Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا يتم تقديم طرق لفهم الآثار المضادة للسرطان من اللاكتوباكيلوس الخلايا الخالية من الخلايا الفائقة (LCFS). تظهر خطوط خلايا سرطان القولون والمستقيم وفيات الخلايا عند علاجها باستخدام LCFS في الثقافات ثلاثية الأبعاد. يمكن تحسين عملية توليد كرويدات اعتمادا على السقالة وأساليب التحليل المقدمة مفيدة لتقييم مسارات الإشارات المعنية.

Abstract

تصف هذه المخطوطة بروتوكولا لتقييم وفيات الخلايا السرطانية في كرويات ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) لأنواع متعددة الخلايا من الخلايا السرطانية باستخدام الخلايا الخارقة من زراعة خلايا الاختمار اللاكتوباكيلوس ، التي تعتبر ثقافات البروبيوتيك. استخدام الثقافات ثلاثية الأبعاد لاختبار اللاكتوباكيلوس الخالية من الخلايا الفائقة (LCFS) هي خيار أفضل من الاختبار في الطبقات الأحادية ثنائية الأبعاد ، خاصة وأن L. fermentum يمكن أن تنتج تأثيرات مضادة للسرطان داخل الأمعاء. تم تحديد L. fermentum supernatant لامتلاك زيادة الآثار المضادة للتكاثر ضد العديد من خلايا سرطان القولون والمستقيم (CRC) في ظروف الثقافة ثلاثية الأبعاد. ومن المثير للاهتمام أن هذه الآثار كانت مرتبطة بقوة بنموذج الثقافة، مما يدل على القدرة الملحوظة ل. فيمرخوم للحث على موت الخلايا السرطانية. تم إنشاء كرويات مستقرة من CRCs متنوعة (خلايا سرطان القولون والمستقيم) باستخدام البروتوكول المعروض أدناه. هذا البروتوكول لتوليد كرويد 3D هو توفير الوقت وفعالة من حيث التكلفة. وقد تم تطوير هذا النظام للتحقيق بسهولة في الآثار المضادة للسرطان من LCFS في أنواع متعددة من كرويدات لجنة حقوق الطفل. كما هو متوقع، عالجت كرويات CRC مع LCFS موت الخلايا المستحث بقوة خلال التجربة وأعربت عن علامات جزيئية محددة للخلايا المبرمج كما تم تحليلها من قبل qRT-PCR، النشاف الغربي، وتحليل FACS. لذلك، هذه الطريقة قيمة لاستكشاف صلاحية الخلايا وتقييم فعالية الأدوية المضادة للسرطان.

Introduction

البروبيوتيك هي الكائنات الحية الدقيقة الأكثر فائدة في القناة الهضمية التي تحسن التوازن المناعي واستقلاب الطاقة المضيف1. البروبيوتيك من اللاكتوباكيلوس وبيفيدوباكتريا هي الأكثر تقدما من نوعها وجدت في الأمعاء2،3. وقد أظهرت التحقيقات السابقة أن Lactobacillus له آثار مثبطة ومكافحة الانتشار على العديد من أنواع السرطان, بما في ذلك سرطان القولون والمستقيم4. وعلاوة على ذلك، البروبيوتيك منع أمراض التهاب الأمعاء، ومرض كرون، والتهاب القولون التقرحي5،6. ومع ذلك، أجريت معظم الدراسات مع البروبيوتيك في أحادية الأبعاد ثنائية الأبعاد (2D) التي تزرع على الأسطح الصلبة.

تفتقر أنظمة الثقافة الاصطناعية إلى السمات البيئية، وهو أمر غير طبيعي بالنسبة للخلايا السرطانية. للتغلب على هذا القيد، تم تطوير أنظمة ثقافة ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد)7و8. تظهر الخلايا السرطانية في 3D تحسينات من حيث الآليات البيولوجية الأساسية ، مثل صلاحية الخلية ، والانتشار ، والمورفولوجيا ، والاتصالات الخلوية ، وحساسية الدواء ، وفيأهميةالجسم الحي 9،10. وعلاوة على ذلك، يتم إجراء كرويدات من أنواع متعددة الخلايا من سرطان القولون والمستقيم وتعتمد على التفاعلات الخلية الخلية ومصفوفة خارج الخلية (ECM)11. وقد ذكرت دراستنا السابقة أن الخلايا بروبيوتيك خالية من الخلايا supernatant (CFS) المنتجة باستخدام اللاكتوباكيلوس fermentum أظهرت آثار مضادة للسرطان على الثقافات 3D من سرطان القولون والمستقيم (CRC) خلايا12. اقترحنا أن لجنة الأمن الغذائي العالمي هو استراتيجية بديلة مناسبة لاختبار آثار بروبيوتيك على كرويدات 3D12.

هنا, نقدم نهجا يمكن أن تستوعب أنواع متعددة الخلايا من سرطان القولون والمستقيم 3D لتحليل الآثار العلاجية للخلايا بروبيوتيك supernatant خالية (CFS) على العديد من أنظمة محاكاة سرطان القولون والمستقيم 3D. توفر هذه الطريقة وسيلة لتحليل الآثار ذات الصلة بروبيوتيك ومكافحة السرطان في المختبر.

Protocol

1. زراعة الخلايا البكتيرية وإعداد اللاكتوباكيلوس الخالية من الخلايا الفائقة (LCFS)

ملاحظة: يتم إجراء الخطوات 1.2 - 1.9 في غرفة اللاهوائية.

  1. إعداد لوحة أجار MRS ومرق تحتوي على L-السيستين وتعقيمها عن طريق الالاستعباد التلقائي.
  2. قبل احتضان لوحة أجار MRS في H2 غرفة اللاهوائية الحفاظ على 37 درجة مئوية مع الأكسجين 20 ppm.
  3. ذوبان اللاكتوباكيلوس الأسهم البكتيرية وتطعيم لوحة أجار مع الثقافة البكتيرية (الشكل 1A (1)).
  4. احتضان البكتيريا لمدة 2-3 أيام في H2 غرفة اللاهوائية في 37 درجة مئوية و 20 صفحة في الدقيقة الأكسجين حتى يتم الحصول على مستعمرات بكتيرية واحدة.
  5. غسل وتجفيف نوع Hungate أنبوب الثقافة اللاهوائية. أوتوكلاف أنبوب الثقافة في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  6. ثم احتضان الأنبوب في H2 غرفة اللاهوائية في 37 درجة مئوية و 20 ppm الأكسجين لإزالة الأكسجين.
  7. مكان 2 - 3 مل من مرق MRS في الأنبوب. ختم أنبوب مع سدادة مطاطية بوتيل والمسمار الغطاء.
  8. الحصول على مستعمرة واحدة مع حلقة ووضعها في أنبوب الثقافة 1.5 مل مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1x. (الشكل1A (2)).
  9. تعليق المستعمرة باستخدام حقنة 1 مل (الشكل 1A (iii)). القيام بذلك عن طريق, إدراج إبرة من حقنة 1 مل في وسط غطاء أنبوب, قرصنة مستعمرة علقت ومن ثم إعادة تعليق مرة أخرى في وسائل الإعلام مرق MRS. (الشكل 1A (4)).
  10. احتضان وسائل الإعلام مرق MRS في حاضنة شاكر لمدة 2 أيام (37 درجة مئوية، 5٪ CO2، 200 دورة في الدقيقة).
  11. قياس الكثافة البصرية (OD) باستخدام مطياف لرصد منحنيات النمو البكتيري حتى يصل الامتصاص في OD620 إلى 2.0.
  12. فصل الكريات البكتيرية ووسائل الإعلام مشروطة عن طريق الطرد المركزي في 1000 × ز لمدة 15 دقيقة. غسل الكريات البكتيرية التي تم جمعها مع برنامج تلفزيوني 1x وإعادة الإنفاق في 4 مل من RPMI 1640 تكملها مع 10٪ مصل البقر الجنين. لا تقم بتضمين أي مضادات حيوية في الوسط.
  13. الحفاظ على الكريات البكتيرية في RPMI واحتضان في حاضنة شاكر لمدة 4 ساعة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 بسرعة 100 دورة في الدقيقة.
  14. لإعداد بروبيوتيك supernatant, إزالة بيليه البكتيرية عن طريق الطرد المركزي في 1000 x ز, لمدة 15 دقيقة في 4 °C. قم بتصفية المسخ الفائق المسترد باستخدام فلتر 0.22 ميكرومتر وتخزينه عند −80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2. جيل من كرويدات

  1. إعداد خطوط خلايا سرطان القولون والمستقيم
    1. تنمو DLD-1، HT-29، وخطوط خلايا WiDr كطبقات أحادية حتى 70-80٪ التقاء واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية في حاضنة5٪ CO 2 (متوسط النمو: RPMI تحتوي على 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) و 1٪ البنسلين-streptomycin).
    2. للخلايا التي تزرع في طبق بيتري 100 ملم، وغسل لوحة مرتين مع 4 مل من برنامج تلفزيوني 1x. إضافة 1 مل من 0.25٪ تريبسين-EDTA واحتضان طبق بيتري لمدة 2 دقيقة في 37 درجة مئوية في حاضنة5٪ CO 2 لتفكك الخلايا.
    3. بعد الحضانة، تحقق من تفكك الخلية تحت المجهر وتحييد التريبسين-EDTA مع 5 مل من متوسط النمو.
    4. نقل الخلايا المفككة إلى أنبوب مخروطي 15 مل وطارد مركزي لمدة 3 دقائق عند 300 × ز.
    5. تجاهل supernatant و resuspend بلطف مع 3 مل من وسائل الإعلام النمو.
    6. عد الخلايا مع تريبان الأزرق لتحديد الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس الدم. (الشكل 1B (1))
  2. تشكيل كروي
    1. في أنبوب مخروطي 15 مل، تمييع الخلايا من 2.1.5 للحصول على 1- 2 × 105 خلايا / مل (الشكل 1B (2))
    2. إضافة تركيز النهائي من 0.6٪ ميثيلسليلوز إلى تعليق الخلية ونقل الخلايا المخففة إلى خزان معقم.
      ملاحظة: لكل خط الخلية، يجب أن يتم إعادة كمية الميثيلسليلوز اللازمة وتحديد وفقا لذلك.
    3. استخدام ماصة متعددة القنوات للاستغناء عن 200 ميكرولتر من الخلايا إلى كل بئر من مرفق منخفض جدا 96 جيدا جولة أسفل لوحة صغيرة. (الشكل 1B (iii))
    4. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة5٪ لمدة 24 - 36 ساعة.
    5. بعد 24 - 36 ساعة، مراقبة لوحة تحت المجهر الخفيف لضمان تشكيل كروية.

3. علاج الخلايا السرطانية ثلاثية الأبعاد مع LCFS

  1. إنشاء كرويدات كما هو موضح في الخطوتين 2 و 3.
  2. قبل إجراء علاج LCFS، قم بإذابة LCFS المجمدة في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10 -20 دقيقة.
  3. تلقيح حل أسهم LCFS في وسيط نمو. تخفيف تسلسلي إلى 25٪، 12.5٪، و 6٪ في متوسط النمو (أي، 25٪ LCFS = 150 ميكرولتر من متوسط النمو + 50 ميكرولتر من LCFS).
  4. إخراج لوحة ثقافة الخلية التي تحتوي على كرويدات من الحاضنة وإزالة أكبر قدر ممكن من متوسط النمو من كل بئر باستخدام ماصة 200 ميكرولتر.
  5. أضف وسائط النمو مع LCFS على الخلايا واحتضن عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون5٪ لمدة 24 - 48 ساعة.
    ملاحظة: يعتمد الحجم الذي سيتم استخدامه على حجم اللوحة كما يلي: 2 مل لصفائح زراعة الخلايا ذات 6 آبار؛ و 2 مل للوحة زراعة الخلايا ذات الخلايا 6-well; 200 ميكرولتر ل 96 لوحة ثقافة خلايا جيدة.

4. صلاحية الخلية للشفرات

  1. إعداد 8 - 10 كرويدات سرطان القولون والمستقيم المعالجة LCFS في لوحات متعددة الآبار مبهمة الجدران (يتم إجراء مقايسات قابلية بقاء الخلية 48 ساعة بعد علاج LCFS).
  2. إذابة كاشف قابلية الخلية (راجع جدول المواد)عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لليلة واحدة.
  3. توازن الكاشف قدرة الخلية على البقاء لدرجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
  4. قبل إجراء الفحص، قم بإزالة 50٪ من وسائط النمو من كرويدات.
  5. إضافة 100 ميكرولتر من كاشف قدرة الخلية على البقاء إلى كل بئر.
    ملاحظة: يعتمد الحجم الذي سيتم استخدامه على حجم اللوحة كما يلي: 100 ميكرولتر لألواح زراعة الخلايا ذات 96 بئرا.
  6. خلط الكاشف بقوة لمدة 5 دقائق لتعزيز تحلل الخلية.
  7. حضانة لمدة 30 دقيقة - 2 ساعة في 37 درجة مئوية.
  8. سجل التألق.

5. تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي للشفرات

  1. لكل حالة، وإعداد 10-15 كروية في أنبوب 2 مل والطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 400 × ز.
  2. تجاهل supernatant وغسل كرويدات مرتين في 1 مل من الجليد الباردة 1x PBS.
    ملاحظة: تجنب الطرد المركزي، دع كرويدات تستقر.
  3. يستنشق أكبر قدر ممكن من برنامج تلفزيوني 1x وعزل الجيش الملكي النيبالي باستخدام مجموعة متاحة تجاريا.
  4. توليف cDNA من 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي باستخدام عدة المتاحة تجاريا وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  5. إعداد مزيج رئيسي لتشغيل كافة العينات في ثلاثية (انظر الجدول 1 والجدول 2).
  6. قم بإجراء التضخيم في 20 ميكرولتر من المزيج الرئيسي للقالب في كل لوحة qPCR بشكل جيد.
  7. مزيج ردود الفعل بشكل جيد وتدور إذا لزم الأمر.
  8. تشغيل العينات وفقا لتوصيات الشركة المصنعة للآلة (الجدول 3).

6. النشاف الغربي من كرويدات

ملاحظة: عند جمع كرويدات، استخدم ماصة 200 ميكرولتر وقطع نهاية النصائح لتجنب إزعاج هيكلها.

  1. لكل حالة، وإعداد 30-40 كروية في أنبوب 2 مل.
  2. ضع الأنبوب على الجليد ودع كرويدات تستقر في الجزء السفلي من أنبوب 2 مل.
  3. تجاهل supernatant وغسل كرويدات مرتين في 1 مل الجليد الباردة 1x PBS
    ملاحظة: تجنب الطرد المركزي، دع كرويدات تستقر.
  4. اسبيرات أكبر قدر ممكن من برنامج تلفزيوني 1x وإضافة RIPA العازلة مع كوكتيل مثبط بروتيز (10 كرويدات = 30 ميكرولتر من العازلة RIPA).
  5. Lyse الخلايا عن طريق pipetting صعودا وهبوطا وأداء سونيكيشن لمدة 30 ق مع 30 ق من يستريح على الجليد لمدة 10 دورات.
  6. الطرد المركزي lysates البروتين في 15000 س غ لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  7. تحديد تركيز البروتين لكل خلية lysate.
  8. قبل التحميل، قم بغلي كل خلية في عينة عازلة عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  9. تحميل كميات متساوية من البروتين في آبار هلام SDS-PAGE وتشغيل هلام لمدة 1- 2 ساعة في 100 V.
  10. نقل البروتين من الجل إلى غشاء PVDF.
  11. بعد نقل، منع الغشاء لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة باستخدام العازلة حجب (5٪ الحليب الخالي من الدسم + TBS مع 0.05٪ توين-20).
  12. احتضان الغشاء مع 1:1,000 التخفيف من الأجسام المضادة الأولية (الجدول 4) في TBST 1x مع 5٪ BSA العازلة في 4 °C بين عشية وضحاها.
  13. غسل الغشاء ثلاث مرات مع TBST، 15 دقيقة لكل غسل.
  14. احتضان الغشاء مع 1:2,500 تمييع الأجسام المضادة الثانوية في العازلة حجب في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة (انظر جدول المواد).
  15. غسل الغشاء ثلاث مرات مع TBST، 15 دقيقة لكل غسل.
  16. إعداد الغشاء للكشف HRP مع ركيزة chemiluminescent.
  17. الحصول على صور تشيميلومينيسنت.

7. بروبيديوم يوديد (PI) تلطيخ كرويدات

  1. إعداد 5-10 كرويات كما هو موضح في الخطوة 4.1 ووضع كرويدات في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  2. تمييع 1 ملغ / مل من الأسهم PI 1:100 في برنامج تلفزيوني 1x.
  3. إزالة 50٪ من المتوسط من كل بئر من لوحة 96 جيدا.
  4. أضف 100 ميكرولتر من محلول PI لكل بئر وضع الآبار في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 10 - 15 دقيقة.
  5. اغسل محلول PI باستخدام برنامج تلفزيوني 1x.
  6. إضافة 200 ميكرولتر من متوسط النمو واتخاذ صورة باستخدام المجهر مضان. تحليل كثافة الفلورية باستخدام صورة J للحصول على عدد صلاحية كروية.

8. تحليل FACS للشفرات

  1. إنشاء كرويات كما هو موضح سابقا.
  2. لكل حالة، قم بإعداد 30-40 كروية في أنبوب FACS وأجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق عند 400 × ز وRT.
  3. اسبيرات supernatant وغسل كرويدات في 3 مل من برنامج تلفزيوني 1x، ثم الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 3 دقائق في 4 درجة مئوية.
  4. أسبيرات supernatant وإضافة 200 ميكرولتر من 0.25٪ تريبسين-EDTA، ثم احتضان في RT لمدة 2-3 دقائق.
    ملاحظة: يعتمد وقت الحضانة على حجم كروية ونوع الخلية.
  5. إضافة 1 مل من العازلة FACS وتفكيك بلطف كرويدات باستخدام ماصة 200 ميكرولتر.
  6. الطرد المركزي الخلايا المفككة في 400 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
    ملاحظة: FACS المخزن المؤقت = 1x PBS + 2.5٪ FBS، تمت تصفيته باستخدام مرشح أعلى 0.22 ميكرومتر.
  7. تجاهل supernatant وإضافة 7-AAD/Annexin V كاشف (7AAD (5 ميكرولتر)، Annexin V (5 ميكرولتر)/عينة).
  8. دوامة بلطف الخلايا واحتضان لمدة 13 -30 دقيقة في RT في الظلام.
  9. إضافة 500 ميكرولتر من العازلة FACS وتصفية الخلايا باستخدام أنابيب اختبار البوليسترين مخروطية لإزالة الخلايا المجمعة.
  10. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق.
  11. إضافة 500 ميكرولتر من الملحق الخامس العازلة ملزمة لكل أنبوب وإعادة الإنفاق.
  12. تحليل باستخدام مقياس التدفق الخلوي.

النتائج

نحن نصف بروتوكول الحصول على كرويدات من خطوط خلايا سرطان القولون والمستقيم المتنوعة. وكان مطلوبا مكملات مع ميثيلسليلوز لتوليد كرويدات. كما نقدم طريقة لإعداد LCFS وتقديم نموذج لدراسة العلاقة بين البروبيوتيك وسرطان القولون والمستقيم. يتم توضيح تشكيل كروي وبروتوكولات إعداد LCFS تخطيطيا في

Discussion

البيئة الدقيقة للأنسجة، بما في ذلك الخلايا المجاورة والمصفوفة خارج الخلية (ECM)، أمر أساسي لتوليد الأنسجة وحاسمة في السيطرة على نمو الخلايا وتطوير الأنسجة13. ومع ذلك ، فإن الثقافات 2D لها العديد من العيوب ، مثل تعطيل التفاعلات الخلوية ، وكذلك التعديلات في مورفولوجيا الخلايا ، وا...

Disclosures

ولا يملك صاحبا البلاغ أي إفصاحات مالية ذات صلة.

Acknowledgements

وقد دعم هذا البحث "وضع معايير قياس الكيمياء والإشعاع"، ورقم المنحة KRISS-2020-GP2020-0003، و"تطوير معايير القياس والتكنولوجيا للمواد الحيوية والتقارب الطبي"، ورقم المنحة KRISS-2020-GP2020-0004، بتمويل من المعهد الكوري للبحوث للمعايير والعلوم. كما تم دعم هذا البحث من قبل وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات (MSIT)، والمؤسسة الوطنية للبحوث في كوريا (NRF-2019M3A9F3065868)، ووزارة الصحة والرعاية الاجتماعية (MOHW)، والمعهد الكوري لتنمية الصناعة الصحية (KHIDI، HI20C0558)، ووزارة التجارة والصناعة والطاقة (MOTIE)، ومعهد التقييم الكوري للتكنولوجيا الصناعية (KEIT، 20009350). معرف ORCID (هي مين يو: 0000-0002-5951-2137; دوكجين كانغ: 0000-0002-5924-9674; سيل كيم: 0000-0003-3465-7118; جو أون لي: 0000-0002-2495-1439; جينا لي: 0000-0002-3661-3701). نشكر تشانغ وو بارك للمساعدة في التجارب.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments

10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 15-well, 15 µl		Biorad4561036Pkg of 10
Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive FilmThermo Fisher Scientific4311971100 covers
10x transfer bufferIntronIBS-BT031A1 L
10X Tris-Glycine (W/SDS)IntronIBS-BT0141 L
Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube, Polypropylene, Clear, Nonsterile, 500 Tubes/Pack, 10 Packs/CaseCorningSCT-200-C500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case
BD Difco Bacto AgarBD214010500 g
BD Difco Lactobacilli MRS BrothBDDF0881-17-5500 g
CellTiter-Glo 3D Cell viability assayPromegaG9681100μl/assay in 96-well plates
Complete Protease Inhibitor CocktailSigma-Aldrich11697498001vial of 20 tablets
Corning Phosphate-Buffered Saline, 1X without calcium and magnesium, PH 7.4 ± 0.1Corning21-040-CV500 mL
EMD Millipore Immobilon-P PVDF Transfer Membranesfisher ScientificIPVH0001026.5cm x 3.75m roll; Pore Size: 0.45um
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap CapCorning35223525/Pack, 500/Case
Fetal Bovine Serum, certified, US originThermo Fisher Scientific16000044500 mL
iScript cDNA Synthesis Kit, 25 x 20 µl rxns #1708890Biorad170889025 x 20 µL rxns
iTaq Universal SYBR Green SupermixBiorad17251215 x 1 mL
Lactobacillus fermentumKorean Collection for Type CulturesKCTC 3112
L-Cysteine hydrochloride monohydrateSigma-AldrichC6852-25G25 g
Methyl Cellulose (3500-5600mPa·s, 2% in Water at 20°C)TCIM0185500 g
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mLApplied Biosystems434690620 plates
Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilizedMilliporeSLGS033SB250
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AADBiolegend640934100 tests
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122100 mL
Propidium IodideIntrogenP1304MP100 mg
RIPA Lysis and Extraction BufferThermo Fisher Scientific89901250 mL
RNeasy Mini Kit (250)Qiagen74106250
RPMI-1640Gibco11875-119500 mL
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redThermo Fisher Scientific25200056100 mL
Name of Materials/Equipment/SoftwareCompanyCatalog NumberComments/Description
anti - p-IκBα (B-9)Santa cruzesc-8404200 µg/mL
anti-BclxL (H-5)Santa cruzesc-8392200 µg/mL
anti-PARP 1 (C2-10)Santa cruzesc-5364350 µl ascites
anti-β-actin (C4)Santa cruzesc-47778200 µg/mL
BD FACSVerseBD BiosciencesSan Diego, CA, USA
Synergy HTX Multi-Mode Microplate ReaderBioTS1LFA
CO2 incubatorThermo fisherHERAcell 150i
Conical tube 15 mlSPL50015
Conical tube 50 mlSPL50050
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well PlateSigma-AldrichCLS7007
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well PlateSigma-AldrichCLS3471
Costar 50 mL Reagent Reservoirs, 5/Bag, SterileCostar4870
Countess Cell Counting Chamber SlidesThermofisherC10228
Countess II FL Automated Cell CounterinvitrogenAMQAF1000
EnSpire Multimode ReaderPerkin ElmerEnspire 2300
Eppendorf Research Plus Multi Channel Pipette, 8-channelEppendorf3122000051
FlowJo softwareTreeStarAshland, OR, USA
Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson immunoresearch115-035-0621.5 mL
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson immunoresearch111-035-1442.0 mL
GraphPad Prism 5GraphPad SoftwareInc., San Diego, CA, USA
ImageJNIH
ImageQuant LAS 4000 miniFujifilmTokyo, Japan
Incubated shakerLab companionSIF-6000R
Multi Gauge Ver. 3.0,FujifilmTokyo, Japan
Optical density (OD)LAMBDA UV/Vis SpectrophotometersPerkin ElmerWaltham, MA, USA
Phase-contrast microscopeOlympusTokyo, Japan
SPL microcentrifuge tube 1.5mLSPL60015
SPL Multi Channel Reservoirs, 12-Chs, PS, SterileSPL21012
StepOnePlus Real-Time PCR systemThermo Fisher ScientificWaltham, MA, USA
Vibra-Cell Ultrasonic Liquid ProcessorsSONICS-vibra cellVC 505500 Watt ultrasonic processor
Vinyl Anaerobic ChamberCOY LAB PRODUCTS

References

  1. Bron, P. A., Van Baarlen, P., Kleerebezem, M. Emerging molecular insights into the interaction between probiotics and the host intestinal mucosa. Nature Reviews Microbiology. 10 (1), 66-78 (2012).
  2. Ruiz, L., Delgado, S., Ruas-Madiedo, P., Sánchez, B., Margolles, A. Bifidobacteria and their molecular communication with the immune system. Frontiers in Microbiology. 8, 1-9 (2017).
  3. Sanders, M. E., Merenstein, D. J., Reid, G., Gibson, G. R., Rastall, R. A. Probiotics and prebiotics in intestinal health and disease: from biology to the clinic. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (10), 605-616 (2019).
  4. Pandey, K. R., Naik, S. R., Vakil, B. V. Probiotics, prebiotics and synbiotics- a review. Journal of Food Science and Technology. 52 (12), 7577-7587 (2015).
  5. Harish, K., Varghese, T. Probiotics in humans-evidence based review. Calicut Medical Journal. 4 (4), 3 (2006).
  6. Routy, B., et al. The gut microbiota influences anticancer immunosurveillance and general health. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (6), 382-396 (2018).
  7. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. Most of the cell-based data-harvesting efforts that drive the integration of cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  8. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  9. Jong, B. K. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 365-377 (2005).
  10. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).
  11. Anton, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: A breakthrough in vivo. International Journal of Molecular Sciences. 16 (3), 5517-5527 (2015).
  12. Lee, J. E., et al. Characterization of the Anti-Cancer Activity of the Probiotic Bacterium Lactobacillus fermentum Using 2D vs. 3D Culture in Colorectal Cancer Cells. Biomolecules. 9 (10), 557 (2019).
  13. Koledova, Z. 3D cell culture: An introduction. Methods in Molecular Biology. 1612, (2017).
  14. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  15. Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 1-14 (2018).
  16. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: The missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  17. Mazzocchi, A. R., Rajan, S. A. P., Votanopoulos, K. I., Hall, A. R., Skardal, A. In vitro patient-derived 3D mesothelioma tumor organoids facilitate patient-centric therapeutic screening. Scientific Reports. 8, 2886 (2018).
  18. Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
  19. Thirumala, S., Gimble, J., Devireddy, R. Methylcellulose Based Thermally Reversible Hydrogel System for Tissue Engineering Applications. Cells. 2 (3), 460-475 (2013).
  20. Chandrashekran, A., et al. Methylcellulose as a scaffold in the culture of liver-organoids for the potential of treating acute liver failure. Cell and Gene Therapy Insights. 4 (11), 1087-1103 (2018).
  21. Lee, W., Park, J. 3D patterned stem cell differentiation using thermo-responsive methylcellulose hydrogel molds. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
  22. Fan, H., Demirci, U., Chen, P. Emerging organoid models: Leaping forward in cancer research. Journal of Hematology and Oncology. 12 (1), 1-10 (2019).
  23. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  24. Liou, C. S., et al. A Metabolic Pathway for Activation of Dietary Glucosinolates by a Human Gut Symbiont. Cell. 180 (4), 717-728 (2020).
  25. Sherwin, E., Bordenstein, S. R., Quinn, J. L., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Microbiota and the social brain. Science. 366 (6465), 2016 (2019).
  26. Honda, K., Littman, D. R. The microbiota in adaptive immune homeostasis and disease. Nature. 535 (7610), 75-84 (2016).
  27. Bárcena, C., et al. Healthspan and lifespan extension by fecal microbiota transplantation into progeroid mice. Nature Medicine. 25 (8), 1234-1242 (2019).
  28. Michalovich, D., et al. Obesity and disease severity magnify disturbed microbiome-immune interactions in asthma patients. Nature Communications. 10, 5711 (2019).
  29. Ansaldo, E., et al. Akkermansia muciniphila induces intestinal adaptive immune responses during homeostasis. Science. 364 (6446), 1179-1184 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

160fermentum3DLactobacillus LCFS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved