качества).
  2. Анализ биотинилирования
    1. Блок 30 МЛ стрептавидин магнитных бусин на образец BDNF в 1 мл блокирующего буфера. Инкубировать при комнатной температуре в течение 1 ч в ротаторе трубки микроцентрифуги.
    2. Осаждать магнитные бусы с помощью магнитного разделения стойки в течение 3 до 5 минут или до тех пор, пока буфер появляется полностью очищен от бисера и отбросить блокирующий буфер.
    3. Добавьте 50 МЛ свежего блокирующего буфера и 80 нг моно-биотинилированного образца BDNFAvi (mbtBDNF) в бисер, убедившись, что полностью их можно восстановить путем пиппетинга.
    4. Инкубировать при 4 градусах по Цельсию в микроцентрифуге ротатор трубки спиннинг примерно 20 об/мин.
    5. Соберите бусы с помощью магнитной стойки разделения в течение 3 до 5 минут, и собрать супернатант, сохраняя 30 l aliquot для анализа.
    6. Вымойте бисер один раз с 500 МЛ PBS, а затем собрать их с помощью магнитного разделения стойки в течение 3 до 5 минут. Восстановите супернатант и сохраните 30-l aliquot для анализа.
    7. Добавьте 10 мл 4-х буфера загрузки в бисер.
    8. Нагрейте образцы до 97 градусов по Цельсию в течение 7 минут, чтобы отвести mbtBDNF.
    9. Обнаружить mbtBDNF с помощью анти-BDNF специфические антитела19.

3. Проверка биологической активности mbtBDNF

  1. Обнаружение pTrkB и pERK по западному помарке.
    1. Семя 2 миллиона крыс корковых нейронов в 60 мм культуры блюда.
    2. Культура нейронов в течение 7 дней (DIV7). Затем, изменить средний на не-дополненный нейробасальный mediun при запуске эксперимента.
    3. Через час после изменения среды добавьте mbtBDNF к окончательной концентрации 50 нг/мл. Инкубировать в течение 30 мин при 37 oC. Держите отрицательный контроль блюдо (не стимулировали с BDNF) и положительный контроль блюдо (обработано с 50 нг / мЛ коммерчески доступны BDNF).
    4. Соберите среднюю и аккуратно мыть каждое блюдо с 1x PBS. Соберите и отбросьте 1x PBS.
    5. Поместите блюда на лед и добавьте 50-80 мл буфера лизиса к каждому блюду. Используйте скребок клеток для лизы клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лизис шаг должен быть выполнен как можно быстрее, чтобы избежать дефосфорилирования белка и деградации. 1-2 минут энергичного выскабливание достаточно, чтобы визуализировать белки, представляющие интерес для западных blotting.
    6. Соберите буфер лизиса и перемешайте в вихревом миксере на самой высокой скорости в течение 5 с.
    7. Центрифуга буфера лизиса на 14000 х г (4 градуса по Цельсию) в течение 10 мин. Соберите супернатант.
    8. Количественная оценка содержания белка супернатанта по протоколу количественной оценки белка BCA20.
    9. Добавьте погрузочный буфер в аликоту, содержащий 30-50 мкг белка на состояние, и загрузите его в 12% полиакриламидный гель для западного пятна. Обнаружение pTrkB и pERK с помощью специфических фосфо-антител для проверки биологической активности BDNFAvi.
  2. Проверка биологической активности БДНФ-ЗД с помощью иммунофлуоресценции pCREB.
    1. Семя 40000 крыс корковых нейронов в 10 мм coverslips, ранее autoclaved и лечение поли-L-лизин, как описано ранее21.
    2. Культура нейронов в течение 7-8 дней в буфере поддержания нейронов (см. дополнительные материалы) при 37 oC.
    3. Чтобы начать эксперимент, измените среду на неосуществленную нейробазальную среду и инкубировать при 37 oC на 1 ч.
    4. Подготовьте mbtBDNF сопряжены с квантовыми точками (BDNF-ЗД), добавив к mbtBDNF aliquot, необходимый объем квантовой точки streptavidin конъюгации (стрептавидин-ЗД) для достижения 1:1 BDNF-D молярного соотношения. Затем разбавить до 20 мл нейробазальной средой. Оберните трубку в алюминиевую фольгу, чтобы защитить ее от света.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте еще одну трубку с тем же объемом квантовой точки streptavidin спряжения и разбавить его до 20 мл с нейробазальной среды в качестве отрицательного контроля.
