הערכת מוות תאים באמצעות Supernatant ללא תאים של פרוביוטיקה בתרביות כדוריות תלת מימדיות של תאים סרטניים המעי הגס

Summary

כאן מוצגות שיטות כדי להבין השפעות אנטי סרטניות של לקטובצילוס ללא תאי supernatant (LCFS). קווי תאים סרטניים המעי הגס מראים מקרי מוות של תאים כאשר מטופלים עם LCFS בתרבויות תלת-ממד. תהליך יצירת כדוריות יכול להיות ממוטב בהתאם לפיגומים ושיטות הניתוח המוצגות שימושיות להערכת מסלולי האיתות המעורבים.

Abstract

כתב יד זה מתאר פרוטוקול להערכת מקרי מוות של תאים סרטניים בפרואידים תלת ממדיים (תלת-ממדיים) של תאים סרטניים רב תאיים באמצעות מזונות-על מתרבית תאי התסיסה לקטובצילוס , הנחשבים לתרבויות פרוביוטיקה. השימוש בתרביות תלת-ממד לבדיקת תחליב-על נטול תאי לקטובצילוס (LCFS) הם אפשרות טובה יותר מבדיקה במונו-שכבתיים דו-ממדיים, במיוחד לאור העובדה שתסיסה של L. יכולה לייצר השפעות אנטי-סרטניות במעיים. L. תסיסה supernatant זוהה להחזיק השפעות אנטי-שגשוג מוגבר נגד מספר תאים סרטן המעי הגס (CRC) בתנאי תרבית 3D. מעניין, תופעות אלה היו קשורים מאוד למודל התרבות, הדגמת היכולת הבולטת של L. תסיסה לגרום למוות תאים סרטניים. כדוריות יציבות נוצרו מ- CRCs מגוונים (תאים סרטניים המעי הגס) באמצעות הפרוטוקול המוצג להלן. פרוטוקול זה של יצירת כדורי תלת-ממדי הוא חיסכון בזמן וחסכוני. מערכת זו פותחה כדי לחקור בקלות את ההשפעות נגד סרטן של LCFS בסוגים מרובים של כדורי CRC. כצפוי, כדורי CRC שטופלו ב- LCFS גרמו מאוד למוות תאי במהלך הניסוי וביעו סמנים מולקולריים ספציפיים אפופטוזיס כפי שניתחו על ידי qRT-PCR, סופג מערבי, וניתוח FACS. לכן, שיטה זו היא בעלת ערך לחקר הכדאיות של התאים והערכת היעילות של תרופות נגד סרטן.

Introduction

פרוביוטיקה הם המיקרואורגניזמים היתרון ביותר במעיים שמשפר את ההומוסטזיס החיסוני ואת חילוף החומרים של^{האנרגיה המארחת 1}. פרוביוטיקה מ לקטובצילוס וביפידובקטריום הם המתקדמים ביותר מסוגו שנמצאו במעי^2,3. חקירות קודמות הראו כי לקטובצילוס יש השפעות מעכבות ואנטי-פרוliferative על מספר סוגי סרטן, כולל סרטן המעי הגס⁴. יתר על כן, פרוביוטיקה למנוע מחלות מעי דלקתיות, מחלת קרוהן, קוליטיס כיבית^5,6. עם זאת, רוב המחקרים עם פרוביוטיקה בוצעו דו מימדי (2D) monolayers שגדלים על משטחים מוצקים.

מערכות תרבית מלאכותית חסרות תכונות סביבתיות, שאינן טבעיות לתאים סרטניים. כדי להתגבר על מגבלה זו, מערכות תרבות תלת מימדיות (3D) פותחו^7,8. תאים סרטניים בתלת-ממד מראים שיפורים במונחים של מנגנונים ביולוגיים בסיסיים, כגון כדאיות תאים, התפשטות, מורפולוגיה, תקשורת תא-תאים, רגישות לתרופות, ורלוונטיות vivo^9,10. יתר על כן, כדורי עשויים מסוגים רב תאיים של סרטן המעי הגס ותלויים באינטראקציות בין תאים לבין המטריצה החוץ תאית (ECM)¹¹. המחקר הקודם שלנו דיווח כי פרוביוטיקה תאים ללא תאים supernatant (CFS) המיוצר באמצעות תסיסה לקטובצילוס הראה השפעות אנטי סרטניות על תרביות תלת-ממדיות של סרטן המעי הגס (CRC) תאים¹². הצענו כי CFS היא אסטרטגיה חלופית מתאימה לבדיקת השפעות פרוביוטיות על כדורי תלת מימד¹².

כאן, אנו מציגים גישה שיכולה להכיל סוגים רב תאיים של סרטן המעי הגס 3D לניתוח ההשפעות הטיפוליות של supernatant ללא תאים פרוביוטיים (CFS) על מספר מערכות חיקוי סרטן המעי הגס 3D. שיטה זו מספקת אמצעי לניתוח של השפעות פרוביוטיקה ואנטי סרטן הקשורות במבחנה.

Protocol

1. תרביות תאים חיידקיים והכנת לבצילוס סופרנטנט ללא תאים (LCFS)

הערה: שלבים 1.2 – 1.9 מתבצעים בחדר אנאירובי.

1. הכן צלחת אגר MRS ומרק המכיל L-ציסטאין ולחטא על ידי autoclaving.
2. לפני הדגירה צלחת אגר MRS בתא אנאירובי H₂ מתוחזק ב 37 °C (50 °F) עם חמצן 20 ppm.
3. להפשיר ציר חיידקי לקטובצילוס ולחסן את צלחת אגר עם תרבית החיידקים(איור 1A (i).
4. דגירה חיידקים במשך 2 - 3 ימים בתא אנאירובי H₂ ב 37 °C (7 °F) ו 20 ppm חמצן עד מושבות חיידקים בודדים מתקבלים.
5. לשטוף ולייבש את צינור תרבות אנרובי סוג Hungate. תאט-סטוב את צינור התרבות ב-121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
6. ואז לדגור על הצינור בתא אנאירובי H₂ ב 37 °C (7 °F) ו 20 ppm חמצן כדי להסיר חמצן.
7. מניחים 2 - 3 מ"ל של מרק MRS לתוך הצינור. לאטום את הצינור עם פקק גומי בוטיל ולברג את הכובע.
8. להשיג מושבה אחת עם לולאה למקם אותו לתוך צינור תרבות 1.5 מ"ל עם 500 μL של 1x PBS. (איור 1A (ii).
9. השעיית המושבה באמצעות מזרק של 1 מ"ל (איור 1A (iii). לעשות זאת על ידי החדרת המחט של מזרק 1 mL במרכז מכסה הצינור, שאיפה המושבה המושעה ולאחר מכן resuspending אותו בחזרה למדיית מרק MRS. (איור 1A (iv).
10. לדגור על מדיית מרק MRS באינקובטור שייקר במשך יומיים (37 °C (37 °C), 5% CO₂, 200 סל"ד).
11. מדוד את הצפיפות האופטית (OD) באמצעות ספקטרופוטומטר לניטור עקומות צמיחה חיידקיות עד שהספיגה ב- OD₆₂₀ תגיע ל-2.0.
12. הפרד את כדורי החיידקים ואת המדיה המותנית על ידי צנטריפוגה ב 1,000 x g במשך 15 דקות. לשטוף את כדורי חיידקים שנאספו עם 1x PBS ו resuspend ב 4 מ"ל של RPMI 1640 בתוספת 10% סרום בקר עוברי. אין לכלול אנטיביוטיקה במדיום.
13. לשמור על כדורי חיידקים ב RPMI ודגרה באינקובטור שייקר עבור 4 שעות ב 37 °C (5% CO₂ במהירות של 100 סל"ד.
14. להכנת supernatant פרוביוטיקה, להסיר את הכדור החיידקי באמצעות צנטריפוגה ב 1000 x גרם, במשך 15 דקות ב 4 °C (70 °F). מסנן סטרילי את supernatant התאושש באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב −80 °C (50 °F) עד השימוש.

2. דור כדורי

1. הכנת קווי תאים סרטניים המעי הגס
   1. לגדל DLD-1, HT-29, וקווי תא WiDr כמו monolayers עד 70-80% conהשפעה ולדגירה את הצלחת ב 37 °C בחממה_{2 CO 5%} (בינוני צמיחה: RPMI המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין).
   2. עבור תאים הגדלים בצלחת פטרי 100 מ"מ, לשטוף את הצלחת פעמיים עם 4 מ"ל של 1x PBS. הוסף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA ודגרה צלחת פטרי במשך 2 דקות ב 37 °C בחממה_5% CO 2 כדי לנתק את התאים.
   3. לאחר הדגירה, לבדוק את ניתוק התא תחת מיקרוסקופ ולנטרל טריפסין-EDTA עם 5 מ"ל של מדיום צמיחה.
   4. העבר את התאים המנותקים לצינור חרוט 15 מ"ל וצנטריפוגה במשך 3 דקות ב 300 x g.
   5. השלך את supernatant ו resuspend בעדינות עם 3 מ"ל של מדיה צמיחה.
   6. לספור את התאים עם כחול טריפן כדי לקבוע תאים קיימא באמצעות hemocytometer. (איור 1B (i))
2. היווצרות כדורית
   1. בצינור חרוט 15 מ"ל, לדלל את התאים מ 2.1.5 כדי להשיג 1 - 2 x 10⁵ תאים / מ"ל (איור 1B (ii))
   2. הוסף ריכוז סופי של 0.6% מתילצלולוז להשעיית התא והעבר את התאים המדוללים למאגר סטרילי.
      הערה: עבור כל קו תא, יש לצית את כמות המתילצלולוז הדרושה ולהיקבע בהתאם.
   3. השתמש pipette multichannel כדי לחלק 200 μL של תאים לכל באר של חיבור אולטרה נמוך 96-היטב מיקרו-לוח תחתון עגול. (איור 1B (iii))
   4. לדגור את הצלחת ב 37 °C בחממה_5% CO 2 עבור 24 - 36 שעות.
   5. לאחר 24 - 36 שעות, התבונן בלוח תחת מיקרוסקופ אור כדי להבטיח היווצרות כדורית.

3. טיפול בתאי סרטן המעי הגס תלת-ממדיים עם LCFS

1. צור כדוריות כמתואר בשלבים 2 ו -3.
2. לפני ביצוע הטיפול LCFS, להפשיר את LCFS קפוא בטמפרטורת החדר (RT) במשך 10 - 20 דקות.
3. לחסן את פתרון מניית LCFS למדיום צמיחה. לדלל באופן סדרתי ל 25%, 12.5%, ו 6% במדיום הצמיחה (כלומר, 25% LCFS = 150 μL של בינוני צמיחה + 50 μL של LCFS).
4. להוציא את צלחת תרבית התא המכיל כדורי מן האינקובטור ולהסיר כמה שיותר של מדיום הצמיחה ככל האפשר מכל באר באמצעות 200 μL pipette.
5. הוסף את מדיה הצמיחה עם LCFS על התאים ודגרה ב 37 °C בחממה_{CO 2 5%} עבור 24 - 48 שעות.
   הערה: אמצעי האחסון שישמש יהיה תלוי בגודל הצלחת כדלקמן: 2 מ"ל עבור לוחות תרבית תאים 6-well; 200 μL עבור 96-טוב לוחות תרבית התא.

4. כדאיות תאים עבור כדורי

1. הכן 8 - 10 כדורי סרטן המעי הגס שטופלו ב- LCFS בלוחות רב-באריים אטומים (בוצעו 48 שעות לאחר טיפול LCFS).
2. להפשיר את ריאגנט הכדאיות התא (ראה טבלה של חומרים) ב 4 °C (75 °F) ללילה.
3. יש לתעד את ריאגנט הכדאיות של התא לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
4. לפני ביצוע ההסתה, להסיר 50% של מדיה הצמיחה מן spheroids.
5. הוסף 100 μL של ריאגנט הכדאיות התא לכל באר.
   הערה: אמצעי האחסון שישמש תלוי בגודל הצלחת כדלקמן: 100 μL עבור לוחות תרבית תאים 96-well.
6. מערבבים את ריאגנט במרץ במשך 5 דקות כדי לקדם תמוגה התא.
7. דגירה במשך 30 דקות – 2 שעות ב 37 °C (7 °F).
8. תקליט את ההארה.

5. ניתוח תגובת שרשרת פולימראז כמותי בזמן אמת עבור כדוריות

1. עבור כל תנאי, להכין 10 - 15 כדוריות בצינור 2 מ"ל צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 400 x גרם.
2. השליכו את הסופרנט ושטפו את כדוריות פעמיים ב-1 מ"ל של PBS 1x קר כקרח.
   הערה: הימנע צנטריפוגה, תן כדורי להתיישב.
3. שאפו כמה שיותר PBS 1x ולבודד RNA באמצעות ערכה זמינה מסחרית.
4. סנתז cDNA מ- 1 מיקרוגרם של RNA באמצעות ערכה זמינה מסחרית בהתאם לפרוטוקול היצרן.
5. הכן תערובת ראשית כדי להפעיל את כל הדוגמאות במשולש (ראה טבלה 1 וטבלה 2).
6. בצע את ההגברה ב 20 μL של תערובת תבנית מאסטר לתוך כל צלחת qPCR היטב.
7. מערבבים תגובות היטב ומסתובבים במידת הצורך.
8. הפעל דוגמאות בהתאם להמלצות יצרן המכשירים (טבלה 3).

6. סופג מערבי מפרואידים

הערה: בעת איסוף כדוריות, להשתמש 200 μL pipette לחתוך את סוף הטיפים כדי למנוע הפרעה למבנה שלהם.

1. עבור כל תנאי, להכין 30 - 40 כדוריות בצינור 2 מ"ל.
2. מניחים את הצינור על קרח ולתת את כדורי להתיישב לתחתית צינור 2 מ"ל.
3. להשליך את supernatant ולשטוף את כדורי פעמיים 1 מ"ל קר כקרח 1x PBS
   הערה: הימנע צנטריפוגה, תן כדורי להתיישב.
4. שאפו כמה שיותר PBS 1x ולהוסיף חיץ RIPA עם קוקטייל מעכב פרוטאז (10 כדורי = 30 μL של חיץ RIPA).
5. ללקק את התאים על ידי צנרת למעלה ולמטה ולבצע sonication עבור 30 s עם 30 s של מנוחה על קרח במשך 10 מחזורים.
6. צנטריפוגות החלבון lysates ב 15000 x גרם במשך 15 דקות ב 4 °C (70 °F).
7. קבעו את ריכוז החלבון עבור כל תא ליסייט.
8. לפני הטעינה, להרתיח כל תא lysate במאגר מדגם ב 100 °C (50 °F) במשך 10 דקות.
9. לטעון כמויות שוות של חלבון לתוך הבארות של ג'ל SDS-PAGE ולהפעיל את הג'ל עבור 1 - 2 שעות ב 100 V.
10. מעבירים את החלבון מהג'ל לקרום PVDF.
11. לאחר ההעברה, לחסום את הממברנה במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר באמצעות חוצץ חסימה (5% חלב רזה + TBS עם 0.05% Tween-20).
12. לדגור על הממברנה עם 1:1,000 דילול של נוגדן ראשוני (טבלה 4) ב 1x TBST עם 5% חוצץ BSA ב 4 °C (5 °F) לילה.
13. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם TBST, 15 דקות עבור כל לשטוף.
14. לדגור על הממברנה עם 1:2,500 דילול של נוגדן משני במאגר חסימה בטמפרטורת החדר במשך 2 שעות (ראה טבלה של חומרים).
15. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם TBST, 15 דקות עבור כל לשטוף.
16. הכן את הממברנה לגילוי HRP עם מצע כימותרפי.
17. לרכוש תמונות מלימינסנט.

7. פרופיליום יודיד (PI) כתמים של כדורי

1. הכן 5-10 כדוריות כמתואר בשלב 4.1 והנח את כדוריות באינקובטור ב 37 °C (5°F) ו 5% CO₂.
2. לדלל 1 מ"ג / מ"ל מלאי של PI 1:100 ב 1x PBS.
3. מוציאים 50% מהמדיום מכל באר של צלחת 96-well.
4. הוסף 100 μL של פתרון PI לכל באר ומניחים את הבארות באינקובטור ב 37 °C (5° C) ו 5% CO₂ עבור 10 - 15 דקות.
5. לשטוף את פתרון PI עם PBS 1x.
6. הוסף 200 μL של מדיום צמיחה ולצלם תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לנתח את עוצמת הפלואורסצנטיות באמצעות תמונה J כדי לקבל את ספירת הכדאיות של הכדוריד.

8. ניתוח FACS של כדוריות

1. ליצור כדוריות כמתואר בעבר.
2. עבור כל תנאי, להכין 30 - 40 כדוריות בצינור FACS וצנטריפוגה במשך 3 דקות ב 400 x g ו RT.
3. שאפו את supernatant ולשטוף את כדוריות ב 3 מ"ל של 1x PBS, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 400 x g במשך 3 דקות ב 4 °C (70 °F).
4. לשאוף supernatant ולהוסיף 200 μL של 0.25% טריפסין-EDTA, ולאחר מכן דגירה ב RT במשך 2 -3 דקות.
   הערה: זמן הדגירה תלוי בגודל הכדור וסוג התא.
5. הוסף 1 מ"ל של מאגר FACS ונתק בעדינות את כדורי הכדוריד באמצעות פיפטה של 200 μL.
6. צנטריפוגות התאים מנותקים ב 400 x g ו 4 °C (55 °F) במשך 3 דקות.
   הערה: מאגר FACS = 1x PBS + 2.5% FBS, מסונן באמצעות מסנן עליון של 0.22 מיקרומטר.
7. השלך את supernatant ולהוסיף 7-AAD / Annexin V ריאגנט (7AAD (5 μL), Annexin V (5 μL)/מדגם).
8. מערבולת בעדינות את התאים ודגרה במשך 13 - 30 דקות ב RT בחושך.
9. הוסף 500 μL של מאגר FACS וסנן את התאים באמצעות מבחנות פוליסטירן חרוט כדי להסיר תאים צבירה.
10. צנטריפוגה ב 400 x g ו 4 °C (5 °F) במשך 3 דקות.
11. הוסף 500 μL של מאגר כריכת Annexin V לכל צינור ו resuspend.
12. לנתח באמצעות cytometer זרימה.

תוצאות

אנו מתארים את הפרוטוקול של קבלת כדוריות מקווי תאים שונים של סרטן המעי הגס. תוספי עם methylcellulose נדרש כדי ליצור כדוריות. אנו מציגים גם שיטה של הכנת LCFS ולהציג מודל כדי ללמוד את המתאם בין פרוביוטיקה וסרטן המעי הגס. תצורה כדורית ופרוטוקולי הכנה LCFS מודאים באופן סכמטי באיור 1A,B

Discussion

microenvironment הרקמה, כולל תאים שכנים ואת מטריצה חוץ תאית (ECM), הוא בסיסי לייצור רקמות חיוני בשליטה על צמיחת התא ופיתוח^{רקמות 13}. עם זאת, לתרבויות 2D יש מספר חסרונות, כגון הפרעה של אינטראקציות תאיות, כמו גם שינויים במורפולוגיה של תאים, סביבות חוץ תאיות, ואת הגישה של חטיבה¹⁴. מע...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 15-well, 15 µl	Biorad	4561036	Pkg of 10
Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	100 covers
10x transfer buffer	Intron	IBS-BT031A	1 L
10X Tris-Glycine (W/SDS)	Intron	IBS-BT014	1 L
Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube, Polypropylene, Clear, Nonsterile, 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case	Corning	SCT-200-C	500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case
BD Difco Bacto Agar	BD	214010	500 g
BD Difco Lactobacilli MRS Broth	BD	DF0881-17-5	500 g
CellTiter-Glo 3D Cell viability assay	Promega	G9681	100μl/assay in 96-well plates
Complete Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	11697498001	vial of 20 tablets
Corning Phosphate-Buffered Saline, 1X without calcium and magnesium, PH 7.4 ± 0.1	Corning	21-040-CV	500 mL
EMD Millipore Immobilon-P PVDF Transfer Membranes	fisher Scientific	IPVH00010	26.5cm x 3.75m roll; Pore Size: 0.45um
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235	25/Pack, 500/Case
Fetal Bovine Serum, certified, US origin	Thermo Fisher Scientific	16000044	500 mL
iScript cDNA Synthesis Kit, 25 x 20 µl rxns #1708890	Biorad	1708890	25 x 20 µL rxns
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Biorad	1725121	5 x 1 mL
Lactobacillus fermentum	Korean Collection for Type Cultures	KCTC 3112
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Sigma-Aldrich	C6852-25G	25 g
Methyl Cellulose (3500-5600mPa·s, 2% in Water at 20°C)	TCI	M0185	500 g
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL	Applied Biosystems	4346906	20 plates
Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized	Millipore	SLGS033SB	250
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AAD	Biolegend	640934	100 tests
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122	100 mL
Propidium Iodide	Introgen	P1304MP	100 mg
RIPA Lysis and Extraction Buffer	Thermo Fisher Scientific	89901	250 mL
RNeasy Mini Kit (250)	Qiagen	74106	250
RPMI-1640	Gibco	11875-119	500 mL
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200056	100 mL
Name of Materials/Equipment/Software	Company	Catalog Number	Comments/Description
anti - p-IκBα (B-9)	Santa cruze	sc-8404	200 µg/mL
anti-BclxL (H-5)	Santa cruze	sc-8392	200 µg/mL
anti-PARP 1 (C2-10)	Santa cruze	sc-53643	50 µl ascites
anti-β-actin (C4)	Santa cruze	sc-47778	200 µg/mL
BD FACSVerse	BD Biosciences		San Diego, CA, USA
Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader	BioT	S1LFA
CO2 incubator	Thermo fisher	HERAcell 150i
Conical tube 15 ml	SPL	50015
Conical tube 50 ml	SPL	50050
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate	Sigma-Aldrich	CLS7007
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate	Sigma-Aldrich	CLS3471
Costar 50 mL Reagent Reservoirs, 5/Bag, Sterile	Costar	4870
Countess Cell Counting Chamber Slides	Thermofisher	C10228
Countess II FL Automated Cell Counter	invitrogen	AMQAF1000
EnSpire Multimode Reader	Perkin Elmer		Enspire 2300
Eppendorf Research Plus Multi Channel Pipette, 8-channel	Eppendorf	3122000051
FlowJo software	TreeStar		Ashland, OR, USA
Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	115-035-062	1.5 mL
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	111-035-144	2.0 mL
GraphPad Prism 5	GraphPad Software		Inc., San Diego, CA, USA
ImageJ	NIH
ImageQuant LAS 4000 mini	Fujifilm		Tokyo, Japan
Incubated shaker	Lab companion	SIF-6000R
Multi Gauge Ver. 3.0,	Fujifilm		Tokyo, Japan
Optical density (OD)LAMBDA UV/Vis Spectrophotometers	Perkin Elmer		Waltham, MA, USA
Phase-contrast microscope	Olympus		Tokyo, Japan
SPL microcentrifuge tube 1.5mL	SPL	60015
SPL Multi Channel Reservoirs, 12-Chs, PS, Sterile	SPL	21012
StepOnePlus Real-Time PCR system	Thermo Fisher Scientific		Waltham, MA, USA
Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processors	SONICS-vibra cell	VC 505	500 Watt ultrasonic processor
Vinyl Anaerobic Chamber	COY LAB PRODUCTS