Auteurs
Contactez-nous

S'identifier

Un abonnement à JoVE est nécessaire pour voir ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.

Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Le BDNF recombinant contenant une séquence Avi (BDNFAvi) est produit dans les cellules HEK293 d’une manière rentable et est purifié par la chromatographie d’affinité. BDNFavi est alors directement mono-biotinylé avec l’enzyme BirA dans un tube. BDNFavi et BDNFavi mono-biotinylés conservent leur activité biologique par rapport au BDNF disponible dans le commerce.

Résumé

Le BDNF recombinant contenant une séquence Avi (BDNFAvi) est produit dans des cellules HEK293, puis purifié de manière rentable par chromatographie d’affinité. Un protocole reproductible a été développé pour mono-biotinylate directement BDNFAvi avec l’enzyme BirA dans un tube. Dans cette réaction, le BDNFAvi mono-biotinylé conserve son activité biologique.

Les neurotrophines sont des facteurs de croissance dérivés de la cible qui jouent un rôle dans le développement et l’entretien des neurones. Ils nécessitent des mécanismes de transport rapide le long de la voie endocytique pour permettre la signalisation longue distance entre les différents compartiments neuronaux. Le développement d’outils moléculaires pour étudier le trafic de neurotrophines a permis le suivi précis de ces protéines dans la cellule à l’aide de l’enregistrement in vivo. Dans ce protocole, nous avons développé une procédure optimisée et rentable pour la production de BDNF mono-biotinylée. Une variante recombinante de BDNF contenant une séquence d’avi biotinylable (BDNFAvi) est produite dans les cellules HEK293 dans la gamme de microgrammes, puis purifiée dans une procédure facilement évolutive utilisant la chromatographie d’affinité. Le BDNF purifié peut alors être homogènement mono-biotinylé par une réaction in vitro directe avec l’enzyme BirA dans un tube. L’activité biologique du BDNF mono-biotinylé (mbtBDNF) peut être conjuguée à la streptavidine-conjuguée à différents fluorophores. BDNFAvi et mbtBDNF conservent leur activité biologique démontrée par la détection de cibles phosphorylyées en aval à l’aide de la tache occidentale et de l’activation du facteur de transcription CREB, respectivement. En utilisant des points streptavidine-quantiques, nous avons pu visualiser l’internalisation mbtBDNF concomitante à l’activation du CREB, qui a été détecté avec un anticorps spécifique au phospho-CREB. En outre, mbtBDNF conjugué aux points streptavidin-quantum était approprié pour l’analyse rétrograde de transport dans les neurones corticaux cultivés dans les chambres microfluidiques. Ainsi, dans le tube produit mbtBDNF est un outil fiable pour étudier la dynamique de signalisation physiologique endosome et le trafic dans les neurones.

Introduction

Les neurones sont les unités fonctionnelles du système nerveux possédant une morphologie complexe et spécialisée qui permet la communication synaptique, et donc, la génération de comportements coordonnés et complexes en réponse à divers stimuli. Les projections neuronales telles que les dendrites et les axones sont des caractéristiques structurelles essentielles impliquées dans la communication neuronale, et les neurotrophines sont des acteurs essentiels pour déterminer leur morphologie et leur fonction1. Les neurotrophines sont une famille de facteurs de croissance sécrétés qui incluent NGF, NT-3, NT-4, et le facteur neurotrophique cerveau-dérivé (BDNF)2. Dans le système nerveux central (SNC), BDNF participe à divers processus biologiques, y compris la neurotransmission, l’arborisation dendritique, la maturation des épines dendritiques, la potentialisation à long terme, entre autres3,4. Par conséquent, BDNF joue un rôle essentiel dans la régulation de la fonction neuronale.

Divers processus cellulaires régulent la dynamique et la fonction de BDNF. Sur la surface neuronale, le BDNF lie le récepteur de la tropomyosine kinase B (TrkB) et/ou le récepteur de la neurotrophine p75 (p75). Les complexes BDNF-TrkB et BDNF-p75 sont endocytosés et triés dans différentes organites endocytiques5,6,7,8. Le trafic intracellulaire correct du complexe BDNF/TrkB est nécessaire pour la signalisation BDNF appropriée dans différents circuits neuronaux9,10,11. Pour cette raison, une compréhension profonde de la dynamique du trafic BDNF et de ses altérations trouvées dans les processus pathophysiologiques est essentielle pour comprendre la signalisation BDNF dans la santé et la maladie. La mise au point d’outils moléculaires nouveaux et spécifiques pour surveiller ce processus aidera à faire avancer ce domaine et permettra de mieux comprendre les mécanismes de réglementation impliqués.

Il existe plusieurs outils disponibles pour l’étude du trafic BDNF dans les neurones. Une méthodologie couramment utilisée implique la transfection du BDNF recombinant marqué avec des molécules fluorescentes telles que la protéine fluorescente verte (GFP) ou la variante monomérique fluorescente de GFP mCherry12,13. Cependant, une lacune majeure de la surexpression BDNF est qu’elle élimine la possibilité de fournir des concentrations connues de cette neurotrophine. En outre, il peut entraîner la toxicité cellulaire, obscurcissant l’interprétation des résultats14. Une stratégie alternative est la transfection d’un TrkB marqué par épitope, tel que Flag-TrkB. Cette méthodologie permet l’étude de la dynamique d’internalisation TrkB15, mais elle implique également la transfection, qui pourrait entraîner une altération de la fonction TrkB et la toxicité cellulaire. Pour surmonter ces obstacles méthodologiques, des variantes recombinantes de NGF et bdnf contenant une séquence Avi (BDNFAvi), qui peuvent être mono-biotinylées par l’enzyme biotin-ligase BirA, ont été développées16,17. Le BDNF recombinant biotinylé peut être couplé à différents outils liés à la streptavidine, qui comprennent des fluorophores, des perles, des nanoparticules paramagnétiques, entre autres, pour la détection. En termes d’imagerie des cellules vivantes, les points quantiques (QD) sont devenus fréquemment utilisés fluorophores, car ils ont des caractéristiques souhaitables pour le suivi des particules uniques, tels que la luminosité accrue et la résistance au photobleaching par rapport aux fluorophores de petites molécules18.

La production de BDNF mono-biotinylée (mbtBDNF) à l’aide de BDNFAvi a été réalisée par co-transfection de plasmides conduisant à l’expression de BDNFAvi et BirA, suivie par la purification de la protéine recombinante par chromatographie d’affinité avec un rendement de 1-2 μg de BDNF par 20 mL de 20 mL de milieux de culture17HEK293-conditionnés . Ici, nous proposons une modification de ce protocole qui permet la purification BDNFAvi à partir de 500 mL de supports conditionnés HEK293, qui vise à maximiser la récupération des protéines dans un protocole basé sur la chromatographie-colonne pour faciliter la manipulation. L’agent de transfection utilisé, la polyéthylèneimine (Î.-P.-É.), assure une méthode rentable sans sacrifier le rendement de la transfection. L’étape mono-biotinylation a été adaptée à une réaction in vitro afin d’éviter les complications associées aux co-transfections et d’assurer l’étiquetage homogène du BDNF. L’activité biologique du mbtBDNF a été démontrée par des expériences occidentales de microscopie de tache et de fluorescence, y compris l’activation du PCREB et de l’imagerie cellulaire vivante pour étudier le transport axonal rétrograde du BDNF dans les chambres microfluidiques. L’utilisation de ce protocole permet une production optimisée et à haut rendement de BDNF mono-biotinylée homogène et biologiquement active.

Protocole

Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives approuvées par le CONICYT (Commission nationale chilienne pour la recherche scientifique et technologique). Les protocoles utilisés dans cette étude ont été approuvés par les Comités de biosécurité et de bioéthique et de bien-être animal de la Pontificia Universidad Católica de Chile. Des expériences impliquant des vertébrés ont été approuvées par le Comité de bioéthique et de bien-être animal de la Pontificia Universidad Católica de Chile.

REMARQUE : Le protocole suivant a été conçu pour purifier BDNFAvi à partir d’un volume total de 500 mL de milieu conditionné produit dans les cellules HEK293. La quantité de milieu conditionné qui est produite et traitée pour purifier BDNFAvi peut être à la hausse ou à la baisse au besoin. Toutefois, une optimisation supplémentaire peut être nécessaire dans ces circonstances. La composition des supports culturels et des tampons utilisés tout au long du protocole se trouve dans les documents supplémentaires.

1. Production et purification de BDNFAvi à partir de supports conditionnés HEK293

  1. Transfection des cellules HEK293
    1. Développer les cellules HEK293 à 70% confluence dans le milieu complété de DMEM (10% sérum foetal bovin, supplément de glutamate 1x, 1x antibiotique/antimycotique) dans les plats de culture de 15 cm à 37 ºC.
    2. Modifiez la mémoire tampon de protection du milieu à la transfection.
    3. Préparer le mélange PEI-ADN pour la transfection. Utilisez deux tubes coniques différents de 15 mL pour diluer l’ADN et 25 K de l’Île-du-Prince-Édouard, respectivement. Diluer 20 μg d’ADN plasmide dans un volume final de 500 μL dans un tube. Diluer 60 μg de 25 K.-O. linéaire dans un volume final de 500 μL dans l’autre tube. Incuber à température ambiante pendant 5 min.
    4. Pipette soigneusement la solution d’ADN dans le tube de l’Île-du-Prince-Édouard, en mélangeant une fois par mouvement descendant. Incuber à température ambiante pendant 25 min.
    5. Égoutter 1 mL du mélange PEI-ADN dans chaque plat de 15 cm. Incuber les cellules avec le mélange PEI-ADN pendant 3 h à 37 ºC.
    6. Modifiez le tampon d’incubation moyen à frais.
  2. Collecte et stockage multimédia
    1. Recueillir le milieu de tous les plats 48 h après la transfection des cellules HEK293. Préparer les stocks concentrés des solutions décrites dans la section « tampon de modification supernatant » du fichier supplémentaire 1 et les ajouter au supernatant HEK293 pour atteindre les concentrations finales énumérées.
      REMARQUE : Les cellules peuvent être jetées ou récupérées pour une analyse plus approfondie.
    2. Incuber le milieu dans la glace pendant 15 min.
    3. Aliquot le milieu dans des tubes de centrifugeuse.
    4. Centrifuger le milieu à 10 000 x g pendant 45 min dans une centrifugeuse de 4 °C. Cette étape permet l’élimination des débris cellulaires et des cellules mortes suspendues dans les médias.
    5. Recueillir les supernatants, ajouter BSA à une concentration finale de 0,1%. puis conserver à -20 °C. Les supports peuvent être aliquotés avant de geler pour un dégel plus rapide pendant l’étape de purification.
      REMARQUE : Les temps de stockage des supports conditionnés gelés jusqu’à 2 mois ont donné des résultats positifs, des temps de stockage plus longs n’ont pas été évalués.
  3. Concentration et purification des médias
    1. Décongeler le milieu dans un bain thermorégulé à 37 °C.
    2. Aliquot le milieu dans des tubes de centrifugeuse.
    3. Centrifuger le milieu pendant 1 h à 3 500 x g dans une centrifugeuse refroidie à 4 °C. Cette étape permet l’élimination des débris cellulaires restants afin d’assurer un débit adéquat à travers la colonne de chromatographie.
    4. Utilisez les concentrateurs de protéines avec une coupure de 10 kDa pour réduire le milieu de 500 mL à 100 mL. Suivez les paramètres de centrifugation recommandés par le fabricant pour une concentration optimale.
    5. Ajouter 500 μL de perles d’agarose Ni-NTA au milieu concentré et incuber toute la nuit à 4 °C dans un rocker.
    6. Assemblez l’appareil de chromatographie et versez le support dedans. Laissez reposer pendant 5 min, puis ouvrez le robinet d’arrêt à 2 voies pour laisser passer le milieu.
    7. Laver les perles avec 5 mL de tampon de lavage pendant 5 min. Assurez-vous de resuspender les perles dans la colonne. Égoutter le tampon de lavage en ouvrant le robinet à 2 voies. Répéter 3 fois.
    8. Ajoutez 1 mL de tampon d’élution à la colonne. Assurez-vous de résuspender les perles dans la colonne. Incuber pendant 15 min, puis recueillir l’éluate dans un tube de microcentrifuge de 1,5 m L. Répétez cette étape 3 fois pour l’élution complète de BDNFAvi.
    9. Chargez 5 μL de chaque eluate et différentes concentrations de BDNF disponible dans le commerce (40-160 ng) dans un gel polyacrylamide de 15 %. Détecter la protéine purifiée par ballonnement occidental à l’aide d’un anticorps anti-BDNF.
    10. Déterminer la concentration du BDNFAvi purifié dans chaque éluate à l’aide de la courbe de concentration préparée avec le BDNF disponible dans le commerce.
    11. Aliquot et entreposez le BDNFAvi purifié à -80 °C.

2. Mono-biotinylation in vitro de BDNFAvi à l’aide de l’enzyme BirA

  1. Réaction in vitro de mono-biotinylation
    1. Préparer des solutions de stock concentré des réactifs tampons de biotinylation. L’utilisation de stocks concentrés minimisera la dilution de la protéine recombinante.
    2. Prenez un aliquot de 800 ng de BDNFAvi et ajoutez les réactifs tampons de biotinylation et l’enzyme BirA dans une relation molaire 1:1 à BDNF. Par exemple, pour un volume de réaction finale de 200 μL ajouter; 100 μL de solution contenant 800 ng de BDNFAvi, 20 μL Bicine 0,5 M pH 8,3, 20 μL ATP 100 mM, 20 μL MgOAc 100 mM, 20 μL d-biotine 500 μM, 0,8-1 μg à 1 μL de BirA-GST, et complète à 200 μL avec de l’eau ultrapure.
      REMARQUE : Des réactions de biotinylation réussies ont été effectuées avec des aliquots de 400 μL contenant une concentration d’environ 30 ng/ μL BDNFAvi, résultant en un BDNFAvi homogènement biotinylé à une concentration finale d'~20 ng/μL dans la réaction finale.
    3. Incuber le mélange à 30 °C dans un four d’hybridation pendant 1 h. Mélanger le contenu par inversion de tube toutes les 15 minutes.
    4. Ajoutez le même volume d’ATP et de BirA qu’à l’étape 2.1.2 et répétez l’étape 2.1.3.
    5. Conserver à -80 °C pour les analyses futures ou conserver sur la glace pour une utilisation immédiate (p. ex., contrôle de la qualité de la biotinylation).
  2. Analyse de la biotinylation
    1. Bloc 30 μL de perles magnétiques streptavidine par échantillon BDNF dans 1 mL de tampon de blocage. Incuber à température ambiante pendant 1 h dans un rotateur de tube microcentrifuge.
    2. Précipitez les perles magnétiques à l’aide d’un support de séparation magnétique pendant 3 à 5 minutes ou jusqu’à ce que le tampon semble complètement dégagé des perles et jeter le tampon de blocage.
    3. Ajouter 50 μL de tampon de blocage frais et 80 ng d’échantillon bdnfavi mono-biotinylé (mbtBDNF) aux perles, en veillant à les résuspender complètement par tuyauterie.
    4. Incuber à 4 °C pendant 1 h dans un rotateur de tube microcentrifuge tournant à environ 20 tr/min.
    5. Recueillir les perles à l’aide de la grille de séparation magnétique pendant 3 à 5 minutes, et recueillir le supernatant, en gardant un aliquot 30 μL pour analyse.
    6. Laver les perles une fois avec 500 μL de PBS, puis les recueillir à l’aide de la grille de séparation magnétique pendant 3 à 5 minutes. Récupérez le supernatant et conservez un aliquot de 30 μL pour analyse.
    7. Ajouter 10 μL de tampon de chargement 4x aux perles.
    8. Chauffer les échantillons à 97 °C pendant 7 min pour élute le mbtBDNF.
    9. Détecter le mbtBDNF à l’aide d’un anticorps spécifique à l’anti-BDNF19.

3. Vérification de l’activité biologique du mbtBDNF

  1. Détection de pTrkB et pERK par tache occidentale.
    1. Semence 2 millions de neurones corticaux de rat dans des plats de culture de 60 mm.
    2. Culture des neurones pendant 7 jours (DIV7). Ensuite, changez le mediun neurobasal moyen à non-complété lors du démarrage de l’expérience.
    3. Une heure après changement moyen, ajouter le mbtBDNF à une concentration finale de 50 ng/mL. Incuber pendant 30 min à 37 ºC. Gardez un plat de contrôle négatif (non stimulé avec BDNF) et un plat de contrôle positif (traité avec 50 ng/mL de BDNF disponible dans le commerce).
    4. Recueillir le milieu et laver doucement chaque plat avec 1x PBS. Recueillir et jeter le PBS 1x.
    5. Déposer les plats sur de la glace et ajouter 50 à 80 μL de tampon de lyse à chaque plat. Utilisez un grattoir cellulaire pour lyser les cellules.
      REMARQUE : L’étape de lyse doit être effectuée le plus rapidement possible afin d’éviter la déphosphorylation et la dégradation des protéines. 1-2 minutes de grattage vigoureux suffisent à visualiser les protéines d’intérêt par le ballonnement occidental.
    6. Recueillir le tampon de lyse et remuer dans un mélangeur vortex à la vitesse la plus élevée pendant 5 s.
    7. Centrifuger le tampon de lyse à 14 000 x (4 °C) pendant 10 min. Recueillir le supernatant.
    8. Quantifier la teneur en protéines du supernatant par le protocole de quantification des protéines BCA20.
    9. Ajoutez un tampon de chargement à un aliquot contenant 30 à 50 μg de protéines par condition et chargez-le dans un gel polyacrylamide de 12 % pour le blotting occidental. Détecter pTrkB et pERK à l’aide d’anticorps phospho spécifiques pour vérifier l’activité biologique de BDNFAvi.
  2. Vérification de l’activité biologique bdnf-qd par immunofluorescence pCREB.
    1. Graine 40.000 neurones corticaux de rat dans des couvercles de 10 mm, précédemment autoclaved et traité avec la poly-L-lysine comme décrit précédemment21.
    2. Culturez les neurones pendant 7-8 jours dans le tampon d’entretien neuronal (voir matériaux supplémentaires) à 37 ºC.
    3. Pour commencer l’expérience, modifiez le milieu à un milieu neurobasal non approvisionnement et incuber à 37 ºC pendant 1 h.
    4. Préparez mbtBDNF conjugué aux points quantiques (BDNF-QD) en ajoutant à un aliquot mbtBDNF, le volume nécessaire de point quantique streptavidin conjugué (streptavidin-QD) pour atteindre un rapport molaire BDNF-QD 1:1. Puis, diluer à 20 μL avec le milieu neurobasal. Enveloppez le tube dans du papier d’aluminium pour le protéger de la lumière.
      REMARQUE : Préparez un autre tube avec le même volume de streptavidine à point quantique conjugué et diluez-le à 20 μL avec le milieu neurobasal comme contrôle négatif.
    5. Incuber le mélange mbtBDNF/streptavidin-QD pendant 30 min à température ambiante dans un rocker.
    6. Diluer le BDNF-QD à la concentration finale souhaitée (200 pM et 2 nM) dans le milieu neurobasal.
    7. Après 1 h d’incubation avec un milieu neurobasal non complété, stimuler les neurones avec BDNF-QD ou streptavidine-QD (contrôle) à une concentration finale de 200 pM et 2 nM de BDNF pendant 30 min à 37 °C.
    8. Laver les couvercles 3 fois avec 1x PBS (37 °C) et fixer les cellules pendant 15 min en traitant la couverture avec une solution de paraformaldéhyde de 4 % contenant des inhibiteurs de la phosphatase.
    9. Laver les cellules 3 fois avec PBS, puis incuber avec le tampon de blocage/permeabilisation (BSA 5%, Triton X-100 0,5%, inhibiteur 1x phosphatase) pendant 1 h.
    10. Incuber avec un anticorps anti-pCREB 1:500 (en BSA à 3%, 0,1% Triton X-100) pendant la nuit à 4 °C.
    11. Le lendemain, laver 3 fois avec 1x PBS, et incuber pendant 1 h avec l’anticorps secondaire 1:500 (3% BSA, 0,1% Triton X-100).
    12. Laver 3 fois avec 1x PBS. Ajouter la solution de tache nucléaire Hoechst (5 μg/mL) pendant 7 min.
    13. Laver 3 fois avec 1x PBS et monter.
  3. Visualisation du transport axonal rétrograde de BDNF-QD dans les neurones vivants
    1. Préparer les chambres microfluidiques et les neurones de graines comme décrit précédemment16.
    2. Après 7-8 jours dans la culture, changer le milieu au milieu non-complété de neurobasal.
    3. Préparez mbtBDNF conjugué aux points quantiques (BDNF-QD) en ajoutant à un aliquot mbtBDNF, le volume nécessaire de point quantique streptavidin conjugué (streptavidin-QD) pour atteindre un rapport molaire BDNF-QD 1:1. Puis, diluer à 20 μL avec le milieu neurobasal. Enveloppez le tube dans du papier d’aluminium pour le protéger de la lumière.
      REMARQUE : Préparez un autre tube avec le même volume de streptavidine à points quantiques conjugué et diluez-le à 20 μL avec un milieu neurobasal comme un contrôle.
    4. Incuber le mélange mbtBDNF/streptavidin-QD pendant 30 min à température ambiante dans un rocker.
    5. Diluer le BDNF-QD à la concentration finale souhaitée (2 nM).
    6. Après 1 h d’incubation avec le milieu neurobasal non complété ajouter le BDNF-QD ou le mélange de commande aux compartiments axonaux de la chambre microfluidique. Incuber pendant 210 min à 37 °C pour assurer un transport net rétrograde de BDNF-QD.
    7. Pour l’imagerie à cellules vivantes, visualisez le transport rétrograde axonal dans le segment des microgrooves qui est proximal au compartiment du corps cellulaire à l’aide d’un objectif 100x à l’aide d’un microscope adapté à ces fins (37 °C et 5% de CO2). Acquérir des images à 1 cadre/s.

Résultats

L’utilisation d’un protocole chromatographique basé sur les colonnes permet le traitement de volumes importants de supports conditionnés HEK293. Dans la figure 1, les résultats de la purification de BDNFAvi à partir de 500 mL de support conditionné sont affichés. Les élutions consécutives de BDNFAvi des perles d’agarose Ni-NTA donnent des concentrations décroissantes de BDNFAvi (Figure 1A). Après quatre ellutions consécutives (chacune d’une du...

Discussion

Dans cet article, une méthodologie optimisée pour la production et la purification du mbtBDNF dans une procédure basée sur la chromatographie d’affinité est décrite, basée sur le travail de Sung et collaborateurs17. Les optimisations comprennent l’utilisation d’un réactif transfection rentable (Î.-P.-É.) tout en maintenant l’efficacité de méthodes de transfection plus coûteuses comme la lipofectamine. Cette optimisation se traduit par une réduction significative des coûts du...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs reconnaissent avec gratitude le soutien financier de Fondecyt (1171137) (FCB), du Centre basal d’excellence en science et technologie (AFB 170005) (FCB), Millenium-Nucleus (P07/011-F) (FCB), le Wellcome Trust Senior Investigator Award (107116/Z/15/Z) (GS) et un prix de la Uk Dementia Research Institute Foundation (GS). Ce travail a été soutenu par l’Unidad de Microscopía Avanzada UC (UMA UC).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
2 way stopcockBioRad7328102Chromatography apparatus component
2-mercaptoethanolSigmaM6250BDNF elution buffer
Acrylamide/BisacrylamideBioRad1610154SDS-PAGE gel preparation
Amicon Ultra-15 10KMilliporeUFC901024BDNF concentration
Ammonium PersulfateSigmaA9164SDS-PAGE gel preparation
anti B-III-Tubulin antibodySigmaT8578Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti BDNF antibodyAlomoneAGP-021Western blot assays for BDNF quantification
anti BDNF antibodyAlomoneANT-010Western blot assays for BDNF quantification
Anti ERK antibodyCell Signaling9102Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pCREB antibody (S133)Cell Signaling9198Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pERK antibody (T202, Y204)Cell Signaling4370Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pTrkB antibody (Y515)Abcamab109684Western blot assays for BDNF biological activity detection
Antibiotic/AntimycoticGibco15240-062HEK293 maintenance
ATPSigmaA26209BDNF monobiotinylation buffer
B-27 SupplementGibco17504-044Neuron maintenance
BicineSigmaB3876BDNF monobiotinylation buffer
BirA-GSTBPS Bioscience70031Enzyme for BDNF AviTag monobiotinylation
Bovine Fetal SerumHyCloneHC.SH30396.02HEK293 maintenance
Bovine Serum AlbuminJackson ImmunoResearch001-000-162BDNF buffer modification component, blocking buffer for western blot and immunofluorescence
D-BiotinSigmaB4639BDNF monobiotinylation buffer
DithiothreitolInvitrogen15508-013
DMEM High Glucose MediumGibco11965-092Neuron seeding
DMEM MediumGibco11995-081HEK293 maintenance
Econo Column FunnelBioRad7310003Chromatography apparatus component
EDTAMerck108418
EZ-ECL KitBiological Industries1633664Protein detection by western blotting
GlutamaxGibco35050-061Neuron and HEK293 maintenance
GlycerolMerck104094BDNF elution buffer, lysis buffer for western blot assays
Hettich Rotina 46R CentrifugeHettichDiscontinuedCentrifuge used for clearing the medium of debris
Hettich Universal 32R CentrifugeHettichDiscontinuedCentrifuge used for protein concentrator centrifugation
Horse SerumGibco16050-122Neuron seeding
ImageQuant LAS 500GE Healthcare Life Sciences29005063Western blot image acquisition
ImidazoleSigmaI55513BDNF buffer modification component
KClWinklerBM-1370PBS component
KH2PO4Merck104873PBS component
LamininInvitrogen23017-015Cover coating for compartmentalized neurons
Luer Tubing AdaptorBioRad7323245Chromatography apparatus component
Luminata™ Forte Western HRP SubstrateMilliporeWBLUF0100Protein detection by western blotting
Mg(CH3COO)2Merck105819BDNF monobiotinylation buffer
Mowiol 4-88Calbiochem475904Mounting reagent for immunofluorescence assays
MyOne C1 Streptavidin Magnetic BeadsInvitrogen65001Biotinylation verification
Na2HPO4Merck106586BDNF buffer modification component
NaClWinklerBM-1630PBS component, BDNF buffer modification component
NaH2PO4Merck106346BDNF buffer modification component
Neurobasal MediumGibco21103-049Neuron maintenance
Ni-NTA Agarose BeadsQiagen30210BDNF AviTag purification
Nikon Ti2-ENikonMicroscope for fluorescence imaging
Nitrocellulose MembraneBioRad1620115Protein transfer for western blotting
ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS cameraHamamatsuC13440-20CUCamera for epifluorescence imaging
P8340 Protease Inhibitor CocktailSigmaP8340BDNF buffer modification component
ParaformaldehydeMerck104005Fixative for immunofluorescence assays
Penicillin/StreptomycinGibco15140-122Neuron maintenance
Poli-D-LysineCorningDLW354210Cover coating for compartmentalized neurons
Poli-L-LysineMilliporeP2363Cover coating for non-compartmentalized neurons
Poly-Prep Chromatography ColumnBioRad7311550Chromatography apparatus component
Polyethyleneimine 25KPolysciences Inc.PLY-0296HEK293 transfection
Quantum Dots 655 streptavidin conjugateInvitrogenQ10121MPMonobiotinylated BDNF AviTag label for live and fixed cell experiments
SaponinSigmaS4521Detergent for immunofluorescence assays
SucroseMerck107687
Syldgard 184 silicone elastomer basePoirot4019862Microfluidic chamber preparation
TEMEDSigmaT9281SDS-PAGE gel preparation
TrisWinklerBM-2000Lysis buffer component
Triton X100Merck108603Cell permeabilization in immunofluorescence and western blot assays
Trypsin-EDTA 0.5%Gibco15400-054HEK293 passaging

Références

  1. Huang, E., Reichardt, L. Neurotrophins: Roles in Neuronal Development and Function. Annual Review of Neuroscience. 24, 677-736 (2001).
  2. Skaper, S. D. The neurotrophin family of neurotrophic factors: an overview. Methods in Mollecular Biology. 846, 1-12 (2012).
  3. Gonzalez, A., Moya-Alvarado, G., Gonzalez-Billault, C., Bronfman, F. C. Cellular and molecular mechanism regulating neuronal growth by brain-derived neurotrophic factor. Cytoskeleton. 73 (10), 612-628 (2016).
  4. Cunha, C., Brambilla, R., Thomas, K. A simple role for BDNF in learning and memory. Frontiers in Mollecular Neuroscience. 3, 1 (2010).
  5. Bronfman, F. C., Lazo, O. M., Flores, C., Escudero, C. A., Lewin, G., Carter, B. Spatiotemporal intracelular dynamics of neurotrophin and its receptors. Implications for neurotrophin signaling and neuronal function. Neurotrophic Factor. Handbook of Experimental Pharmacology. 220, (2014).
  6. Ascano, M., Bodmer, D., Kuruvilla, R. Endocytic trafficking of neurotrophins in neural development. Trends in Cell Biology. 22 (5), 266-273 (2012).
  7. Deinhardt, K., Salinas, S., Verastegui, C., Watson, R., Worth, D., Hanrahan, S., Bucci, C., Schiavo, G. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52 (2), 293 (2006).
  8. Escudero, C. A., et al. c-Jun N-terminal kinase (JNK)-dependent internalization and Rab5-dependent endocytic sorting medaited long-distance retrograde neuronal death induced by axonal BDNF-p75 signaling. Scientific Reports. 9, 6070 (2019).
  9. Vrabec, J. P., Levin, L. A. The neurobiology of cell death in glaucoma. Eye. 21, 11-14 (2007).
  10. Liot, G., Zala, D., Pla, P., Mottet, G., Piel, M., Saudou, F. Mutant huntingtin alters retrograde transport of TrkB receptors in striatal dendrites. Journal of Neuroscience. 33 (15), 6298-6309 (2013).
  11. Zhou, B., Cai, Q., Xie, Y., Sheng, Z. H. Snapin recruits dynein to BDNF-TrkB signaling endosomes for retrograde axonal transport and is essential for dendrite growth of cortical neurons. Cell Reports. 2 (1), 42-51 (2012).
  12. Haubensak, W., Narz, F., Heumann, R., Lessmann, V. BDNF-GFP containing secretory granules are localized in the vicinity of synaptic junctions of cultured cortical neurons. Journal of Cell Science. 111 (11), 1483-1493 (1998).
  13. Adachi, N., et al. Glucocorticoid affects dendritic transport of BDNF-containing vesicles. Scientific Reports. 5, 12684 (2015).
  14. Biocompare: The Buyer's Guide for Life Scientists. Mirus Bio. Cellular Toxicity Caused by Transfection: Why is it important Available from: https://www.biocompare.com/Bench-Tips/121111-Cellular-Toxicity-Caused-by-Transfection-Why-is-it-important/ (2012)
  15. Zhao, L., et al. Mechanism underlying activity-dependent insertion of TrkB into the neuronal surface. Journal of Cell Science. 122 (17), 3123-3136 (2009).
  16. Zhao, X., Zhou, Y., Weissmiller, A., Pearn, M., Mobley, W., Wu, C. Real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled BDNF in primary neurons. Journal of Visualized Experiments. 91, 51899 (2014).
  17. Sung, K., Maloney, M., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of Neuroscience Methods. 200 (2), 121-128 (2011).
  18. Deerinck, T. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
  19. Unsain, N., Nuñez, N., Anastasia, A., Mascó, D. H. Status epilepticus induces a TrkB to p75 neurotrophin receptor switch and increases brain-derived neurotrophic factor interaction with p75 neurotrophon receptor: an initial event in neuronal injury induction. Neuroscience. 154 (3), 978-993 (2008).
  20. Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).
  21. Moya-Alvarado, G., Gonzalez, A., Stuardo, N., Bronfman, F. C. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) regulates Rab5-positive early endosomes in hippocampal neurons to induce dendritic branching. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 493 (2018).
  22. Sasi, M., Vignoli, B., Canossa, M., Blum, R. Neurobiology of local and intercellular BDNF signaling. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 469 (5), 593-610 (2017).
  23. . The Rab5-Rab11 endosomal pathway is required for BDNF-induced CREB transcriptional regulation in neurons Available from: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/844720v1 (2019)
  24. Mowla, , et al. Biosynthesis and post-translational processing of the precursor to brain-derived neurotrophic factor. Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12660-12666 (2001).
  25. Longo, P., Kavran, J., Kim, M. S., Leahy, D. Transient Mammalian Cell Transfection with Polyethyleneimine (PEI). Methods in Enzymology. 529, 227-240 (2013).
  26. Raymond, C., Tom, R., Perret, S., Moussouami, P., L'Abbé, D., St-Laurent, G., Durocher, Y. A simplified polyethyleneimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods. 55 (1), 44-51 (2011).
  27. Dalton, A., Barton, W. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).
  28. Hunter, M., Yuan, P., Vavilala, D., Fox, M. Optimization of protein expression in mammalian cells. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 77 (2019).
  29. Stepanenko, A. A., Heng, H. H. Transient and stable vector transfection: Pitfalls, off-target effects, artifacts. Mutation Research. 773, 91-103 (2017).
  30. Guerzoni, L. P., Nicolas, V., Angelova, A. In vitro modulation of TrkB receptor signaling upon sequential delivery of curcumin-DHA loaded carriers towards promoting neuronal survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
  31. Angelova, A., Angelov, B. Dual and multi-drug delivery nanoparticles towards neuronal survival and synaptic repair. Neural Regeneration Research. 12 (6), 886-889 (2017).

Réimpressions et Autorisations

Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demande d’autorisation

Explorer plus d’articles

NeuroscienceNum ro 161BDNFmono biotinylationpoints quatumtrafic axonalpurification des prot inesdynamique endosomesuivi in vivo

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Contactez-nous

RECOMMANDER À LA BIBLIOTHÈQUE

NEWSLETTERS JoVE

Recherche

Enseignement

Auteurs

Bibliothécaires

À PROPOS DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.