    5. Инкубировать смесь mbtBDNF/streptavidin-ЗД в течение 30 минут при комнатной температуре в рокере.
    6. Разбавить БДФ-ЗД до желаемой конечной концентрации (200 пМ и 2 нМ) в нейробазальной среде.
    7. После 1 ч инкубации с неполированной нейробазальной средой, стимулировать нейроны с BDNF-ЗД или стрептавидин-ЗД (контроль) до конечной концентрации 200 pM и 2 nM BDNF в течение 30 мин при 37 градусов по Цельсию.
    8. Вымойте крышки 3 раза с 1x PBS (37 градусов по Цельсию) и исправить клетки в течение 15 мин, рассматривая крышки с 4% параформальдегида раствор, содержащий ингибиторы фосфатазы.
    9. Вымойте клетки 3 раза с PBS, а затем инкубировать с блокированием / пермеабилизации буфера (BSA 5%, Тритон X-100 0,5%, 1x ингибитор фосфатазы) в течение 1 ч.
    10. Инкубировать анти-pCREB антитела 1:500 (в 3% BSA, 0,1% Тритон X-100) ночь на 4 градуса по Цельсию.
    11. На следующий день мыть 3 раза с 1x PBS, и инкубировать на 1 ч со вторичным антителом 1:500 (3% BSA, 0,1% Тритон X-100).
    12. Вымойте 3 раза с 1x PBS. Добавьте раствор ядерного пятна Hoechst (5 мкг/мл) в течение 7 минут.
    13. Вымойте 3 раза с 1x PBS и смонтировать.
  3. Визуализация ретроградного аксонального переноса БДНФ-ЗД в живых нейронах
    1. Подготовка микрофлюидных камер и семенных нейронов, как описано ранее16.
    2. После 7-8 дней в культуре, изменить среднюю на неполную нейробазальную среду.
    3. Подготовьте mbtBDNF сопряжены с квантовыми точками (BDNF-ЗД), добавив к mbtBDNF aliquot, необходимый объем квантовой точки streptavidin конъюгации (стрептавидин-ЗД) для достижения 1:1 BDNF-D молярного соотношения. Затем разбавить до 20 мл нейробазальной средой. Оберните трубку в алюминиевую фольгу, чтобы защитить ее от света.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте еще одну трубку с тем же объемом квантовой точки streptavidin сопряжения и разбавить его до 20 мл с нейробасальной среды в качестве контроля.
    4. Инкубировать смесь mbtBDNF/streptavidin-ЗД в течение 30 минут при комнатной температуре в рокере.
    5. Разбавить BDNF-ЗД до желаемой конечной концентрации (2 nM).
    6. После 1 ч инкубации с неполированной нейробазальной средой добавляем BDNF-ЗД или контрольную смесь в аксональные отсеки микрофлюидной камеры. Инкубировать в течение 210 мин при 37 градусов по Цельсию, чтобы обеспечить чистый ретроградный транспорт BDNF-ЗД.
    7. Для изображения живых клеток, визуализировать аксональный ретроградный транспорт в сегменте микрогрововы, который проксимальный к отсеку тела клетки с помощью 100x цели с помощью микроскопа подходит для этих целей (37 градусов по Цельсию и 5% CO2). Приобретайте изображения по 1 рамке/с.

Результаты

Использование протокола на основе хроматографической колонки позволяет обрабатывать значительные объемы кондиционированных носителей HEK293. На рисунке 1показаны результаты очистки БДНФАВИ от 500 мЛ условных носителей. Последовательные elutions BDNFAvi из бусы Ni-NTA агарозы дают...

Обсуждение

В этой статье описана оптимизированная методология производства и очистки mbtBDNF в процедуре на основе хроматографии сродства, основанной на работе Сунга и сотрудников17. Оптимизация включает в себя использование экономически эффективного трансфекционного реагента (PEI) при...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы с благодарностью признают финансовую поддержку fondecyt (1171137) (FCB), Базального центра передового опыта в области науки и техники (AFB 170005) (FCB), Millenium-Nucleus (P 07/011-F) (FCB), Премия старшего следователя Wellcome Trust (107116//15/з) (GS) и премия Фонда Фонда Британского института деменции (GS). Эта работа была поддержана Unidad де Микроскопия Аванзада UC (УМА UC).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
2 way stopcockBioRad7328102Chromatography apparatus component
2-mercaptoethanolSigmaM6250BDNF elution buffer
Acrylamide/BisacrylamideBioRad1610154SDS-PAGE gel preparation
Amicon Ultra-15 10KMilliporeUFC901024BDNF concentration
Ammonium PersulfateSigmaA9164SDS-PAGE gel preparation
anti B-III-Tubulin antibodySigmaT8578Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti BDNF antibodyAlomoneAGP-021Western blot assays for BDNF quantification
anti BDNF antibodyAlomoneANT-010Western blot assays for BDNF quantification
Anti ERK antibodyCell Signaling9102Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pCREB antibody (S133)Cell Signaling9198Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pERK antibody (T202, Y204)Cell Signaling4370Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pTrkB antibody (Y515)Abcamab109684Western blot assays for BDNF biological activity detection
Antibiotic/AntimycoticGibco15240-062HEK293 maintenance
ATPSigmaA26209BDNF monobiotinylation buffer
B-27 SupplementGibco17504-044Neuron maintenance
BicineSigmaB3876BDNF monobiotinylation buffer
BirA-GSTBPS Bioscience70031Enzyme for BDNF AviTag monobiotinylation
Bovine Fetal SerumHyCloneHC.SH30396.02HEK293 maintenance
Bovine Serum AlbuminJackson ImmunoResearch001-000-162BDNF buffer modification component, blocking buffer for western blot and immunofluorescence
D-BiotinSigmaB4639BDNF monobiotinylation buffer
DMEM High Glucose MediumGibco11965-092Neuron seeding
DMEM MediumGibco11995-081HEK293 maintenance
Econo Column FunnelBioRad7310003Chromatography apparatus component
EDTAMerck108418
EZ-ECL KitBiological Industries1633664Protein detection by western blotting
GlutamaxGibco35050-061Neuron and HEK293 maintenance
GlycerolMerck104094BDNF elution buffer, lysis buffer for western blot assays
Hettich Rotina 46R CentrifugeHettichDiscontinuedCentrifuge used for clearing the medium of debris
Hettich Universal 32R CentrifugeHettichDiscontinuedCentrifuge used for protein concentrator centrifugation
Horse SerumGibco16050-122Neuron seeding
ImageQuant LAS 500GE Healthcare Life Sciences29005063Western blot image acquisition
ImidazoleSigmaI55513BDNF buffer modification component
KClWinklerBM-1370PBS component
KH2PO4Merck104873PBS component
LamininInvitrogen23017-015Cover coating for compartmentalized neurons
Luer Tubing AdaptorBioRad7323245Chromatography apparatus component
Luminata™ Forte Western HRP SubstrateMilliporeWBLUF0100Protein detection by western blotting
Mg(CH3COO)2Merck105819BDNF monobiotinylation buffer
Mowiol 4-88Calbiochem475904Mounting reagent for immunofluorescence assays
MyOne C1 Streptavidin Magnetic BeadsInvitrogen65001Biotinylation verification
Na2HPO4Merck106586BDNF buffer modification component
NaClWinklerBM-1630PBS component, BDNF buffer modification component
NaH2PO4Merck106346BDNF buffer modification component
Neurobasal MediumGibco21103-049Neuron maintenance
Ni-NTA Agarose BeadsQiagen30210BDNF AviTag purification
Nikon Ti2-ENikonMicroscope for fluorescence imaging
Nitrocellulose MembraneBioRad1620115Protein transfer for western blotting
ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS cameraHamamatsuC13440-20CUCamera for epifluorescence imaging
P8340 Protease Inhibitor CocktailSigmaP8340BDNF buffer modification component
ParaformaldehydeMerck104005Fixative for immunofluorescence assays
Penicillin/StreptomycinGibco15140-122Neuron maintenance
Poli-D-LysineCorningDLW354210Cover coating for compartmentalized neurons
Poli-L-LysineMilliporeP2363Cover coating for non-compartmentalized neurons
Poly-Prep Chromatography ColumnBioRad7311550Chromatography apparatus component
Polyethyleneimine 25KPolysciences Inc.PLY-0296HEK293 transfection
Quantum Dots 655 streptavidin conjugateInvitrogenQ10121MPMonobiotinylated BDNF AviTag label for live and fixed cell experiments
SaponinSigmaS4521Detergent for immunofluorescence assays
Syldgard 184 silicone elastomer basePoirot4019862Microfluidic chamber preparation
TEMEDSigmaT9281SDS-PAGE gel preparation
TrisWinklerBM-2000Lysis buffer component
Triton X100Merck108603Cell permeabilization in immunofluorescence and western blot assays
Trypsin-EDTA 0.5%Gibco15400-054HEK293 passaging

Ссылки

  1. Huang, E., Reichardt, L. Neurotrophins: Roles in Neuronal Development and Function. Annual Review of Neuroscience. 24, 677-736 (2001).
  2. Skaper, S. D. The neurotrophin family of neurotrophic factors: an overview. Methods in Mollecular Biology. 846, 1-12 (2012).
  3. Gonzalez, A., Moya-Alvarado, G., Gonzalez-Billault, C., Bronfman, F. C. Cellular and molecular mechanism regulating neuronal growth by brain-derived neurotrophic factor. Cytoskeleton. 73 (10), 612-628 (2016).
  4. Cunha, C., Brambilla, R., Thomas, K. A simple role for BDNF in learning and memory. Frontiers in Mollecular Neuroscience. 3, 1 (2010).
  5. Bronfman, F. C., Lazo, O. M., Flores, C., Escudero, C. A., Lewin, G., Carter, B. Spatiotemporal intracelular dynamics of neurotrophin and its receptors. Implications for neurotrophin signaling and neuronal function. Neurotrophic Factor. Handbook of Experimental Pharmacology. 220, (2014).
  6. Ascano, M., Bodmer, D., Kuruvilla, R. Endocytic trafficking of neurotrophins in neural development. Trends in Cell Biology. 22 (5), 266-273 (2012).
  7. Deinhardt, K., Salinas, S., Verastegui, C., Watson, R., Worth, D., Hanrahan, S., Bucci, C., Schiavo, G. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52 (2), 293 (2006).
  8. Escudero, C. A., et al. c-Jun N-terminal kinase (JNK)-dependent internalization and Rab5-dependent endocytic sorting medaited long-distance retrograde neuronal death induced by axonal BDNF-p75 signaling. Scientific Reports. 9, 6070 (2019).
  9. Vrabec, J. P., Levin, L. A. The neurobiology of cell death in glaucoma. Eye. 21, 11-14 (2007).
  10. Liot, G., Zala, D., Pla, P., Mottet, G., Piel, M., Saudou, F. Mutant huntingtin alters retrograde transport of TrkB receptors in striatal dendrites. Journal of Neuroscience. 33 (15), 6298-6309 (2013).
  11. Zhou, B., Cai, Q., Xie, Y., Sheng, Z. H. Snapin recruits dynein to BDNF-TrkB signaling endosomes for retrograde axonal transport and is essential for dendrite growth of cortical neurons. Cell Reports. 2 (1), 42-51 (2012).
  12. Haubensak, W., Narz, F., Heumann, R., Lessmann, V. BDNF-GFP containing secretory granules are localized in the vicinity of synaptic junctions of cultured cortical neurons. Journal of Cell Science. 111 (11), 1483-1493 (1998).
  13. Adachi, N., et al. Glucocorticoid affects dendritic transport of BDNF-containing vesicles. Scientific Reports. 5, 12684 (2015).
  14. Biocompare: The Buyer's Guide for Life Scientists. Mirus Bio. Cellular Toxicity Caused by Transfection: Why is it important Available from: https://www.biocompare.com/Bench-Tips/121111-Cellular-Toxicity-Caused-by-Transfection-Why-is-it-important/ (2012)
  15. Zhao, L., et al. Mechanism underlying activity-dependent insertion of TrkB into the neuronal surface. Journal of Cell Science. 122 (17), 3123-3136 (2009).
  16. Zhao, X., Zhou, Y., Weissmiller, A., Pearn, M., Mobley, W., Wu, C. Real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled BDNF in primary neurons. Journal of Visualized Experiments. 91, 51899 (2014).
  17. Sung, K., Maloney, M., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of Neuroscience Methods. 200 (2), 121-128 (2011).
  18. Deerinck, T. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
  19. Unsain, N., Nuñez, N., Anastasia, A., Mascó, D. H. Status epilepticus induces a TrkB to p75 neurotrophin receptor switch and increases brain-derived neurotrophic factor interaction with p75 neurotrophon receptor: an initial event in neuronal injury induction. Neuroscience. 154 (3), 978-993 (2008).
  20. Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).
  21. Moya-Alvarado, G., Gonzalez, A., Stuardo, N., Bronfman, F. C. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) regulates Rab5-positive early endosomes in hippocampal neurons to induce dendritic branching. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 493 (2018).
  22. Sasi, M., Vignoli, B., Canossa, M., Blum, R. Neurobiology of local and intercellular BDNF signaling. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 469 (5), 593-610 (2017).
  23. . The Rab5-Rab11 endosomal pathway is required for BDNF-induced CREB transcriptional regulation in neurons Available from: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/844720v1 (2019)
  24. Mowla, , et al. Biosynthesis and post-translational processing of the precursor to brain-derived neurotrophic factor. Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12660-12666 (2001).
  25. Longo, P., Kavran, J., Kim, M. S., Leahy, D. Transient Mammalian Cell Transfection with Polyethyleneimine (PEI). Methods in Enzymology. 529, 227-240 (2013).
  26. Raymond, C., Tom, R., Perret, S., Moussouami, P., L'Abbé, D., St-Laurent, G., Durocher, Y. A simplified polyethyleneimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods. 55 (1), 44-51 (2011).
  27. Dalton, A., Barton, W. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).
  28. Hunter, M., Yuan, P., Vavilala, D., Fox, M. Optimization of protein expression in mammalian cells. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 77 (2019).
  29. Stepanenko, A. A., Heng, H. H. Transient and stable vector transfection: Pitfalls, off-target effects, artifacts. Mutation Research. 773, 91-103 (2017).
  30. Guerzoni, L. P., Nicolas, V., Angelova, A. In vitro modulation of TrkB receptor signaling upon sequential delivery of curcumin-DHA loaded carriers towards promoting neuronal survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
  31. Angelova, A., Angelov, B. Dual and multi-drug delivery nanoparticles towards neuronal survival and synaptic repair. Neural Regeneration Research. 12 (6), 886-889 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

161in vivo

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены