在结肠直肠癌细胞的三维球体培养物中使用无细胞益生菌超常剂评估细胞死亡

摘要

这里介绍了了解 乳酸杆菌 无细胞超高分子（LCFS）的抗癌作用的方法。结肠直肠癌细胞系显示在3D培养物中用LCFS治疗时细胞死亡。生成球体的过程可以根据脚手架进行优化，并且所呈现的分析方法可用于评估所涉及的信号通路。

摘要

这份手稿描述了一个协议，评估癌细胞死亡的三维（3D）球形多细胞类型的癌细胞使用超分子从 乳酸杆菌发酵 细胞培养， 被认为是益生菌培养物。使用 3D 培养物来测试 乳酸杆菌 无细胞超高分子 （LCFS） 比在 2D 单层测试更好，特别是因为 L. 发酵 可以在肠道内产生抗癌效果。 L. 发酵 超高分子被鉴定在3D培养条件下对几种结肠直肠癌（CRC）细胞具有增加的抗增殖作用。有趣的是，这些效应与培养模型密切相关，显示了 L.发酵 诱导癌细胞死亡的显著能力。稳定的球体来自不同的CRC（结肠直肠癌细胞），使用下面提出的协议。生成 3D 球体的这种协议节省时间且具有成本效益。该系统的开发是为了轻松研究LCFS在多种CRC球体中的抗癌作用。不出所料，在实验中用LCFS治疗的CRC球体强烈诱导细胞死亡，并表达由qRT-PCR、西侧印迹和FACS分析分析的特定凋亡分子标记。因此，该方法对于探索细胞生存能力和评估抗癌药物的疗效具有重要的价值。

引言

益生菌是肠道中最有利的微生物，可改善免疫平衡和宿主能量代谢^1。乳酸杆菌和双歧杆菌的益生菌是肠^2、3中同类中最先进的。先前的研究表明，乳酸杆菌对包括结肠直肠癌^在内的几种癌症有抑制和反促进作用。此外，益生菌可预防炎症性肠病、克罗恩病和溃疡性结肠炎^5、6。然而，大多数益生菌研究都是在生长在固体表面的二维（2D）单层体中进行的。

人工培养系统缺乏环境特征，这对癌细胞来说是不自然的。为了克服这一局限性，开发了3维（3D）文化系统^7、8。3D中的癌细胞在基本生物机制方面表现出改善，如细胞生存能力、增殖、形态、细胞细胞通信、药物敏感性和体内相关性^9、10。此外，球体由多细胞类型的结肠直肠癌制成，并依赖于细胞-细胞相互作用和细胞外基质^{（ECM）1....}

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研究方案

1. 细菌细胞培养和 无乳酸杆菌 无细胞超高分子（LCFS）的制备

注:步骤 1.2 - 1.9 在厌氧室中执行。

1. 准备一个含有 L-西斯坦的人造黄油板和肉汤，并通过自动包装消毒。
2. 在H₂ 厌氧室中预孵育MRS agar板，维持在37°C，含20ppm氧气。
3. 解冻乳酸杆菌库存，并接种与细菌培养的阿加板（图1A（i）） 。
4. 在_H2 厌氧室中以37°C和20ppm氧孵育细菌2-3天，直到获得单一细菌菌落。
5. 清洗和干燥洪高特型有氧培养管。在 121 °C 下将培养管高压灭菌 15 分钟。
6. 然后在_H2 厌氧室中孵育管子，在37°C和20ppm氧中去除氧气。
7. 将 2 - 3 mL 的夫人肉汤放入管中。用丁基橡胶塞密封管子，拧紧盖子。
8. 获得一个带环的单个菌落，并将其放入 1.5 mL 培养管中，该培养管的 500 μL 为 1x PBS。（图1A（ 二））。
9. 使用 1 mL 注射器暂停殖民地 （

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结果

我们描述了从不同的结肠直肠癌细胞系中获取球状体的程序。需要补充甲基纤维素才能产生球状体。我们还介绍了LCFS制备方法，并提出了一个模型来研究益生菌与结肠直肠癌之间的相关性。球形形成和LCFS制备协议在图1A，B中示意图说明。如图2A所示，甲基纤维素浓度为0.6%，将癌细胞转化为紧凑的球体。这一结果表明，球状体可以通过使用.......

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讨论

组织微环境，包括相邻细胞和细胞外基质（ECM），是组织生成的基础，在控制细胞生长和组织发育^方面至关重要。然而，2D培养物有几个缺点，如细胞相互作用的中断，以及细胞形态的改变，细胞外环境，以及第¹⁴分区的方法。3D细胞培养系统经过严格研究，以更好地在体内繁殖效果，并已被证明是更精确的体外癌症检测系统^15，16。

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 15-well, 15 µl	Biorad	4561036	Pkg of 10
Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	100 covers
10x transfer buffer	Intron	IBS-BT031A	1 L
10X Tris-Glycine (W/SDS)	Intron	IBS-BT014	1 L
Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube, Polypropylene, Clear, Nonsterile, 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case	Corning	SCT-200-C	500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case
BD Difco Bacto Agar	BD	214010	500 g
BD Difco Lactobacilli MRS Broth	BD	DF0881-17-5	500 g
CellTiter-Glo 3D Cell viability assay	Promega	G9681	100μl/assay in 96-well plates
Complete Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	11697498001	vial of 20 tablets
Corning Phosphate-Buffered Saline, 1X without calcium and magnesium, PH 7.4 ± 0.1	Corning	21-040-CV	500 mL
EMD Millipore Immobilon-P PVDF Transfer Membranes	fisher Scientific	IPVH00010	26.5cm x 3.75m roll; Pore Size: 0.45um
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235	25/Pack, 500/Case
Fetal Bovine Serum, certified, US origin	Thermo Fisher Scientific	16000044	500 mL
iScript cDNA Synthesis Kit, 25 x 20 µl rxns #1708890	Biorad	1708890	25 x 20 µL rxns
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Biorad	1725121	5 x 1 mL
Lactobacillus fermentum	Korean Collection for Type Cultures	KCTC 3112
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Sigma-Aldrich	C6852-25G	25 g
Methyl Cellulose (3500-5600mPa·s, 2% in Water at 20°C)	TCI	M0185	500 g
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL	Applied Biosystems	4346906	20 plates
Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized	Millipore	SLGS033SB	250
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AAD	Biolegend	640934	100 tests
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122	100 mL
Propidium Iodide	Introgen	P1304MP	100 mg
RIPA Lysis and Extraction Buffer	Thermo Fisher Scientific	89901	250 mL
RNeasy Mini Kit (250)	Qiagen	74106	250
RPMI-1640	Gibco	11875-119	500 mL
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200056	100 mL
Name of Materials/Equipment/Software	Company	Catalog Number	Comments/Description
anti - p-IκBα (B-9)	Santa cruze	sc-8404	200 µg/mL
anti-BclxL (H-5)	Santa cruze	sc-8392	200 µg/mL
anti-PARP 1 (C2-10)	Santa cruze	sc-53643	50 µl ascites
anti-β-actin (C4)	Santa cruze	sc-47778	200 µg/mL
BD FACSVerse	BD Biosciences		San Diego, CA, USA
Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader	BioT	S1LFA
CO2 incubator	Thermo fisher	HERAcell 150i
Conical tube 15 ml	SPL	50015
Conical tube 50 ml	SPL	50050
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate	Sigma-Aldrich	CLS7007
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate	Sigma-Aldrich	CLS3471
Costar 50 mL Reagent Reservoirs, 5/Bag, Sterile	Costar	4870
Countess Cell Counting Chamber Slides	Thermofisher	C10228
Countess II FL Automated Cell Counter	invitrogen	AMQAF1000
EnSpire Multimode Reader	Perkin Elmer		Enspire 2300
Eppendorf Research Plus Multi Channel Pipette, 8-channel	Eppendorf	3122000051
FlowJo software	TreeStar		Ashland, OR, USA
Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	115-035-062	1.5 mL
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	111-035-144	2.0 mL
GraphPad Prism 5	GraphPad Software		Inc., San Diego, CA, USA
ImageJ	NIH
ImageQuant LAS 4000 mini	Fujifilm		Tokyo, Japan
Incubated shaker	Lab companion	SIF-6000R
Multi Gauge Ver. 3.0,	Fujifilm		Tokyo, Japan
Optical density (OD)LAMBDA UV/Vis Spectrophotometers	Perkin Elmer		Waltham, MA, USA
Phase-contrast microscope	Olympus		Tokyo, Japan
SPL microcentrifuge tube 1.5mL	SPL	60015
SPL Multi Channel Reservoirs, 12-Chs, PS, Sterile	SPL	21012
StepOnePlus Real-Time PCR system	Thermo Fisher Scientific		Waltham, MA, USA
Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processors	SONICS-vibra cell	VC 505	500 Watt ultrasonic processor
Vinyl Anaerobic Chamber	COY LAB PRODUCTS