Kolorektal Kanser Hücrelerinin Üç Boyutlu Küresel Kültürlerinde Probiyotiklerin Hücresiz Süpernatantı Kullanılarak Hücre Ölümünün Değerlendirilmesi

Özet

Burada Lactobacillus hücresiz süpernatantın (LCFS) kanser önleyici etkilerini anlamak için yöntemler sunulmaktadır. Kolorektal kanser hücre hatları 3D kültürlerde LCFS ile tedavi edildiğinde hücre ölümlerini göstermektedir. Sferoid üretme süreci iskeleye bağlı olarak optimize edilebilir ve sunulan analiz yöntemleri ilgili sinyal yollarını değerlendirmek için yararlıdır.

Özet

Bu makale, probiyotikkültürü olarak kabul edilen Lactobacillus fermentum hücre kültüründen süpernatantlar kullanarak çok hücreli kanser hücrelerinin üç boyutlu (3D) sferoidlerinde kanser hücresi ölümlerini değerlendirmek için bir protokol açıklanmaktadır. Lactobacillus hücresiz süpernatant (LCFS) test etmek için 3D kültürlerin kullanımı, özellikle L. fermentum bağırsak içinde kanser önleyici etkiler üretebileceğinden, 2D monolayerlerde test etmekten daha iyi bir seçenektir. L. fermentum supernatant'ın 3D kültür koşullarında çeşitli kolorektal kanser (CRC) hücrelerine karşı artan anti-proliferatif etkilere sahip olduğu belirlendi. İlginçtir ki, bu etkiler L. fermentum'un kanser hücre ölümünü teşvik etmedeki önemli yeteneğini gösteren kültür modeliyle güçlü bir şekilde ilişkiliydi. Aşağıda sunulan protokol kullanılarak çeşitli CRC'lerden (kolorektal kanser hücreleri) stabil sferoidler üretilmiştir. 3D küresel oluşturmanın bu protokolü zaman tasarrufu sağlar ve uygun maliyetlidir. Bu sistem, LCFS'nin birden fazla CRC sferoid türündeki kanser önleyici etkilerini kolayca araştırmak için geliştirilmiştir. Beklendiği gibi, deney sırasında LCFS ile tedavi edilen CRC sferoidleri hücre ölümünü güçlü bir şekilde indükledi ve qRT-PCR, batı şişkinliği ve FACS analizi ile analiz edildiği gibi spesifik apoptoz moleküler belirteçlerini ifade etti. Bu nedenle, bu yöntem hücre canlılığını keşfetmek ve anti-kanser ilaçlarının etkinliğini değerlendirmek için değerlidir.

Giriş

Probiyotikler, bağışıklık homeostazını geliştiren ve enerji metabolizmasını barındıran bağırsaktaki en avantajlı mikroorganizmalardır¹. Lactobacillus ve Bifidobacterium probiyotikleri bağırsakta bulunan türünün en gelişmişidir^2,3. Önceki araştırmalar Lactobacillus'un kolorektal kanser de dahil olmak üzere çeşitli kanserler üzerinde inhibitör ve antiproliferatif etkileri olduğunu göstermiştir⁴. Ayrıca, probiyotikler enflamatuar bağırsak hastalıklarını, Crohn hastalığını ve ülseratif koliti önler^5,6. Bununla birlikte, probiyotiklerle yapılan çalışmaların çoğu katı yüzeylerde yetişen iki boyutlu (2D) monolayerlerde gerçekleştirildi.

Yapay kültür sistemleri, kanser hücreleri için doğal olmayan çevresel özelliklerden yoksundur. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için üç boyutlu (3D) kültür sistemleri geliştirilmiştir^7,8. 3D kanser hücreleri hücre canlılığı, çoğalma, morfoloji, hücre-hücre iletişimi, ilaç duyarlılığı ve in vivo alaka düzeyi^9,10gibi temel biyolojik mekanizmalar açısından iyileşmeler göstermektedir. Ayrıca, sferoidler çok hücreli kolorektal kanser türlerinden yapılır ve hücre-hücre etkileşimlerine ve hücre dışı matrise (ECM)^{bağlıdır 11}. Önceki çalışmamız, Lactobacillus fermentum kullanılarak üretilen probiyotik hücresiz süpernatantın (CFS) kolorektal kanser (CRC) hücrelerinin 3D kültürleri üzerinde kanser önleyici etkiler gösterdiğini bildirmiştir¹². CFS'nin probiyotik etkilerini 3D sferoidler üzerinde test etmek için uygun bir alternatif strateji olduğunu önerdik¹².

Burada, probiyotik hücresiz süpernatantın (CFS) çeşitli 3D kolorektal kanser taklit sistemleri üzerindeki terapötik etkilerinin analizi için çok hücreli 3D kolorektal kanser türlerini barındırabilecek bir yaklaşım sunuyoruz. Bu yöntem, ilgili probiyotik ve anti-kanser etkilerinin in vitro analizi için bir araç sağlar.

Protokol

1. Bakteriyel hücre kültürleri ve Lactobacillus hücresiz süpernatant hazırlanması (LCFS)

NOT: Adım 1.2 – 1.9 anaerobik bir odada gerçekleştirilir.

1. L-sistein içeren bir MRS agar tabağı ve et suyu hazırlayın ve otoklavlayarak sterilize edin.
2. 37 °C'de tutulan H₂ anaerobik haznedeki MRS agar plakasını 20 ppm oksijenle önceden kuluçkaya yatırın.
3. Lactobacillus bakteri stoğunu çözün ve agar plakasını bakteri kültürü ile aşıla(Şekil 1A (i)).
4. Tek bakteri kolonileri elde edilene kadar 37 °C'de H₂ anaerobik odada ve 20 ppm oksijende bakterileri 2 - 3 gün kuluçkaya yatırın.
5. Hungate tipi anerobik kültür tüpünü yıkayın ve kurutun. Kültür tüpünü 121 °C'de 15 dakika boyunca otoklavlayın.
6. Daha sonra oksijeni çıkarmak için tüpü 37 °C'de H₂ anaerobik haznede ve 20 ppm oksijende kuluçkaya yatırın.
7. Tüpe 2 - 3 mL MRS suyu yerleştirin. Tüpü bir bütil kauçuk durdurucu ile kapatın ve kapağı vidaleyin.
8. Bir döngü ile tek bir koloni elde edin ve 500 μL 1x PBS ile 1,5 mL kültür tüpüne yerleştirin. (Şekil 1A (ii)).
9. Koloniyi 1 mL şırıng kullanarak askıya alın (Şekil 1A (iii)). Bunu, 1 mL şırınganın iğnesini tüp kapağının ortasına yerleştirerek, askıya alınmış koloniyi aspire ederek ve ardından MRS et suyu ortamına geri koyarak yapın. (Şekil 1A (iv)).
10. MRS et suyu medyasını 2 gün boyunca bir çalkalayıcı inkübatörde kuluçkaya yatırın (37 °C,_%5CO 2 , 200 rpm).
11. OD 620'deki absorbans_2,0'a ulaşana kadar bakteri üreme eğrilerini izlemek için bir spektrofotometre kullanarak optik yoğunluğu (OD) ölçün.
12. Bakteriyel peletleri ve şartlandırılmış ortamı 15 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüjleme yaparak ayırın. Toplanan bakteri peletlerini 1x PBS ile yıkayın ve % 10 fetal sığır serumu ile desteklenmiş 4 mL RPMI 1640'ta yeniden dürtün. Ortama antibiyotik eklemeyin.
13. Bakteriyel peletleri RPMI'de saklayın ve 100 rpm hızında% 5 CO 2 ile 37 °C'de₄ saat boyunca bir çalkalayıcı inkübatörde kuluçkaya yatırın.
14. Probiyotik süpernatantın hazırlanması için, bakteri peletini 1000 x g'dasantrifüjleme yoluyla 4 °C'de 15 dakika boyunca çıkarın. Kurtarılan süpernatantı 0,22 μm filtre kullanarak steril filtreleyin ve kullanıma kadar −80 °C'de saklayın.

2. Küresellerin üretimi

1. Kolorektal kanser hücre hatları hazırlanıyor
   1. DLD-1, HT-29 ve WiDr hücre hatlarını %70-80 konfülansa kadar monolayer olarak büyütün ve plakayı %5 CO₂ inkübatöründe 37 °C'de kuluçkaya yatırın (Büyüme ortamı: %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin-streptomin içeren RPMI).
   2. 100 mm Petri kabında yetişen hücreler için, plakayı 4 mL 1x PBS ile iki kez yıkayın. % 0.25 tripsin-EDTA'nın 1 mL'sini ekleyin ve hücreleri ayrıştırmak için Petri kabını% 5 CO 2 inkübatörde 37 ° C'de₂ dakika kuluçkaya yatırın.
   3. kuluçkadan sonra, mikroskop altında hücre ayrışması olup olmadığını kontrol edin ve 5 mL büyüme ortamı ile tripsin-EDTA'yı nötralize edin.
   4. Ayrışmış hücreleri 15 mL konik tüpe ve santrifüje 300 x g'da 3 dakika aktarın.
   5. Süpernatant atın ve 3 mL büyüme ortamı ile hafifçe yeniden diriltin.
   6. Hemositometre kullanarak uygulanabilir hücreleri belirlemek için tripan mavisi olan hücreleri sayın. (Şekil 1B (i))
2. Küresel oluşum
   1. 15 mL konik tüpte, hücreleri 2,1,5'ten seyrelterek 1 - 2 x 10⁵ hücre/mL elde edin (Şekil 1B (ii))
   2. Hücre süspansiyonuna% 0.6 metilselülozun son konsantrasyonu ekleyin ve seyreltilmiş hücreleri steril bir rezervuara aktarın.
      NOT: Her hücre hattı için ihtiyaç duyulan metilselüloz miktarı titratlanmalı ve buna göre belirlenmelidir.
   3. Ultra düşük ekli 96 kuyulu yuvarlak alt mikro plakanın her kuyusuna 200 μL hücre dağıtmak için çok kanallı bir pipet kullanın. (Şekil 1B (iii))
   4. Plakayı 37 °C'de% 5 CO₂ inkübatörde 24 - 36 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
   5. 24 - 36 saat sonra, küresel oluşumu sağlamak için plakayı hafif bir mikroskop altında gözlemleyin.

3. LCFS ile 3D kolorektal kanser hücrelerinin tedavisi

1. Adım 2 ve 3'te açıklandığı gibi küreseller oluşturun.
2. LCFS tedavisini yapmadan önce, donmuş LCFS'yi oda sıcaklığında (RT) 10 - 20 dakika çözün.
3. LCFS stok çözümünü bir büyüme ortamına aşıla. Büyüme ortamında seri olarak %25, %12,5 ve %6 oranında seyreltin (yani% 25 LCFS = 150 μL büyüme ortamı + 50 μL LCFS).
4. Sferoid içeren hücre kültürü plakasını inkübatörden çıkarın ve 200 μL pipet kullanarak her kuyudan mümkün olduğunca fazla büyüme ortamını çıkarın.
5. Hücrelere LCFS ile büyüme medyasını ekleyin ve 24 - 48 saat boyunca% 5 CO₂ inkübatörde 37 ° C'de kuluçkaya yatırın.
   NOT: Kullanılacak hacim plaka boyutuna aşağıdaki gibi bağlı olacaktır: 6 kuyulu hücre kültürü plakaları için 2 mL; 96 kuyulu hücre kültürü plakaları için 200 μL.

4. Küreseller için hücre canlılığı

1. Opak duvarlı çok kuyulu plakalarda 8 - 10 LCFS ile tedavi edilen kolorektal kanser sferoidleri hazırlayın (hücre canlılığı tahlilleri LCFS tedavisinden sonra 48 saat yapılır).
2. Hücre canlılığı reaktifini (bkz. Malzeme Tablosu) 4 °C'de bir gece boyunca çözün.
3. Kullanmadan önce hücre canlılığını oda sıcaklığına aşındırın.
4. Tahlil yapmadan önce, büyüme ortamlarının% 50'sini küresellerden çıkarın.
5. Her kuyuya 100 μL hücre canlılığı reaktifi ekleyin.
   NOT: Kullanılacak hacim plaka boyutuna aşağıdaki gibi bağlı olacaktır: 96 kuyulu hücre kültürü plakaları için 100 μL.
6. Hücre lizizini teşvik etmek için reaktifi 5 dakika boyunca kuvvetlice karıştırın.
7. 37 °C'de 30 dk – 2 saat kuluçkaya yaslayın.
8. Lüminesansı kaydet.

5. Küreseller için nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyon analizi

1. Her durum için, 2 mL'lik bir tüpte 10 - 15 sferoid hazırlayın ve 400 x g'da 3 dakika santrifüj hazırlayın.
2. Süpernatantı atın ve küreselleri 1 mL buz gibi 1x PBS'de iki kez yıkayın.
   NOT: Santrifüjlemeden kaçının, küresellerin yerleşmesine izin verin.
3. 1x PBS'den mümkün olduğunca fazla emiş edin ve piyasada bulunan bir kit kullanarak RNA'yı izole edin.
4. Üreticinin protokolüne göre piyasada bulunan bir kit kullanarak cDNA'yı 1 μg RNA'dan sentezleyin.
5. Tüm örnekleri üç taraflı olarak çalıştırmak için bir ana karışım hazırlayın (bkz. Tablo 1 ve Tablo 2).
6. Amplifikasyonu her qPCR plakasına şablon ana karışımının 20 μL'lik bir bölümünde iyi bir şekilde gerçekleştirin.
7. Reaksiyonları iyice karıştırın ve gerekirse döndürün.
8. Numuneleri cihaz üreticisinin önerilerine göre çalıştırın (Tablo 3).

6. Küresellerden batı şişkinliği

NOT: Küreselleri toplarken, 200 μL pipet kullanın ve yapılarını bozmamak için uçların ucunu kesin.

1. Her durum için, 2 mL'lik bir tüpte 30 - 40 sferoid hazırlayın.
2. Tüpü buza yerleştirin ve küresellerin 2 mL tüpün dibine yerleşmesine izin verin.
3. Süpernatantı atın ve küreselleri 1 mL buz gibi 1x PBS'de iki kez yıkayın
   NOT: Santrifüjlemeden kaçının, küresellerin yerleşmesine izin verin.
4. 1x PBS'den mümkün olduğunca fazla emiş ve bir proteaz inhibitörü kokteyli (10 küresel = 30 μL RIPA tamponu) ile RIPA tamponu ekleyin.
5. Hücreleri yukarı ve aşağı pipetleme ile lyse ve 10 döngü boyunca buz üzerinde 30 s dinlenme ile 30 s sonication gerçekleştirin.
6. Protein lysates'i 15000 x g'da 4 °C'de 15 dakika santrifüj edin.
7. Her hücre lisat için protein konsantrasyonu belirleyin.
8. Yüklemeden önce, her hücre lisat 10 dakika boyunca 100 °C'de bir örnek tamponda kaynatın.
9. SDS-PAGE jelinin kuyularına eşit miktarda protein yükleyin ve jeli 100 V'ta 1 - 2 saat çalıştırın.
10. Proteini jelden PVDF membranlarına aktarın.
11. Aktardıktan sonra, bir bloklama tamponu kullanarak membranı oda sıcaklığında 1 saat boyunca engelleyin (%5 yağsız süt + %0,05 Ara-20 ile TBS).
12. Membranı 1:1.000 primer antikor seyreltme ile kuluçkaya yatırın (Tablo 4) 1x TBST'de% 5 BSA tampon ile bir gecede 4 °C.
13. Membranı TBST ile üç kez yıkayın, her yıkama için 15 dk.
14. Membranı 2 saat boyunca oda sıcaklığında blokaj tamponunda 1:2.500 ikincil antikor seyreltmesi ile kuluçkaya yatırın(bkz. Malzeme Tablosu).
15. Membranı TBST ile üç kez yıkayın, her yıkama için 15 dk.
16. Membranı bir chemiluminescent substrat ile HRP tespiti için hazırlayın.
17. Chemiluminescent görüntüleri alın.

7. Sferoidlerin propidium iyodür (PI) lekesi

1. Adım 4.1'de açıklandığı gibi 5-10 küresel hazırlayın ve küreselleri 37 °C ve% 5 CO_2'debir inkübatöre yerleştirin.
2. 1x PBS'de PI 1:100'ün 1 mg/mL stokunu seyreltin.
3. 96 kuyu plakasının her kuyusundan ortamın% 50'sini çıkarın.
4. Her kuyuya 100 μL PI çözeltisi ekleyin ve kuyuları 37 °C'de bir inkübatöre ve 10 - 15 dakika boyunca% 5 CO_2'ye yerleştirin.
5. PI çözümünü 1x PBS ile yıkayın.
6. 200 μL büyüme ortamı ekleyin ve floresan mikroskop kullanarak görüntü alın. Küreselin canlılık sayısını elde etmek için Görüntü J'yi kullanarak floresan yoğunluğunu analiz edin.

8. Küresel sferoidlerin FACS analizi

1. Daha önce açıklandığı gibi küreseller oluşturun.
2. Her durum için, bir FACS tüpünde 30 - 40 sferoid hazırlayın ve 400 x g ve RT'de 3 dakika santrifüj hazırlayın.
3. Süpernatantı emiş edin ve küreselleri 1x PBS'nin 3 mL'sinde yıkayın, ardından 4 °C'de 3 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjün.
4. Süpernatantı aspire edin ve% 0.25 Trypsin-EDTA'nın 200 μL'sini ekleyin, ardından RT'de 2 -3 dakika kuluçkaya yatırın.
   NOT: Kuluçka süresi küresel boyuta ve hücre tipine bağlıdır.
5. 1 mL FACS tamponu ekleyin ve 200 μL pipet kullanarak küreselleri hafifçe dağıtın.
6. Ayrışmış hücreleri 400 x g ve 4 °C'de 3 dakika santrifüj edin.
   NOT: FACS arabelleği = 1x PBS + %2,5 FBS, 0,22 μm üst filtre kullanılarak filtrelenmiştir.
7. Üstnatan atın ve 7-AAD/Annexin V reaktif (7AAD (5 μL), Annexin V (5 μL)/sample ekleyin.
8. Hücreleri hafifçe girdaplayın ve karanlıkta RT'de 13 - 30 dakika kuluçkaya yatırın.
9. 500 μL FACS tamponu ekleyin ve toplam hücreleri çıkarmak için konik polistiren test tüpleri kullanarak hücreleri filtreleyin.
10. 3 dakika boyunca 400 x g ve 4 °C'de santrifüj.
11. Her tüpe 500 μL Ek V bağlama tamponu ekleyin ve yeniden dirildi.
12. Akış sitometresi kullanarak analiz edin.

Sonuçlar

Çeşitli kolorektal kanser hücre hatlarından sferoid elde etme protokolünü açıklıyoruz. Sferoid üretmek için metilselüloz ile takviye gerekiyordu. Ayrıca LCFS hazırlama yöntemini sunuyoruz ve probiyotikler ile kolorektal kanser arasındaki korelasyonu incelemek için bir model sunuyoruz. Küresel formasyon ve LCFS hazırlama protokolleri Şekil 1A,B'deşematik olarak gösterilmiştir. Şekil 2A'dagösterildiği gibi, %0,6'luk metil...

Tartışmalar

Komşu hücreler ve hücre dışı matris (ECM) de dahil olmak üzere doku mikroçevrasyonu doku üretimi için temeldir ve hücre büyümesi ve doku gelişiminin kontrolünde çok önemlidir¹³. Bununla birlikte, 2D kültürlerin hücresel etkileşimlerin bozulması, hücre morfolojisindeki değişiklikler, hücre dışı ortamlar ve bölüm¹⁴yaklaşımı gibi çeşitli dezavantajları vardır. 3D hücre kültürü sistemleri in vivo etkileri daha iyi üretmek için titizli...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 15-well, 15 µl	Biorad	4561036	Pkg of 10
Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	100 covers
10x transfer buffer	Intron	IBS-BT031A	1 L
10X Tris-Glycine (W/SDS)	Intron	IBS-BT014	1 L
Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube, Polypropylene, Clear, Nonsterile, 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case	Corning	SCT-200-C	500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case
BD Difco Bacto Agar	BD	214010	500 g
BD Difco Lactobacilli MRS Broth	BD	DF0881-17-5	500 g
CellTiter-Glo 3D Cell viability assay	Promega	G9681	100μl/assay in 96-well plates
Complete Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	11697498001	vial of 20 tablets
Corning Phosphate-Buffered Saline, 1X without calcium and magnesium, PH 7.4 ± 0.1	Corning	21-040-CV	500 mL
EMD Millipore Immobilon-P PVDF Transfer Membranes	fisher Scientific	IPVH00010	26.5cm x 3.75m roll; Pore Size: 0.45um
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235	25/Pack, 500/Case
Fetal Bovine Serum, certified, US origin	Thermo Fisher Scientific	16000044	500 mL
iScript cDNA Synthesis Kit, 25 x 20 µl rxns #1708890	Biorad	1708890	25 x 20 µL rxns
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Biorad	1725121	5 x 1 mL
Lactobacillus fermentum	Korean Collection for Type Cultures	KCTC 3112
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Sigma-Aldrich	C6852-25G	25 g
Methyl Cellulose (3500-5600mPa·s, 2% in Water at 20°C)	TCI	M0185	500 g
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL	Applied Biosystems	4346906	20 plates
Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized	Millipore	SLGS033SB	250
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AAD	Biolegend	640934	100 tests
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122	100 mL
Propidium Iodide	Introgen	P1304MP	100 mg
RIPA Lysis and Extraction Buffer	Thermo Fisher Scientific	89901	250 mL
RNeasy Mini Kit (250)	Qiagen	74106	250
RPMI-1640	Gibco	11875-119	500 mL
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200056	100 mL
Name of Materials/Equipment/Software	Company	Catalog Number	Comments/Description
anti - p-IκBα (B-9)	Santa cruze	sc-8404	200 µg/mL
anti-BclxL (H-5)	Santa cruze	sc-8392	200 µg/mL
anti-PARP 1 (C2-10)	Santa cruze	sc-53643	50 µl ascites
anti-β-actin (C4)	Santa cruze	sc-47778	200 µg/mL
BD FACSVerse	BD Biosciences		San Diego, CA, USA
Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader	BioT	S1LFA
CO2 incubator	Thermo fisher	HERAcell 150i
Conical tube 15 ml	SPL	50015
Conical tube 50 ml	SPL	50050
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate	Sigma-Aldrich	CLS7007
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate	Sigma-Aldrich	CLS3471
Costar 50 mL Reagent Reservoirs, 5/Bag, Sterile	Costar	4870
Countess Cell Counting Chamber Slides	Thermofisher	C10228
Countess II FL Automated Cell Counter	invitrogen	AMQAF1000
EnSpire Multimode Reader	Perkin Elmer		Enspire 2300
Eppendorf Research Plus Multi Channel Pipette, 8-channel	Eppendorf	3122000051
FlowJo software	TreeStar		Ashland, OR, USA
Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	115-035-062	1.5 mL
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	111-035-144	2.0 mL
GraphPad Prism 5	GraphPad Software		Inc., San Diego, CA, USA
ImageJ	NIH
ImageQuant LAS 4000 mini	Fujifilm		Tokyo, Japan
Incubated shaker	Lab companion	SIF-6000R
Multi Gauge Ver. 3.0,	Fujifilm		Tokyo, Japan
Optical density (OD)LAMBDA UV/Vis Spectrophotometers	Perkin Elmer		Waltham, MA, USA
Phase-contrast microscope	Olympus		Tokyo, Japan
SPL microcentrifuge tube 1.5mL	SPL	60015
SPL Multi Channel Reservoirs, 12-Chs, PS, Sterile	SPL	21012
StepOnePlus Real-Time PCR system	Thermo Fisher Scientific		Waltham, MA, USA
Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processors	SONICS-vibra cell	VC 505	500 Watt ultrasonic processor
Vinyl Anaerobic Chamber	COY LAB PRODUCTS