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Resumo

BDNF recombinante contendo uma sequência de Avi (BDNFAvi) é produzido em células HEK293 de forma econômica e é purificado por cromatografia de afinidade. BDNFavi é então diretamente mono-biotiningado com a enzima BirA em um tubo. BDNFavi e BDNFavi mono-biotiniladas mantêm sua atividade biológica quando comparadas com bdnf disponíveis comercialmente.

Resumo

BDNF recombinante contendo uma sequência de Avi (BDNFAvi) é produzido em células HEK293 e, em seguida, purificado por cromatografia de afinidade. Um protocolo reprodutível foi desenvolvido para mono-biotinilato BDNFAvi com a enzima BirA em um tubo. Nesta reação, o BDNFAvi mono-biotinilado mantém sua atividade biológica.

Neurotrophins são fatores de crescimento derivados da meta que desempenham um papel no desenvolvimento e manutenção neuronal. Eles requerem mecanismos de transporte rápido ao longo da via endocítica para permitir a sinalização de longa distância entre diferentes compartimentos neuronais. O desenvolvimento de ferramentas moleculares para estudar o tráfico de neurotrophins permitiu o rastreamento preciso dessas proteínas na célula usando o registro in vivo. Neste protocolo, desenvolvemos um procedimento otimizado e econômico para a produção de BDNF mono-biotinilado. Uma variante BDNF recombinante contendo uma sequência avi biotinítil (BDNFAvi) é produzida em células HEK293 na faixa de microgramas e, em seguida, purificada em um procedimento facilmente escalável usando cromatografia de afinidade. O BDNF purificado pode então ser homogêneo mono-biotiningado por uma reação in vitro direta com a enzima BirA em um tubo. A atividade biológica do BDNF mono-biotinilato (mbtBDNF) pode ser conjugada a extenuante conjugados a diferentes fluoroforos. BDNFAvi e mbtBDNF mantêm sua atividade biológica demonstrada através da detecção de alvos fosfoilados a jusante usando mancha ocidental e ativação do fator de transcrição CREB, respectivamente. Usando pontos streptavidin-quânticos, pudemos visualizar a internalização mbtBDNF concomitante com ativação do CREB, que foi detectado com um anticorpo específico fosfo-CREB. Além disso, mbtBDNF conjugado a pontos streptavidin-quânticos foi adequado para análise de transporte retrógrado em neurônios corticais cultivados em câmaras microfluidas. Assim, no tubo produzido mbtBDNF é uma ferramenta confiável para estudar a sinalização fisiológica e o tráfico de neurônios.

Introdução

Os neurônios são as unidades funcionais do sistema nervoso que possuem uma morfologia complexa e especializada que permite a comunicação sináptica e, portanto, a geração de comportamento coordenado e complexo em resposta a diversos estímulos. Projeções neuronais como dendritos e axônios são características estruturais críticas envolvidas na comunicação neuronal, e neurotrophins são atores cruciais na determinação de sua morfologia e função1. Neurotrophins são uma família de fatores de crescimento secretos que incluem NGF, NT-3, NT-4 e fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)2. No sistema nervoso central (SNC), o BDNF participa de diversos processos biológicos, incluindo neurotransmissão, arborização dendrítica, maturação de colunas dendríticas, potencialização a longo prazo, entre outros3,,4. Portanto, o BDNF desempenha um papel crítico na regulação da função neuronal.

Diversos processos celulares regulam a dinâmica e a função do BDNF. Na superfície neuronal, o BDNF liga o receptor de tropomyosina quinase B (TrkB) e/ou o receptor de neurotropfina p75 (p75). Os complexos BDNF-TrkB e BDNF-p75 são endocitados e classificados em diferentes organelas endocíticas5,,6,,7,,8. O correto tráfico intracelular do complexo BDNF/TrkB é necessário para sinalização BDNF adequada em diferentes circuitos neuronais9,,10,,11. Por essa razão, uma compreensão profunda da dinâmica do tráfico de BDNF e suas alterações encontradas nos processos fisiofisiológicos é essencial para compreender a sinalização de BDNF em saúde e doença. O desenvolvimento de novas e específicas ferramentas moleculares para monitorar esse processo ajudará a impulsionar este campo e permitirá uma melhor compreensão dos mecanismos regulatórios envolvidos.

