Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
Рекомбинантный BDNF, содержащий последовательность Ави (BDNFAvi), производится в клетках HEK293 экономически эффективным образом и очищается с помощью хроматографии сродства. BDNFavi после этого сразу mono-biotinylated с энзимом BirA в пробке. BDNFavi и моно-биотинилированные BDNFavi сохраняют свою биологическую активность по сравнению с коммерчески доступным BDNF.
Рекомбинантный BDNF, содержащий последовательность Ави (BDNFAvi), производится в клетках HEK293, а затем экономически эффективно очищается с помощью хроматографии сродства. Воспроизводимый протокол был разработан непосредственно для непосредственно моно-биотинилата BDNFAvi с ферментом BirA в трубке. В этой реакции моно-биотинилированный БДФФАВИ сохраняет свою биологическую активность.
Нейротрофины являются целевыми факторами роста, играющими роль в развитии и поддержании нейронов. Они требуют быстрых транспортных механизмов вдоль эндоцитного пути, чтобы позволить междугородной сигнализации между различными нейронными отсеками. Разработка молекулярных инструментов для изучения оборота нейротрофинов позволила точно отслеживать эти белки в клетке с помощью записи in vivo. В этом протоколе мы разработали оптимизированную и экономически эффективную процедуру производства моно-биотинилированного БДФ. Рекомбинантный вариант BDNF, содержащий биотинилизируемую последовательность ави (BDNFAvi), производится в клетках HEK293 в диапазоне микрограммов, а затем очищается в легко масштабируемой процедуре с помощью хроматографии сродства. Очищенный BDNF может быть однородно моно-биотинилирован прямой реакцией в пробирке с ферментом BirA в трубке. Биологическая активность моно-биотинилированных БДНФ (mbtBDNF) может быть сопряжена с стрептавидин-конъюгирована с различными фторфорами. BDNFAvi и mbtBDNF сохраняют свою биологическую активность, продемонстрированную путем обнаружения фосфорилированных целей ниже по течению с использованием западной помарки и активации транскрипцио-фактора CREB, соответственно. Используя стрептавидин-квантовые точки, мы смогли визуализировать интернализации mbtBDNF, сопутствующей активации CREB, которая была обнаружена с помощью фонофо-КРИБ специфического антитела. Кроме того, mbtBDNF, сопряженный со стрептавидин-квантовыми точками, подходит для ретроградного транспортного анализа в корковых нейронах, выращенных в микрофлюидных камерах. Таким образом, в трубке производится mbtBDNF является надежным инструментом для изучения физиологических сигнальных эндосомной динамики и оборота в нейронах.
Нейроны являются функциональными единицами нервной системы, обладающими сложной и специализированной морфологией, которая позволяет синаптической коммуникации, и, таким образом, генерации скоординированного и сложного поведения в ответ на различные раздражители. Нейронные проекции, такие как дендриты и аксоны являются критическими структурными особенностями, участвующими в нейрональной коммуникации, и нейротрофины являются ключевыми игроками в определении их морфологии и функции1. Нейротрофины являются семейство выделяется факторов роста, которые включают NGF, NT-3, NT-4, и мозг полученных нейротрофический фактор (BDNF)2. В центральной нервной системе (ЦНС) БДНТ участвует в различных биологических процессах, включая нейротрансмиссию, дендритную арборизацию, созревание дендритных шипов, долгосрочную потенцию, среди прочих3,4. Таким образом, BDNF играет важную роль в регулировании нейронных функций.
Разнообразные клеточные процессы регулируют динамику и функцию BDNF. На нейрональной поверхности, BDNF связывает тропомиозин рецептор киназы B (TrkB) и / или рецептора нейротрофина p75 (p75). Комплексы BDNF-TrkB и BDNF-p75 до конца сортируются и сортируются в различных эндоцитных органеллах5,,6,,7,,8. Правильный внутриклеточный оборот комплекса BDNF/TrkB необходим для правильной сигнализации BDNF в различных нейрональных схемах9,,10,,11. По этой причине для понимания BDNF сигнализации в области здоровья и болезней необходимо глубокое понимание динамики оборота БДНФ и ее изменений, обнаруженных в патофизиологических процессах. Разработка новых и конкретных молекулярных инструментов для мониторинга этого процесса поможет продвинуть вперед эту область и позволит лучше понять соответствующие механизмы регулирования.
Есть несколько инструментов, доступных для изучения BDNF торговли нейронами. Широко используемая методология включает в себя трансфекцию рекомбинантного BDNF, помеченного флуоресцентнымимолекулами,такими как зеленый флуоресцентный белок (GFP) или мономерный флуоресцентный красно-сдвинутый вариант GFP mCherry12,13. Однако основным недостатком переэкспрессии BDNF является то, что он исключает возможность доставки известных концентраций этого нейротрофина. Кроме того, это может привести к клеточной токсичности, заслоняя интерпретацию результатов14. Альтернативной стратегией является трансфекция TrkB с эпитопом, например Flag-TrkB. Эта методология позволяет изучать динамику интернализации TrkB15,но она также включает в себя трансфекцию, которая может привести к изменению функции TrkB и клеточной токсичности. Для преодоления этих методологических препятствий были разработаны рекомбинантные варианты NGF и BDNF, содержащие последовательность Ави (BDNFAvi), которые могут быть моно-биотинилированные биотин-лигазным ферментом BirA, были разработаны16,17. Биотиниолетированные рекомбинантные BDNF могут быть соединены с различными стрептавидин-связанных инструментов, которые включают фторфоры, бусы, парамагнитные наночастицы среди других для обнаружения. С точки зрения изображения живых клеток, квантовые точки (ЗД) стали часто использоваться фторфоры, так как они имеют желательные характеристики для одночастичего отслеживания, такие как повышенная яркость и устойчивость к фотоотмоблы по сравнению с небольшой молекулы фторфоров18.
Производство моно-биотинилированных BDNF (mbtBDNF) с использованием BDNFAvi было достигнуто путем котрансляции плазмидов, движущих выражение BDNFAvi и BirA, а затем очистка рекомбинантного белка сродством хроматографии с выходом 1-2 г BDNF на 20 мл HEK293-кондиционированных культурных носителей17. Здесь мы предлагаем модификацию этого протокола, которая позволяет для очистки BDNFAvi от 500 мЛ HEK293-кондиционированных средств массовой информации, которая стремится к максимальному восстановлению белка в хроматографии-колонке протокол для простоты манипуляции. Используемый трансфекционный агент, полиэтиленимин (PEI), обеспечивает экономичный метод без ущерба для трансфекционного выхода. Моно-биотинилирование шаг был адаптирован к реакции in vitro, чтобы избежать осложнений, связанных с со-трансфекции и обеспечить однородную маркировку BDNF. Биологическая активность mbtBDNF была продемонстрирована западными экспериментами по микро- и флуоресценции, включая активацию pCREB и изображения живых клеток для изучения ретроградного аксонального переноса БДНФ в микрофлюидных камерах. Использование этого протокола позволяет оптимизировать, высокодоходное производство однородного моно biotinylated и биологически активных BDNF.
Все эксперименты проводились в соответствии с утвержденными руководящими принципами КОНИКИТ (Чилийская национальная комиссия по научно-техническим исследованиям). Протоколы, используемые в данном исследовании, были одобрены Комитетами по биобезопасности и биоэтике и защите животных Папского университета Католики де Чили. Эксперименты с участием позвоночных были одобрены Комитетом по биоэтике и защите животных Папского университета Католики де Чили.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол был разработан для очистки BDNFAvi от общего объема 500 мЛ обусловленного носителя, произведенного в клетках HEK293. Количество обусловленной среды, которая производится и обрабатывается для очистки BDNFAvi может быть вверх или вниз по мере необходимости. Однако в этих условиях может потребоваться дальнейшая оптимизация. Состав культурных носителей и буферов, используемых на протяжении всего протокола, можно найти в дополнительных материалах.
1. Производство и очистка BDNFAvi от HEK293-условией средств массовой информации
2. Мономотинобрия BDNFAvi с использованием фермента BirA
3. Проверка биологической активности mbtBDNF
Использование протокола на основе хроматографической колонки позволяет обрабатывать значительные объемы кондиционированных носителей HEK293. На рисунке 1показаны результаты очистки БДНФАВИ от 500 мЛ условных носителей. Последовательные elutions BDNFAvi из бусы Ni-NTA агарозы дают...
В этой статье описана оптимизированная методология производства и очистки mbtBDNF в процедуре на основе хроматографии сродства, основанной на работе Сунга и сотрудников17. Оптимизация включает в себя использование экономически эффективного трансфекционного реагента (PEI) при...
Авторам нечего раскрывать.
Авторы с благодарностью признают финансовую поддержку fondecyt (1171137) (FCB), Базального центра передового опыта в области науки и техники (AFB 170005) (FCB), Millenium-Nucleus (P 07/011-F) (FCB), Премия старшего следователя Wellcome Trust (107116//15/з) (GS) и премия Фонда Фонда Британского института деменции (GS). Эта работа была поддержана Unidad де Микроскопия Аванзада UC (УМА UC).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2 way stopcock | BioRad | 7328102 | Chromatography apparatus component |
2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | BDNF elution buffer |
Acrylamide/Bisacrylamide | BioRad | 1610154 | SDS-PAGE gel preparation |
Amicon Ultra-15 10K | Millipore | UFC901024 | BDNF concentration |
Ammonium Persulfate | Sigma | A9164 | SDS-PAGE gel preparation |
anti B-III-Tubulin antibody | Sigma | T8578 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
anti BDNF antibody | Alomone | AGP-021 | Western blot assays for BDNF quantification |
anti BDNF antibody | Alomone | ANT-010 | Western blot assays for BDNF quantification |
Anti ERK antibody | Cell Signaling | 9102 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
anti pCREB antibody (S133) | Cell Signaling | 9198 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
anti pERK antibody (T202, Y204) | Cell Signaling | 4370 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
anti pTrkB antibody (Y515) | Abcam | ab109684 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-062 | HEK293 maintenance |
ATP | Sigma | A26209 | BDNF monobiotinylation buffer |
B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | Neuron maintenance |
Bicine | Sigma | B3876 | BDNF monobiotinylation buffer |
BirA-GST | BPS Bioscience | 70031 | Enzyme for BDNF AviTag monobiotinylation |
Bovine Fetal Serum | HyClone | HC.SH30396.02 | HEK293 maintenance |
Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | BDNF buffer modification component, blocking buffer for western blot and immunofluorescence |
D-Biotin | Sigma | B4639 | BDNF monobiotinylation buffer |
DMEM High Glucose Medium | Gibco | 11965-092 | Neuron seeding |
DMEM Medium | Gibco | 11995-081 | HEK293 maintenance |
Econo Column Funnel | BioRad | 7310003 | Chromatography apparatus component |
EDTA | Merck | 108418 | |
EZ-ECL Kit | Biological Industries | 1633664 | Protein detection by western blotting |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | Neuron and HEK293 maintenance |
Glycerol | Merck | 104094 | BDNF elution buffer, lysis buffer for western blot assays |
Hettich Rotina 46R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for clearing the medium of debris |
Hettich Universal 32R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for protein concentrator centrifugation |
Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Neuron seeding |
ImageQuant LAS 500 | GE Healthcare Life Sciences | 29005063 | Western blot image acquisition |
Imidazole | Sigma | I55513 | BDNF buffer modification component |
KCl | Winkler | BM-1370 | PBS component |
KH2PO4 | Merck | 104873 | PBS component |
Laminin | Invitrogen | 23017-015 | Cover coating for compartmentalized neurons |
Luer Tubing Adaptor | BioRad | 7323245 | Chromatography apparatus component |
Luminata™ Forte Western HRP Substrate | Millipore | WBLUF0100 | Protein detection by western blotting |
Mg(CH3COO)2 | Merck | 105819 | BDNF monobiotinylation buffer |
Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | Mounting reagent for immunofluorescence assays |
MyOne C1 Streptavidin Magnetic Beads | Invitrogen | 65001 | Biotinylation verification |
Na2HPO4 | Merck | 106586 | BDNF buffer modification component |
NaCl | Winkler | BM-1630 | PBS component, BDNF buffer modification component |
NaH2PO4 | Merck | 106346 | BDNF buffer modification component |
Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Neuron maintenance |
Ni-NTA Agarose Beads | Qiagen | 30210 | BDNF AviTag purification |
Nikon Ti2-E | Nikon | Microscope for fluorescence imaging | |
Nitrocellulose Membrane | BioRad | 1620115 | Protein transfer for western blotting |
ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | Camera for epifluorescence imaging |
P8340 Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | BDNF buffer modification component |
Paraformaldehyde | Merck | 104005 | Fixative for immunofluorescence assays |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Neuron maintenance |
Poli-D-Lysine | Corning | DLW354210 | Cover coating for compartmentalized neurons |
Poli-L-Lysine | Millipore | P2363 | Cover coating for non-compartmentalized neurons |
Poly-Prep Chromatography Column | BioRad | 7311550 | Chromatography apparatus component |
Polyethyleneimine 25K | Polysciences Inc. | PLY-0296 | HEK293 transfection |
Quantum Dots 655 streptavidin conjugate | Invitrogen | Q10121MP | Monobiotinylated BDNF AviTag label for live and fixed cell experiments |
Saponin | Sigma | S4521 | Detergent for immunofluorescence assays |
Syldgard 184 silicone elastomer base | Poirot | 4019862 | Microfluidic chamber preparation |
TEMED | Sigma | T9281 | SDS-PAGE gel preparation |
Tris | Winkler | BM-2000 | Lysis buffer component |
Triton X100 | Merck | 108603 | Cell permeabilization in immunofluorescence and western blot assays |
Trypsin-EDTA 0.5% | Gibco | 15400-054 | HEK293 passaging |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены