在结肠直肠癌细胞的三维球体培养物中使用无细胞益生菌超常剂评估细胞死亡

摘要

这里介绍了了解 乳酸杆菌 无细胞超高分子（LCFS）的抗癌作用的方法。结肠直肠癌细胞系显示在3D培养物中用LCFS治疗时细胞死亡。生成球体的过程可以根据脚手架进行优化，并且所呈现的分析方法可用于评估所涉及的信号通路。

摘要

这份手稿描述了一个协议，评估癌细胞死亡的三维（3D）球形多细胞类型的癌细胞使用超分子从 乳酸杆菌发酵 细胞培养， 被认为是益生菌培养物。使用 3D 培养物来测试 乳酸杆菌 无细胞超高分子 （LCFS） 比在 2D 单层测试更好，特别是因为 L. 发酵 可以在肠道内产生抗癌效果。 L. 发酵 超高分子被鉴定在3D培养条件下对几种结肠直肠癌（CRC）细胞具有增加的抗增殖作用。有趣的是，这些效应与培养模型密切相关，显示了 L.发酵 诱导癌细胞死亡的显著能力。稳定的球体来自不同的CRC（结肠直肠癌细胞），使用下面提出的协议。生成 3D 球体的这种协议节省时间且具有成本效益。该系统的开发是为了轻松研究LCFS在多种CRC球体中的抗癌作用。不出所料，在实验中用LCFS治疗的CRC球体强烈诱导细胞死亡，并表达由qRT-PCR、西侧印迹和FACS分析分析的特定凋亡分子标记。因此，该方法对于探索细胞生存能力和评估抗癌药物的疗效具有重要的价值。

引言

益生菌是肠道中最有利的微生物，可改善免疫平衡和宿主能量代谢^1。乳酸杆菌和双歧杆菌的益生菌是肠^2、3中同类中最先进的。先前的研究表明，乳酸杆菌对包括结肠直肠癌^在内的几种癌症有抑制和反促进作用。此外，益生菌可预防炎症性肠病、克罗恩病和溃疡性结肠炎^5、6。然而，大多数益生菌研究都是在生长在固体表面的二维（2D）单层体中进行的。

人工培养系统缺乏环境特征，这对癌细胞来说是不自然的。为了克服这一局限性，开发了3维（3D）文化系统^7、8。3D中的癌细胞在基本生物机制方面表现出改善，如细胞生存能力、增殖、形态、细胞细胞通信、药物敏感性和体内相关性^9、10。此外，球体由多细胞类型的结肠直肠癌制成，并依赖于细胞-细胞相互作用和细胞外基质^{（ECM）11。}我们先前的研究已经报告说，使用乳酸杆菌发酵产生的益生菌无细胞超纳坦（CFS）对结肠直肠癌（CRC）细胞¹²的3D培养物具有抗癌作用。我们建议CFS是测试3D球体¹²的益生菌效应的合适替代策略。

在这里，我们提出了一种方法，可以容纳多细胞类型的3D结肠直肠癌，用于分析益生菌无细胞超高分子（CFS）对几个3D结肠直肠癌模仿系统的治疗效果。这种方法为体外分析相关的益生菌和抗癌效果提供了手段。

研究方案

1. 细菌细胞培养和 无乳酸杆菌 无细胞超高分子（LCFS）的制备

注:步骤 1.2 - 1.9 在厌氧室中执行。

1. 准备一个含有 L-西斯坦的人造黄油板和肉汤，并通过自动包装消毒。
2. 在H₂ 厌氧室中预孵育MRS agar板，维持在37°C，含20ppm氧气。
3. 解冻乳酸杆菌库存，并接种与细菌培养的阿加板（图1A（i）） 。
4. 在_H2 厌氧室中以37°C和20ppm氧孵育细菌2-3天，直到获得单一细菌菌落。
5. 清洗和干燥洪高特型有氧培养管。在 121 °C 下将培养管高压灭菌 15 分钟。
6. 然后在_H2 厌氧室中孵育管子，在37°C和20ppm氧中去除氧气。
7. 将 2 - 3 mL 的夫人肉汤放入管中。用丁基橡胶塞密封管子，拧紧盖子。
8. 获得一个带环的单个菌落，并将其放入 1.5 mL 培养管中，该培养管的 500 μL 为 1x PBS。（图1A（ 二））。
9. 使用 1 mL 注射器暂停殖民地 （图 1A （iii）。这样做，将 1 mL 注射器的针头插入管盖中心，吸气悬浮的菌落，然后将其重新插入 MRS 肉汤介质中。（图1A（四））。
10. 在摇床孵化器中孵育 MRS 肉汤介质 2 天（37 °C，5% CO 2，200 rpm）。
11. 使用光谱光度计测量光学密度 （OD）以监测细菌生长曲线，直到 OD₆₂₀ 的吸收率达到 2.0。
12. 将细菌颗粒和受条件介质分离，以 1，000 x g 离心 15 分钟进行离心。用 1x PBS 清洗收集的细菌颗粒，在 RPMI 1640 的 4 mL 中重新吸附，并辅以 10% 的胎儿牛血清。介质中不包括任何抗生素。
13. 在 RPMI 中保持细菌颗粒，并在 37 °C 的摇床孵化器中孵育 4 小时，以 100 rpm 的速度在 5% CO₂ 中孵育。
14. 对于益生菌超纳特的制备，在1000 x g的离心下通过离心去除细菌颗粒，在4°C下15分钟。 使用 0.22 μm 过滤器对已恢复的超纳特进行无菌过滤，并存储在 +80 °C 下，直到使用。

2. 球形的生成

1. 准备结肠直肠癌细胞系
   1. 将 DLD-1、HT-29 和 WiDr 细胞系作为单层培养，直到 70-80% 的汇合，并在 5% CO₂ 孵化器中以 37 °C 孵育板（生长介质:含有 10% 胎儿牛血清 （FBS） 和 1% 青霉素-链霉素的 RPMI）。
   2. 对于生长在 100 mm Petri 盘中的细胞，用 4 mL 的 1x PBS 洗盘两次。加入 1 mL 的 0.25% 试用素-EDTA，在 5% CO 2 孵化器中在 37 °C 下孵育₂ 分钟，以分离细胞。
   3. 孵化后，在显微镜下检查细胞分离，用5兆升的生长介质中和试丁二醇。
   4. 将分离的细胞转移到15mL圆锥管和离心机3分钟在300×g。
   5. 丢弃超高分子，用3兆L的生长介质轻轻重新悬浮。
   6. 用锥蓝计数细胞，使用血细胞计确定可行的细胞。（图1B （一） ）
2. 球形形成
   1. 在 15 mL 圆锥管中，将细胞从 2.1.5 中稀释，以获得 1 - 2 x 10⁵个细胞/mL （图 1B （ii）
   2. 将最终浓度为0.6%的甲基纤维素加入细胞悬浮物中，并将稀释后的细胞转移到无菌储液层中。
      注:对于每个细胞系，所需的甲基纤维素量应进行点缀并相应确定。
   3. 使用多通道移液器将 200 μL 的细胞分配到每个超低附件 96 井圆形底部微板的油井中。（图1B （三）
   4. 在 5% CO₂ 孵化器中将板在 37 °C 下孵育，24 - 36 小时。
   5. 24 -36小时后，在光显微镜下观察板块，以确保球形形成。

3. 用LCFS治疗3D结肠直肠癌细胞

1. 生成第 2 步和第 3 步中描述的球形。
2. 在进行LCFS治疗之前，在室温下解冻冷冻LCFS10 -20分钟。
3. 将LCFS股票解决方案接种到生长介质中。在生长介质中连续稀释至 25%、12.5% 和 6% （即 25% LCFS = 150 μL 的增长介质 = 50 μL 的 LCFS）。
4. 从孵化器中取出含有球体的细胞培养板，使用 200 μL 移液器从每口井中取出尽可能多的生长介质。
5. 在细胞上加入LCFS的生长介质，在37°C的CO₂ 孵化器中孵育24-48小时。
   注:要使用的体积将取决于板大小如下:2 mL为6井细胞培养板:200 μL 用于 96 井细胞培养板。

4. 球形细胞的生存能力

1. 准备 8 - 10 LCFS 治疗的结肠直肠癌球体在不透明壁多井板（细胞生存能力检测执行 48 小时后 LCFS 治疗）。
2. 将细胞生存性试剂（参见 材料表）解冻，在 4 °C 下过夜。
3. 使用前将细胞生存性试剂与室温等距。
4. 在进行检测之前，从球体中取出 50% 的生长介质。
5. 在每个井中加入 100 μL 的细胞生存性试剂。
   注:要使用的体积将取决于板大小如下:100 μL 的 96 井细胞培养板。
6. 将试剂大力混合5分钟，促进细胞裂解。
7. 孵育30分钟 = 2小时在37°C。
8. 记录发光。

5. 球体的定量实时聚合酶链反应分析

1. 对于每个情况，准备10-15球体在2 mL管和离心机3分钟在400×g。
2. 丢弃超高纳特，在1 mL的冰冷1xPBS中两次清洗球体。
   注意:避免离心，让球体安定下来。
3. 尽可能多地吸气 1x PBS，并使用市售套件隔离 RNA。
4. 根据制造商的协议，使用市售套件从 1 微克 RNA 中合成 cDNA。
5. 准备一个主组合，以三重运行所有样品（参见表1和表2）。
6. 在模板主组合的 20 μL 中将放大到每个 qPCR 板中。
7. 混合反应良好，如有必要，旋转。
8. 根据仪器制造商的建议运行样品（表3）。

6. 球体的西式印迹

注:在收集球体时，使用 200 μL 移液器并切割尖端，以避免干扰其结构。

1. 对于每个条件，准备30 - 40球体在2mL管。
2. 将管子放在冰上，让球体沉降到2mL管的底部。
3. 丢弃超纳特，在 1 mL 冰冷 1x PBS 中两次清洗球体
   注意:避免离心，让球体安定下来。
4. 尽可能多地吸气 1x PBS，并添加 RIPA 缓冲器与蛋白酶抑制剂鸡尾酒 （10 球体 = 30 μL RIPA 缓冲器）.
5. 通过上下管道来对细胞进行解剖，并进行30s的声波，30s在冰上休息10圈。
6. 将蛋白质以 15000 x g 为离心，在 4 °C 下 15 分钟。
7. 确定每个细胞解解剂的蛋白质浓度。
8. 在加载之前，将每个细胞在 100 °C 的样品缓冲中沸腾 10 分钟。
9. 将等量的蛋白质装载到 SDS-PAGE 凝胶的井中，并在 100 V 下将凝胶运行 1 - 2 小时。
10. 将蛋白质从凝胶转移到PVDF膜。
11. 转移后，使用阻塞缓冲器（5% 脱脂牛奶 + TBS，0.05% Tween-20）在室温下将膜阻隔 1 小时。
12. 在 1x TBST 中以 4 °C 的 5% BSA 缓冲器在 1x TBST 中用 1:1，000 稀释原发抗体 （表 4）来孵育膜。
13. 用结节水三次清洗膜，每次洗15分钟。
14. 在室温下在室温下在阻隔缓冲器中用1:2，500稀释二次抗体的膜孵化2小时（见 材料表）。
15. 用结节水三次清洗膜，每次洗15分钟。
16. 用化学发光基板为 HRP 检测准备膜。
17. 获取化学图像。

7. 球体的碘化物（PI）染色

1. 准备5-10球体，如第4.1步所述，并将球体放在37°C和5%CO₂的孵化器中。
2. 在 1x PBS 中稀释 PI 1:100 的 1 毫克/mL 库存。
3. 从 96 井板的每口井中取出 50% 的介质。
4. 将 100 μL 的 PI 溶液添加到每口油井中，并将油井置于 37 °C 和 5% CO₂ 的孵化器中，10 - 15 分钟。
5. 用 1x PBS 洗掉 PI 溶液。
6. 加入200微升的生长介质，使用荧光显微镜拍摄图像。使用图像 J 分析荧光强度，以获得球体的生存能力计数。

8. 球形的FACS分析

1. 生成如前所述的球形。
2. 对于每个条件，准备30 - 40球体在FACS管和离心机3分钟在400 x g 和RT。
3. 吸气超纳特，在 1x PBS 的 3 mL 中清洗球体，然后以 400 x g离心机在 4 °C 下 3 分钟洗涤球体。
4. 吸气超纳坦，并添加200微升0.25%的Trypsin-EDTA，然后在RT孵育2-3分钟。
   注:孵化时间取决于球体大小和细胞类型。
5. 添加 1 mL 的 FACS 缓冲器，并使用 200 μL 移液器轻轻分离球体。
6. 将分离的细胞在 400 x g和 4 °C 下离心 3 分钟。
   注: FACS 缓冲器 = 1x PBS = 2.5% FBS，使用 0.22 μm 顶部过滤器进行过滤。
7. 丢弃超高纳特，加入 7-AAD/附件 V 试剂 （7AAD （5 μL）、附件 V （5 μL）/样品） 。
8. 轻轻地旋转细胞，在黑暗中的RT孵育13-30分钟。
9. 加入 500 μL 的 FACS 缓冲器，使用锥形聚苯乙烯试管过滤细胞，以去除聚合细胞。
10. 离心机在 400 x g和 4 °C 为 3 分钟。
11. 在每个管子中加入 500 μL 的附件 V 绑定缓冲器并重新悬浮。
12. 使用流细胞仪进行分析。

结果

我们描述了从不同的结肠直肠癌细胞系中获取球状体的程序。需要补充甲基纤维素才能产生球状体。我们还介绍了LCFS制备方法，并提出了一个模型来研究益生菌与结肠直肠癌之间的相关性。球形形成和LCFS制备协议在图1A，B中示意图说明。如图2A所示，甲基纤维素浓度为0.6%，将癌细胞转化为紧凑的球体。这一结果表明，球状体可以通过使用...

讨论

组织微环境，包括相邻细胞和细胞外基质（ECM），是组织生成的基础，在控制细胞生长和组织发育^方面至关重要。然而，2D培养物有几个缺点，如细胞相互作用的中断，以及细胞形态的改变，细胞外环境，以及第¹⁴分区的方法。3D细胞培养系统经过严格研究，以更好地在体内繁殖效果，并已被证明是更精确的体外癌症检测系统^15，16。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 15-well, 15 µl	Biorad	4561036	Pkg of 10
Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	100 covers
10x transfer buffer	Intron	IBS-BT031A	1 L
10X Tris-Glycine (W/SDS)	Intron	IBS-BT014	1 L
Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube, Polypropylene, Clear, Nonsterile, 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case	Corning	SCT-200-C	500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case
BD Difco Bacto Agar	BD	214010	500 g
BD Difco Lactobacilli MRS Broth	BD	DF0881-17-5	500 g
CellTiter-Glo 3D Cell viability assay	Promega	G9681	100μl/assay in 96-well plates
Complete Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	11697498001	vial of 20 tablets
Corning Phosphate-Buffered Saline, 1X without calcium and magnesium, PH 7.4 ± 0.1	Corning	21-040-CV	500 mL
EMD Millipore Immobilon-P PVDF Transfer Membranes	fisher Scientific	IPVH00010	26.5cm x 3.75m roll; Pore Size: 0.45um
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235	25/Pack, 500/Case
Fetal Bovine Serum, certified, US origin	Thermo Fisher Scientific	16000044	500 mL
iScript cDNA Synthesis Kit, 25 x 20 µl rxns #1708890	Biorad	1708890	25 x 20 µL rxns
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Biorad	1725121	5 x 1 mL
Lactobacillus fermentum	Korean Collection for Type Cultures	KCTC 3112
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Sigma-Aldrich	C6852-25G	25 g
Methyl Cellulose (3500-5600mPa·s, 2% in Water at 20°C)	TCI	M0185	500 g
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL	Applied Biosystems	4346906	20 plates
Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized	Millipore	SLGS033SB	250
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AAD	Biolegend	640934	100 tests
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122	100 mL
Propidium Iodide	Introgen	P1304MP	100 mg
RIPA Lysis and Extraction Buffer	Thermo Fisher Scientific	89901	250 mL
RNeasy Mini Kit (250)	Qiagen	74106	250
RPMI-1640	Gibco	11875-119	500 mL
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200056	100 mL
Name of Materials/Equipment/Software	Company	Catalog Number	Comments/Description
anti - p-IκBα (B-9)	Santa cruze	sc-8404	200 µg/mL
anti-BclxL (H-5)	Santa cruze	sc-8392	200 µg/mL
anti-PARP 1 (C2-10)	Santa cruze	sc-53643	50 µl ascites
anti-β-actin (C4)	Santa cruze	sc-47778	200 µg/mL
BD FACSVerse	BD Biosciences		San Diego, CA, USA
Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader	BioT	S1LFA
CO2 incubator	Thermo fisher	HERAcell 150i
Conical tube 15 ml	SPL	50015
Conical tube 50 ml	SPL	50050
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate	Sigma-Aldrich	CLS7007
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate	Sigma-Aldrich	CLS3471
Costar 50 mL Reagent Reservoirs, 5/Bag, Sterile	Costar	4870
Countess Cell Counting Chamber Slides	Thermofisher	C10228
Countess II FL Automated Cell Counter	invitrogen	AMQAF1000
EnSpire Multimode Reader	Perkin Elmer		Enspire 2300
Eppendorf Research Plus Multi Channel Pipette, 8-channel	Eppendorf	3122000051
FlowJo software	TreeStar		Ashland, OR, USA
Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	115-035-062	1.5 mL
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	111-035-144	2.0 mL
GraphPad Prism 5	GraphPad Software		Inc., San Diego, CA, USA
ImageJ	NIH
ImageQuant LAS 4000 mini	Fujifilm		Tokyo, Japan
Incubated shaker	Lab companion	SIF-6000R
Multi Gauge Ver. 3.0,	Fujifilm		Tokyo, Japan
Optical density (OD)LAMBDA UV/Vis Spectrophotometers	Perkin Elmer		Waltham, MA, USA
Phase-contrast microscope	Olympus		Tokyo, Japan
SPL microcentrifuge tube 1.5mL	SPL	60015
SPL Multi Channel Reservoirs, 12-Chs, PS, Sterile	SPL	21012
StepOnePlus Real-Time PCR system	Thermo Fisher Scientific		Waltham, MA, USA
Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processors	SONICS-vibra cell	VC 505	500 Watt ultrasonic processor
Vinyl Anaerobic Chamber	COY LAB PRODUCTS