Existem várias ferramentas disponíveis para o estudo do tráfico de BDNF em neurônios. Uma metodologia comumente utilizada envolve a transfecção de BDNF recombinante marcado com moléculas fluorescentes como proteína fluorescente verde (GFP) ou a variante monomérica fluorescente de mudança vermelha do GFP mCherry12,13. No entanto, uma grande deficiência da superexpressão do BDNF é que elimina a possibilidade de fornecer concentrações conhecidas dessa neurotropina. Além disso, pode resultar em toxicidade celular, obscurecendo a interpretação dos resultados14. Uma estratégia alternativa é a transfecção de um TrkB marcado por epitope, como Flag-TrkB. Essa metodologia permite o estudo da dinâmica de internalização TrkB15,mas também envolve transfecção, o que pode resultar em alteração da função TrkB e toxicidade celular. Para superar esses obstáculos metodológicos, foram desenvolvidas variantes recombinantes de NGF e BDNF contendo uma sequência avi (BDNFAvi), que pode ser mono-biointinalada pela enzima biotin-ligase BirA,16,,17. BDNF recombinante biotinína pode ser acoplado a diferentes ferramentas ligadas a streptavidin, que incluem fluoroforos, contas, nanopartículas paramagnéticas, entre outras para detecção. Em termos de imagem de células vivas, os pontos quânticos (QD) tornaram-se fluoroforos frequentemente utilizados, pois possuem características desejáveis para o rastreamento de partículas únicas, como aumento do brilho e resistência ao fotobleaching quando comparados com fluoroforos de molécula pequena18.

A produção de BDNF mono-biotinilado (mbtBDNF) usando BDNFAvi foi alcançada pela co-transfecção de plasmídeos que conduzem a expressão de BDNFAvi e BirA, seguido pela purificação da proteína recombinante por cromatografia de afinidade com um rendimento de 1-2 μg de BDNF por 20 mL de mídia cultural hek293-condicionada17. Aqui, propomos uma modificação deste protocolo que permite a purificação do BDNFAvi a partir de 500 mL de mídia hek293, que busca maximizar a recuperação de proteínas em um protocolo baseado em coluna cromatografia para facilitar a manipulação. O agente de transfecção usado, polietileneimina (PEI), garante um método econômico sem sacrificar o rendimento da transfecção. A etapa de mono-biotintilação foi adaptada a uma reação in vitro para evitar as complicações associadas às co-transfecções e garantir a rotulagem homogênea de BDNF. A atividade biológica do mbtBDNF foi demonstrada por experimentos de microscopia de bolhas ocidentais e fluorescência, incluindo ativação de pCREB e imagem de células vivas para estudar o transporte axonal retrógrado de BDNF em câmaras microfluidas. O uso deste protocolo permite uma produção otimizada e de alto rendimento de BDNF mono-biotinilado e biologicamente ativo.

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas da CONICYT (Comissão Nacional de Pesquisa Científica e Tecnológica do Chile). Os protocolos utilizados neste estudo foram aprovados pelas Comissões de Biossegurança e Bem-Estar Bioético e Animal da Pontificia Universidad Católica de Chile. Os experimentos envolvendo vertebrados foram aprovados pela Comissão de Bem-Estar Bioético e Animal da Pontifícia Universidad Católica de Chile.

NOTA: O protocolo a seguir foi projetado para purificar o BDNFAvi a partir de um volume total de 500 mL de meio condicionado produzido em células HEK293. A quantidade de meio condicionado que é produzido e processado para purificar bdnfavi pode ser para cima ou para baixo, conforme necessário. No entanto, uma maior otimização pode ser necessária nestas circunstâncias. A composição dos meios culturais e tampões utilizados ao longo do protocolo pode ser encontrada em materiais suplementares.

1. Produção e purificação de BDNFAvi da mídia hek293-condicionada

  1. Transfecção de células HEK293
    1. Cresça as células HEK293 até 70% de confluência em meio DMEM suplementado (10% soro fetal bovino, 1x suplemento de glutamato, 1x antibiótico/antimíctico) em pratos de cultura de 15 cm a 37 ºC.
    2. Altere o tampão de transfecção média para transfecção.
    3. Prepare a mistura PEI-DNA para transfecção. Use dois diferentes tubos cônicos de 15 mL para diluir o DNA e PEI 25 K, respectivamente. Diluir 20 μg de DNA plasmídeo em um volume final de 500 μL em um tubo. Diluir 60 μg de PEI linear 25K em um volume final de 500 μL no outro tubo. Incubar em temperatura ambiente por 5 minutos.
    4. Pipeta cuidadosamente a solução de DNA no tubo PEI, misturando uma vez por movimento para cima. Incubar em temperatura ambiente por 25 minutos.
    5. Gotejamento 1 mL da mistura PEI-DNA ao longo de cada prato de 15 cm. Incubar as células com a mistura PEI-DNA por 3 h a 37 ºC.
    6. Altere o tampão de incubação médio para fresco.
  2. Coleta e armazenamento de mídia
    1. Colete o meio de todos os pratos 48 h após a transfecção das células HEK293. Prepare os estoques concentrados das soluções descritas na seção "tampão de modificação supernaca" do Arquivo Suplementar 1 e adicione-os ao supernatante HEK293 para alcançar as concentrações finais listadas.
      NOTA: As células podem ser descartadas ou recuperadas para análise posterior.
    2. Incubar o meio no gelo por 15 minutos.
    3. Alíquotar o meio em tubos de centrífuga.
    4. Centrifugar o meio a 10.000 x g por 45 min em uma centrífuga de 4 °C. Esta etapa permite a eliminação de detritos celulares e células mortas suspensas na mídia.
    5. Recolher os supernantes, adicionar BSA em uma concentração final de 0,1%. e depois armazenar a -20 °C. A mídia pode ser alitada antes de congelar para um descongelamento mais rápido durante a etapa de purificação.
      NOTA: Os tempos de armazenamento de mídia condicionada congelada de até 2 meses produziram resultados positivos, tempos de armazenamento mais longos não foram avaliados.
  3. Concentração e purificação da mídia
    1. Descongele a mídia em um banho termoregulado de 37 °C.
    2. Alíquotar a mídia em tubos de centrífugas.
    3. Centrifugar o meio por 1h a 3.500 x g em uma centrífuga resfriada de 4 °C. Esta etapa permite a eliminação de detritos celulares remanescentes para garantir o fluxo adequado através da coluna cromatografia.
    4. Use os concentradores de proteínas com um corte de 10 kDa para reduzir a mídia de 500 mL para 100 mL. Siga os parâmetros de centrifugação recomendados pelo fabricante para uma concentração ideal.
    5. Adicione 500 μL de contas ni-nta à mídia concentrada e incubar durante a noite a 4 °C em um roqueiro.
    6. Monte o aparelho de cromatografia e despeje a mídia nele. Deixe descansar por 5 minutos e depois abra a torneira de 2 vias para deixar o meio fluir.
    7. Lave as contas com 5 mL de tampão de lavagem por 5 minutos. Certifique-se de resuspensar as contas da coluna. Escorra o tampão de lavagem abrindo a torneira de 2 vias. Repita 3 vezes.
    8. Adicione 1 mL de tampão de eluição à coluna. Certifique-se de resuspensar as contas na coluna. Incubar por 15 min e, em seguida, coletar o elunato em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL. Repita esta etapa 3 vezes para a elução completa do BDNFAvi.
    9. Carga 5 μL de cada elunato e concentrações diferentes de BDNF comercialmente disponível (40-160 ng) em um gel de poliacrilamida de 15%. Detecte a proteína purificada por manchas ocidentais usando um anticorpo anti-BDNF.
    10. Determine a concentração do BDNFAvi purificado em cada elunato utilizando a curva de concentração preparada com o BDNF comercialmente disponível.
    11. Aliquot e armazene o BDNFAvi purificado a -80 °C.

2. Mono-biotintilação in vitro de BDNFAvi usando a enzima BirA

  1. Reação de mono-biotintilação in vitro
    1. Prepare soluções concentradas de estoque dos reagentes tampão de biotiningação. O uso de estoques concentrados minimizará a diluição da proteína recombinante.
    2. Pegue uma alíquota de 800 ng de BDNFAvi e adicione os reagentes tampão de biotinilação e a enzima BirA em uma relação molar 1:1 com bDNF. Por exemplo, para um acréscimo de volume final de reação de 200 μL; 100 μL de solução contendo 800 ng de BDNFAvi, 20 μL Bicine 0,5 M pH 8.3, 20 μL ATP 100 mM, 20 μL MgOAc 100 mM, 20 μL d-biotina 500 μM, 0,8-1 μg a 1 μL de BirA-GST, e completam até 200 μL com água ultrapura.
      NOTA: Reações bem-sucedidas de biotinilação foram realizadas com alíquotas de 400 μL contendo uma concentração de cerca de 30 ng/ μL BDNFAvi, resultando em um BDNFAvi homogêneo biotinilado para uma concentração final de ~20 ng/ μL na reação final.
    3. Incubar a mistura a 30 °C em forno de hibridização por 1 h. Misture o conteúdo por inversão de tubo a cada 15 minutos.
    4. Adicione o mesmo volume de ATP e BirA como na etapa 2.1.2 e repita o passo 2.1.3.
    5. Armazene a -80 °C para análises futuras ou mantenha no gelo para uso imediato (por exemplo, controle de qualidade de biotinylation).
  2. Análise de biotintilação
    1. Bloco 30 μL de contas magnéticas streptavidin por amostra BDNF em 1 mL de tampão de bloqueio. Incubar à temperatura ambiente por 1 h em um rotador de tubo de microcentrifuagem.
    2. Precipitar as contas magnéticas usando um rack de separação magnética por 3 a 5 minutos ou até que o buffer pareça completamente limpo das contas e descarte o tampão de bloqueio.
    3. Adicione 50 μL de tampão de bloqueio fresco e 80 ng de amostra de BDNFAvi mono-biotinilado (mbtBDNF) às contas, certificando-se de resuspensá-las completamente por tubulação.
    4. Incubar a 4 °C por 1h em um rotador de tubo de microcentrifutração girando a aproximadamente 20 RPM.
    5. Colete as contas usando o rack de separação magnética por 3 a 5 minutos, e colete o supernatante, mantendo uma alíquota de 30 μL para análise.
    6. Lave as contas uma vez com 500 μL de PBS e, em seguida, colete-as usando o rack de separação magnética por 3 a 5 minutos. Recupere o supernatante e mantenha uma alíquota de 30 μL para análise.
    7. Adicione 10 μL de tampão de carregamento de 4x às contas.
    8. Aqueça as amostras a 97 °C por 7 minutos para elutar o mbtBDNF.
    9. Detecte mbtBDNF usando um anticorpo específico anti-BDNF19.

3. Verificação da atividade biológica mbtBDNF

  1. Detecção de pTrkB e pERK por mancha ocidental.
    1. Sementes 2 milhões de neurônios cortical de rato em pratos de cultura de 60 mm.
    2. Cultura dos neurônios por 7 dias (DIV7). Em seguida, mude o mediun neurobásal médio para não-suplementado ao iniciar o experimento.
    3. Uma hora após a troca média, adicione mbtBDNF a uma concentração final de 50 ng/mL. Incubar por 30 min a 37 ºC. Mantenha um prato de controle negativo (não estimulado com BDNF) e um prato de controle positivo (tratado com 50 ng/mL de BDNF comercialmente disponível).
    4. Colete o meio e levemente lavar cada prato com 1x PBS. Coletar e descartar o PBS 1x.
    5. Coloque os pratos no gelo e adicione 50-80 μL de tampão de lise a cada prato. Use um raspador de células para lise as células.
      NOTA: A etapa de lise deve ser realizada o mais rápido possível para evitar a desfosforilação e degradação da proteína. 1-2 minutos de raspagem vigorosa são suficientes para visualizar as proteínas de interesse por manchas ocidentais.
    6. Colete o tampão de lise e mexa em uma batedeira de vórtice na velocidade mais alta para 5 s.
    7. Centrifugar o tampão de lise a 14.000 x g (4 °C) por 10 minutos. Cole o supernatante.
    8. Quantifique o teor proteico do supernasce pelo protocolo de quantificação de proteínas BCA20.
    9. Adicione o tampão de carga a uma alíquota contendo 30-50 μg de proteína por condição e carregue-o em um gel de poliacrilamida de 12% para a mancha ocidental. Detecte pTrkB e pERK usando fosfo-anticorpos específicos para verificar a atividade biológica BDNFAvi.
  2. Verificação da atividade biológica BDNF-QD por imunofluorescência pCREB.
    1. Sementes 40.000 neurônios cortical de rato em tampas de 10 mm, previamente autoclavados e tratados com poli-L-lisina como descrito anteriormente21.
    2. Cultura os neurônios por 7-8 dias em tampão de manutenção neuronal (ver materiais suplementares) a 37 ºC.
    3. Para iniciar o experimento, mude o meio neurobásico médio para não-espesso e incubar a 37 ºC por 1h.
    4. Prepare mbtBDNF conjugado aos pontos quânticos (BDNF-QD) adicionando a uma alíquota mbtBDNF, o volume necessário de ponto quântico streptavidin conjugado (streptavidin-QD) para alcançar uma razão molar BDNF-QD de 1:1. Em seguida, diluir para 20 μL com meio neurobásal. Enrole o tubo em papel alumínio para protegê-lo da luz.
      NOTA: Prepare outro tubo com o mesmo volume de ponto quântico streptavidin conjugado e dilua-o a 20 μL com meio neurobásal como um controle negativo.
    5. Incubar a mistura mbtBDNF/ streptavidin-QD por 30 minutos à temperatura ambiente em um roqueiro.
    6. Diluir o BDNF-QD à concentração final desejada (200 pM e 2 nM) no meio neurobásal.
    7. Após 1 h de incubação com meio neurobásal não suplementado, estimule os neurônios com BDNF-QD ou streptavidin-QD (controle) até uma concentração final de 200 pM e 2 nM de BDNF para 30 min a 37 °C.
    8. Lave as tampas 3 vezes com 1x PBS (37 °C) e fixe as células por 15 minutos tratando o deslizamento com 4% de solução paraformaldeída contendo inibidores de fosfatase.
    9. Lave as células 3 vezes com PBS e, em seguida, incubar com tampão de bloqueio/permeabilização (BSA 5%, Triton X-100 0,5%, 1x inibidor de fosfabilização) por 1 h.
    10. Incubar com anticorpo anti-pCREB 1:500 (em 3% BSA, 0,1% Triton X-100) durante a noite a 4 °C.
    11. No dia seguinte, lave 3 vezes com 1x PBS e incuba por 1h com o anticorpo secundário 1:500 (3% BSA, 0,1% Triton X-100).
    12. Lave 3 vezes com 1x PBS. Adicione a solução de mancha nuclear Hoechst (5 μg/mL) por 7 min.
    13. Lave 3 vezes com 1x PBS e monte.
  3. Visualização do transporte axonal retrógrado de BDNF-QD em neurônios vivos
    1. Prepare câmaras microfluidas e neurônios de sementes como descrito anteriormente16.
    2. Após 7-8 dias na cultura, mude o meio neurobásal médio para não suplementado.
    3. Prepare mbtBDNF conjugado aos pontos quânticos (BDNF-QD) adicionando a uma alíquota mbtBDNF, o volume necessário de ponto quântico streptavidin conjugado (streptavidin-QD) para alcançar uma razão molar BDNF-QD de 1:1. Em seguida, diluir para 20 μL com meio neurobásal. Enrole o tubo em papel alumínio para protegê-lo da luz.
      NOTA: Prepare outro tubo com o mesmo volume de ponto quântico streptavidin conjugado e dilua-o a 20 μL com meio neurobásal como controle.
    4. Incubar a mistura mbtBDNF/ streptavidin-QD por 30 minutos à temperatura ambiente em um roqueiro.
    5. Diluir o BDNF-QD à concentração final desejada (2 nM).
    6. Após 1 h de incubação com meio neurobásico não suplementado adicione o BDNF-QD ou a mistura de controle aos compartimentos axonais da câmara microfluida. Incubar por 210 min a 37 °C para garantir um transporte líquido retrógrado de BDNF-QD.
    7. Para imagens de células vivas, visualize o transporte retrógrado axonal no segmento dos microgrooves que é proximal ao compartimento do corpo celular usando um objetivo de 100x usando um microscópio adequado para este fim (37 °C e 5% de CO2). Adquira imagens a 1 frame/s.

Resultados

O uso de um protocolo cromatográfico baseado em coluna permite o processamento de volumes significativos de mídia condicionada HEK293. Na Figura 1,são mostrados os resultados da purificação do BDNFAvi a partir de 500 mL de mídia condicionada. Eluções consecutivas de BDNFAvi do Ni-NTA produzem contas de diminuição das concentrações de BDNFAvi (Figura 1A). Após quatro eluções consecutivas (cada uma com duração de 15 min), a maioria do BDNF captura...

Discussão

Neste artigo, descreve-se uma metodologia otimizada para a produção e purificação do mbtBDNF em um procedimento baseado em cromatografia de afinidade, a partir do trabalho de Sung e colaboradores17. As otimizações incluem o uso de um reagente de transfecção econômico (PEI) mantendo a eficiência de métodos de transfecção mais caros, como a lipofectamina. Essa otimização se traduz em uma redução significativa de custos no protocolo, permitindo a escalabilidade, mantendo o alto custo...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Os autores agradecem o apoio financeiro da Fondecyt (1171137) (FCB), do Centro Basal de Excelência em Ciência e Tecnologia (AFB 170005) (FCB), do Millenium-Nucleus (FCB). P07/011-F) (FCB), o Wellcome Trust Senior Investigator Award (107116/Z/15/Z) (GS) e um prêmio da Uk Dementia Research Institute Foundation (GS). Este trabalho contou com o apoio da Unidad de Microscopía Avanzada UC (UMA UC).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
2 way stopcockBioRad7328102Chromatography apparatus component
2-mercaptoethanolSigmaM6250BDNF elution buffer
Acrylamide/BisacrylamideBioRad1610154SDS-PAGE gel preparation
Amicon Ultra-15 10KMilliporeUFC901024BDNF concentration
Ammonium PersulfateSigmaA9164SDS-PAGE gel preparation
anti B-III-Tubulin antibodySigmaT8578Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti BDNF antibodyAlomoneAGP-021Western blot assays for BDNF quantification
anti BDNF antibodyAlomoneANT-010Western blot assays for BDNF quantification
Anti ERK antibodyCell Signaling9102Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pCREB antibody (S133)Cell Signaling9198Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pERK antibody (T202, Y204)Cell Signaling4370Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pTrkB antibody (Y515)Abcamab109684Western blot assays for BDNF biological activity detection
Antibiotic/AntimycoticGibco15240-062HEK293 maintenance
ATPSigmaA26209BDNF monobiotinylation buffer
B-27 SupplementGibco17504-044Neuron maintenance
BicineSigmaB3876BDNF monobiotinylation buffer
BirA-GSTBPS Bioscience70031Enzyme for BDNF AviTag monobiotinylation
Bovine Fetal SerumHyCloneHC.SH30396.02HEK293 maintenance
Bovine Serum AlbuminJackson ImmunoResearch001-000-162BDNF buffer modification component, blocking buffer for western blot and immunofluorescence
D-BiotinSigmaB4639BDNF monobiotinylation buffer
DMEM High Glucose MediumGibco11965-092Neuron seeding
DMEM MediumGibco11995-081HEK293 maintenance
Econo Column FunnelBioRad7310003Chromatography apparatus component
EDTAMerck108418
EZ-ECL KitBiological Industries1633664Protein detection by western blotting
GlutamaxGibco35050-061Neuron and HEK293 maintenance
GlycerolMerck104094BDNF elution buffer, lysis buffer for western blot assays
Hettich Rotina 46R CentrifugeHettichDiscontinuedCentrifuge used for clearing the medium of debris
Hettich Universal 32R CentrifugeHettichDiscontinuedCentrifuge used for protein concentrator centrifugation
Horse SerumGibco16050-122Neuron seeding
ImageQuant LAS 500GE Healthcare Life Sciences29005063Western blot image acquisition
ImidazoleSigmaI55513BDNF buffer modification component
KClWinklerBM-1370PBS component
KH2PO4Merck104873PBS component
LamininInvitrogen23017-015Cover coating for compartmentalized neurons
Luer Tubing AdaptorBioRad7323245Chromatography apparatus component
Luminata™ Forte Western HRP SubstrateMilliporeWBLUF0100Protein detection by western blotting
Mg(CH3COO)2Merck105819BDNF monobiotinylation buffer
Mowiol 4-88Calbiochem475904Mounting reagent for immunofluorescence assays
MyOne C1 Streptavidin Magnetic BeadsInvitrogen65001Biotinylation verification
Na2HPO4Merck106586BDNF buffer modification component
NaClWinklerBM-1630PBS component, BDNF buffer modification component
NaH2PO4Merck106346BDNF buffer modification component
Neurobasal MediumGibco21103-049Neuron maintenance
Ni-NTA Agarose BeadsQiagen30210BDNF AviTag purification
Nikon Ti2-ENikonMicroscope for fluorescence imaging
Nitrocellulose MembraneBioRad1620115Protein transfer for western blotting
ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS cameraHamamatsuC13440-20CUCamera for epifluorescence imaging
P8340 Protease Inhibitor CocktailSigmaP8340BDNF buffer modification component
ParaformaldehydeMerck104005Fixative for immunofluorescence assays
Penicillin/StreptomycinGibco15140-122Neuron maintenance
Poli-D-LysineCorningDLW354210Cover coating for compartmentalized neurons
Poli-L-LysineMilliporeP2363Cover coating for non-compartmentalized neurons
Poly-Prep Chromatography ColumnBioRad7311550Chromatography apparatus component
Polyethyleneimine 25KPolysciences Inc.PLY-0296HEK293 transfection
Quantum Dots 655 streptavidin conjugateInvitrogenQ10121MPMonobiotinylated BDNF AviTag label for live and fixed cell experiments
SaponinSigmaS4521Detergent for immunofluorescence assays
Syldgard 184 silicone elastomer basePoirot4019862Microfluidic chamber preparation
TEMEDSigmaT9281SDS-PAGE gel preparation
TrisWinklerBM-2000Lysis buffer component
Triton X100Merck108603Cell permeabilization in immunofluorescence and western blot assays
Trypsin-EDTA 0.5%Gibco15400-054HEK293 passaging

Referências

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  2. Skaper, S. D. The neurotrophin family of neurotrophic factors: an overview. Methods in Mollecular Biology. 846, 1-12 (2012).
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  4. Cunha, C., Brambilla, R., Thomas, K. A simple role for BDNF in learning and memory. Frontiers in Mollecular Neuroscience. 3, 1 (2010).
  5. Bronfman, F. C., Lazo, O. M., Flores, C., Escudero, C. A., Lewin, G., Carter, B. Spatiotemporal intracelular dynamics of neurotrophin and its receptors. Implications for neurotrophin signaling and neuronal function. Neurotrophic Factor. Handbook of Experimental Pharmacology. 220, (2014).
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