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Resumen

Aquí se presentan métodos para comprender los efectos anticancerígenos del sobrenadante libre de células de Lactobacillus (LCFS). Las líneas celulares de cáncer colorrectal muestran muertes celulares cuando se tratan con LCFS en cultivos 3D. El proceso de generación de esferoides se puede optimizar dependiendo del andamio y los métodos de análisis presentados son útiles para evaluar las vías de señalización involucradas.

Resumen

Este manuscrito describe un protocolo para evaluar las muertes de células cancerosas en esferoides tridimensionales (3D) de tipos multicelulares de células cancerosas utilizando sobrenadantes del cultivo celular de Lactobacillus fermentum, considerados como cultivos probióticos. El uso de cultivos 3D para probar el sobrenadante libre de células de Lactobacillus (LCFS) es una mejor opción que las pruebas en monocapas 2D, especialmente porque L. fermentum puede producir efectos anticancerígenos dentro del intestino. Se identificó que el sobrenadante L. fermentum posee un aumento de los efectos antiproliferativos contra varias células de cáncer colorrectal (CCR) en condiciones de cultivo 3D. Curiosamente, estos efectos estaban fuertemente relacionados con el modelo de cultivo, demostrando la notable capacidad de L. fermentum para inducir la muerte de las células cancerosas. Se generaron esferoides estables a partir de diversos RC (células de cáncer colorrectal) utilizando el protocolo que se presenta a continuación. Este protocolo de generación de esferoides 3D ahorra tiempo y es rentable. Este sistema fue desarrollado para investigar fácilmente los efectos anticancerígenos de LCFS en múltiples tipos de esferoides CRC. Como era de esperar, los esferoides del CCR tratados con LCFS indujeron fuertemente la muerte celular durante el experimento y expresaron marcadores moleculares específicos de apoptosis analizados por qRT-PCR, western blotting y análisis FACS. Por lo tanto, este método es valioso para explorar la viabilidad celular y evaluar la eficacia de los medicamentos contra el cáncer.

Introducción

Los probióticos son los microorganismos más ventajosos en el intestino que mejoran la homeostasis inmune y el metabolismo energético del huésped1. Los probióticos de Lactobacillus y Bifidobacterium son los más avanzados de su tipo que se encuentran en el intestino2,3. Investigaciones anteriores han demostrado que Lactobacillus tiene efectos inhibitorios y antiproliferativos en varios tipos de cáncer, incluido el cáncer colorrectal4. Además, los probióticos previenen las enfermedades inflamatorias intestinales, la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa5,6. Sin embargo, la mayoría de los estudios con probióticos se realizaron en monocapas bidimensionales (2D) que se cultivan en superficies sólidas.

Los sistemas de cultivo artificial carecen de características ambientales, lo que no es natural para las células cancerosas. Para superar esta limitación, se han desarrollado sistemas de cultivo tridimensionales (3D)7,8. Las células cancerosas en 3D muestran mejoras en términos de mecanismos biológicos básicos, como la viabilidad celular, la proliferación, la morfología, la comunicación célula-célula, la sensibilidad a los medicamentos y la relevancia in vivo9,10. Además, los esferoides están hechos de tipos multicelulares de cáncer colorrectal y dependen de las interacciones célula-célula y de la matriz extracelular (ECM)11. Nuestro estudio anterior ha informado que el sobrenadante probiótico libre de células (SFC) producido con Lactobacillus fermentum mostró efectos anticancerígenos en cultivos 3D de células de cáncer colorrectal (CCR)12. Propusimos que el SFC es una estrategia alternativa adecuada para probar los efectos probióticos en los esferoides 3D12.

Aquí, presentamos un enfoque que puede acomodar tipos multicelulares de cáncer colorrectal 3D para el análisis de los efectos terapéuticos del sobrenadante libre de células probióticas (SFC) en varios sistemas de imitación del cáncer colorrectal 3D. Este método proporciona un medio para el análisis de los efectos probióticos y anticancerígenos relacionados in vitro.

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Protocolo

1. Cultivos celulares bacterianos y preparación de sobrenadante libre de células de Lactobacillus (LCFS)

NOTA: Los pasos 1.2 – 1.9 se llevan a cabo en una cámara anaeróbica.

  1. Prepare un plato de agar MRS y un caldo que contenga L-cisteína y esterilize en autoclave.
  2. Preincubar la placa de agar MRS en cámara anaeróbica H2 mantenida a 37 °C con 20 ppm de oxígeno.
  3. Descongelar la población bacteriana de Lactobacillus e inocular la placa de agar con el cultivo bacteriano (Figura 1A (i)).
  4. Incubar bacterias durante 2 - 3 días en cámara anaeróbica H2 a 37 °C y 20 ppm de oxígeno hasta obtener colonias bacterianas individuales.
  5. Lavar y secar el tubo de cultivo anaeróbico tipo Hungate. Autoclave el tubo de cultivo a 121 °C durante 15 min.
  6. Luego incube el tubo en la cámara anaeróbica H2 a 37 ° C y 20 ppm de oxígeno para eliminar el oxígeno.
  7. Coloque 2 - 3 ml de caldo MRS en el tubo. Selle el tubo con un tapón de goma de butilo y atornille la tapa.
  8. Obtener una sola colonia con un bucle y colocarla en el tubo de cultivo de 1,5 mL con 500 μL de 1x PBS. (Figura 1A (ii)).
  9. Suspender la colonia usando una jeringa de 1 ml (Figura 1A (iii)). Haga esto insertando la aguja de la jeringa de 1 ml en el centro de la tapa del tubo, aspirando la colonia suspendida y luego volvándola a suspender en el medio de caldo MRS. (Figura 1A (iv)).
  10. Incubar el medio de caldo MRS en una incubadora agitador durante 2 días (37 °C, 5% CO2,200 rpm).
  11. Mida la densidad óptica (OD) usando un espectrofotómetro para monitorear las curvas de crecimiento bacteriano hasta que la absorbancia en OD620 alcance 2.0.
  12. Separar los gránulos bacterianos y los medios acondicionados centrifugando a 1.000 x g durante 15 min. Lavar los gránulos bacterianos recolectados con 1x PBS y resuspend en 4 mL de RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10%. No incluya ningún antibiótico en el medio.
  13. Mantenga los gránulos bacterianos en RPMI e incube en una incubadora agitador durante 4 h a 37 °C con 5% de CO2 a una velocidad de 100 rpm.
  14. Para la preparación del sobrenadante probiótico, retire el gránulo bacteriano mediante centrifugación a 1000 x g,durante 15 min a 4 °C. Filtre estérilmente el sobrenadante recuperado utilizando un filtro de 0,22 μm y guárdelo a -80 °C hasta su uso.

2. Generación de esferoides

  1. Preparación de líneas celulares de cáncer colorrectal
    1. Cultive líneas celulares DLD-1, HT-29 y WiDr como monocapas hasta una confluencia del 70-80% e incube la placa a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5% (medio de crecimiento: RPMI que contiene 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina).
    2. Para las células cultivadas en placa de Petri de 100 mm, lave la placa dos veces con 4 ml de 1x PBS. Añadir 1 ml de tripsina-EDTA al 0,25% e incubar la placa de Petri durante 2 min a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5% para disociar las células.
    3. Después de la incubación, verifique la disociación celular bajo un microscopio y neutralice la tripsina-EDTA con 5 ml de medio de crecimiento.
    4. Transfiera las células disociadas a un tubo cónico de 15 ml y centrífuga durante 3 min a 300 x g.
    5. Deseche el sobrenadante y vuelva a suuspend suavemente con 3 ml de medios de crecimiento.
    6. Cuente las células con azul de tripano para determinar las células viables utilizando un hemocitómetro. (Figura 1B (i))
  2. Formación de esferoides
    1. En un tubo cónico de 15 ml, diluir las células de 2.1.5 para obtener 1 - 2 x 105 células/ml (Figura 1B (ii))
    2. Añadir la concentración final de metilcelulosa al 0,6% a la suspensión celular y transferir las células diluidas a un reservorio estéril.
      NOTA: Para cada línea celular, la cantidad de metilcelulosa necesaria debe ajustarse y determinarse en consecuencia.
    3. Utilice una pipeta multicanal para dispensar 200 μL de células a cada pozo de una microplaca inferior redonda de 96 pozos de fijación ultra baja. (Figura 1B (iii))
    4. Incubar la placa a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5% durante 24 - 36 h.
    5. Después de 24 a 36 h, observe la placa bajo un microscopio de luz para garantizar la formación de esferoides.

3. Tratamiento de células de cáncer colorrectal 3D con LCFS

  1. Genere esferoides como se describe en los pasos 2 y 3.
  2. Antes de realizar el tratamiento LCFS, descongele el LCFS congelado a temperatura ambiente (RT) durante 10 - 20 min.
  3. Inocular la solución de acciones de LCFS en un medio de crecimiento. Diluir en serie a 25%, 12.5% y 6% en el medio de crecimiento (es decir, 25% LCFS = 150 μL de medio de crecimiento + 50 μL de LCFS).
  4. Saque la placa de cultivo celular que contiene esferoides de la incubadora y retire la mayor cantidad posible del medio de crecimiento de cada pozo con una pipeta de 200 μL.
  5. Añadir los medios de crecimiento con LCFS en las células e incubar a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5% durante 24 - 48 h.
    NOTA: El volumen a utilizar dependerá del tamaño de la placa de la siguiente manera: 2 ml para placas de cultivo celular de 6 pozos; 200 μL para placas de cultivo celular de 96 pozos.

4. Viabilidad celular para esferoides

  1. Preparar de 8 a 10 esferoides de cáncer colorrectal tratados con LCFS en placas multiso de pared opaca (los ensayos de viabilidad celular se realizan 48 h después del tratamiento con LCFS).
  2. Descongele el reactivo de viabilidad celular (ver Tabla de Materiales)a 4 °C durante la noche.
  3. Equilibre el reactivo de viabilidad celular a temperatura ambiente antes de su uso.
  4. Antes de realizar el ensayo, retire el 50% de los medios de crecimiento de los esferoides.
  5. Añadir 100 μL de reactivo de viabilidad celular a cada pozo.
    NOTA: El volumen a utilizar dependerá del tamaño de la placa de la siguiente manera: 100 μL para placas de cultivo celular de 96 pozos.
  6. Mezcle el reactivo vigorosamente durante 5 minutos para promover la lisis celular.
  7. Incubar durante 30 min – 2 h a 37 °C.
  8. Registre la luminiscencia.

5. Análisis cuantitativo de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real para esferoides

  1. Para cada condición, prepare de 10 a 15 esferoides en un tubo de 2 ml y centrífuga durante 3 minutos a 400 x g.
  2. Deseche el sobrenadante y lave los esferoides dos veces en 1 ml de 1x PBS helado.
    NOTA: Evite la centrifugación, deje que los esferoides se asienten.
  3. Aspire la mayor cantidad posible de 1x PBS y aísle el ARN utilizando un kit disponible comercialmente.
  4. Sintetizar ADNc a partir de 1 μg de ARN utilizando un kit disponible comercialmente según el protocolo del fabricante.
  5. Preparar una mezcla maestra para ejecutar todas las muestras por triplicado (consulte la Tabla 1 y la Tabla 2).
  6. Realice la amplificación en 20 μL de la mezcla maestra de plantilla en cada pozo de placa qPCR.
  7. Mezcle bien las reacciones y gire si es necesario.
  8. Ejecute muestras según las recomendaciones del fabricante del instrumento (Tabla 3).

6. Western blotting de esferoides

NOTA: Al recolectar esferoides, use una pipeta de 200 μL y corte el extremo de las puntas para evitar perturbar su estructura.

  1. Para cada condición, prepare de 30 a 40 esferoides en un tubo de 2 ml.
  2. Coloque el tubo sobre hielo y deje que los esferoides se asienten en la parte inferior del tubo de 2 ml.
  3. Deseche el sobrenadante y lave los esferoides dos veces en 1 ml de PBS helado 1x PBS
    NOTA: Evite la centrifugación, deje que los esferoides se asienten.
  4. Aspire la mayor cantidad posible de 1x PBS y agregue tampón RIPA con un cóctel inhibidor de proteasa (10 esferoides = 30 μL de tampón RIPA).
  5. Lise las células mediante pipeteos hacia arriba y hacia abajo y realice la sonicación durante 30 s con 30 s de reposo sobre hielo durante 10 ciclos.
  6. Centrifugar la proteína lisatos a 15000 x g durante 15 min a 4 °C.
  7. Determinar la concentración de proteínas para cada célula lisada.
  8. Antes de cargar, hierva cada célula lisada en un tampón de muestra a 100 °C durante 10 min.
  9. Cargue cantidades iguales de proteína en los pozos del gel SDS-PAGE y ejecute el gel durante 1 a 2 h a 100 V.
  10. Transfiera la proteína del gel a la membrana de PVDF.
  11. Después de la transferencia, bloquee la membrana durante 1 h a temperatura ambiente utilizando un tampón de bloqueo (5% de leche descremada + TBS con 0.05% Tween-20).
  12. Incubar la membrana con diluciones 1:1.000 de anticuerpo primario(Tabla 4)en 1x TBST con tampón BSA al 5% a 4 °C durante la noche.
  13. Lave la membrana tres veces con TBST, 15 min por cada lavado.
  14. Incubar la membrana con diluciones 1:2.500 de anticuerpos secundarios en el tampón de bloqueo a temperatura ambiente durante 2 h (ver Tabla de Materiales).
  15. Lave la membrana tres veces con TBST, 15 min por cada lavado.
  16. Prepare la membrana para la detección de HRP con un sustrato quimioluminiscente.
  17. Adquirir imágenes quimioluminiscentes.

7. Tinción de yoduro de propidio (PI) de esferoides

  1. Prepare 5-10 esferoides como se describe en el Paso 4.1 y coloque los esferoides en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO2.
  2. Diluya un stock de 1 mg/ml de PI 1:100 en 1x PBS.
  3. Retire el 50% del medio de cada pozo de la placa de 96 pozos.
  4. Agregue 100 μL de la solución PI a cada pozo y coloque los pozos en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO2 durante 10 - 15 min.
  5. Lave la solución PI con 1x PBS.
  6. Agregue 200 μL de medio de crecimiento y tome una imagen con un microscopio de fluorescencia. Analice la intensidad de la fluorescencia utilizando la Imagen J para obtener el recuento de viabilidad del esferoide.

8. Análisis FACS de esferoides

  1. Generar esferoides como se describió anteriormente.
  2. Para cada condición, prepare de 30 a 40 esferoides en un tubo FACS y centrífuga durante 3 minutos a 400 x g y RT.
  3. Aspire el sobrenadante y lave los esferoides en 3 ml de 1x PBS, luego centrífuga a 400 x g durante 3 min a 4 °C.
  4. Aspire el sobrenadante y agregue 200 μL de tripsina-EDTA al 0,25%, luego incube en RT durante 2 -3 min.
    NOTA: El tiempo de incubación depende del tamaño del esferoide y del tipo de célula.
  5. Agregue 1 ml de tampón FACS y disocia suavemente los esferoides con una pipeta de 200 μL.
  6. Centrifugar las células disociadas a 400 x g y 4 °C durante 3 min.
    NOTA: Búfer FACS = 1x PBS + 2.5% FBS, filtrado usando un filtro superior de 0.22 μm.
  7. Deseche el sobrenadante y añada el reactivo 7-AAD/Annexin V (7AAD (5 μL), Annexin V (5 μL)/muestra).
  8. Vórtice suavemente las células e incube durante 13 a 30 minutos en RT en la oscuridad.
  9. Agregue 500 μL de tampón FACS y filtre las células utilizando tubos de ensayo de poliestireno cónico para eliminar las células agregadas.
  10. Centrifugadora a 400 x g y 4 °C durante 3 min.
  11. Añadir 500 μL de tampón de unión a la anexina V a cada tubo y resuspend.
  12. Analice utilizando un citómetro de flujo.

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Resultados

Describimos el protocolo de obtención de esferoides a partir de diversas líneas celulares de cáncer colorrectal. Se requirió suplementación con metilcelulosa para generar esferoides. También presentamos un método de preparación de LCFS y presentamos un modelo para estudiar la correlación entre los probióticos y el cáncer colorrectal. Los protocolos de formación de esferoides y preparación de LCFS se ilustran esquemáticamente en la Figura 1A,B. Como se muestra e...

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Discusión

El microambiente tisular, incluyendo las células vecinas y la matriz extracelular (ECM), es fundamental para la generación de tejidos y crucial en el control del crecimiento celular y el desarrollo tisular13. Sin embargo, los cultivos 2D tienen varias desventajas, como la interrupción de las interacciones celulares, así como alteraciones en la morfología celular, los ambientes extracelulares y el enfoque de la división14. Los sistemas de cultivo celular 3D han sido ri...

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Divulgaciones

Los autores no tienen divulgaciones financieras relevantes.

Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada por los programas "Establecimiento de estándares de medición para química y radiación", número de subvención KRISS-2020-GP2020-0003, y "Desarrollo de estándares de medición y tecnología para biomateriales y convergencia médica", número de subvención KRISS-2020-GP2020-0004, financiado por el Instituto de Investigación de Estándares y Ciencia de Corea. Esta investigación también fue apoyada por el Ministerio de Ciencia y TIC (MSIT), la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF-2019M3A9F3065868), el Ministerio de Salud y Bienestar (MOHW), el Instituto de Desarrollo de la Industria de la Salud de Corea (KHIDI, HI20C0558), el Ministerio de Comercio, Industria y Energía (MOTIE) y el Instituto de Evaluación de Tecnología Industrial de Corea (KEIT, 20009350). ID de ORCID (Hee Min Yoo: 0000-0002-5951-2137; Dukjin Kang: 0000-0002-5924-9674; Seil Kim: 0000-0003-3465-7118; Joo-Eun Lee: 0000-0002-2495-1439; Jina Lee: 0000-0002-3661-3701). Agradecemos a Chang Woo Park por su ayuda con los experimentos.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments

10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 15-well, 15 µl		Biorad4561036Pkg of 10
Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive FilmThermo Fisher Scientific4311971100 covers
10x transfer bufferIntronIBS-BT031A1 L
10X Tris-Glycine (W/SDS)IntronIBS-BT0141 L
Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube, Polypropylene, Clear, Nonsterile, 500 Tubes/Pack, 10 Packs/CaseCorningSCT-200-C500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case
BD Difco Bacto AgarBD214010500 g
BD Difco Lactobacilli MRS BrothBDDF0881-17-5500 g
CellTiter-Glo 3D Cell viability assayPromegaG9681100μl/assay in 96-well plates
Complete Protease Inhibitor CocktailSigma-Aldrich11697498001vial of 20 tablets
Corning Phosphate-Buffered Saline, 1X without calcium and magnesium, PH 7.4 ± 0.1Corning21-040-CV500 mL
EMD Millipore Immobilon-P PVDF Transfer Membranesfisher ScientificIPVH0001026.5cm x 3.75m roll; Pore Size: 0.45um
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap CapCorning35223525/Pack, 500/Case
Fetal Bovine Serum, certified, US originThermo Fisher Scientific16000044500 mL
iScript cDNA Synthesis Kit, 25 x 20 µl rxns #1708890Biorad170889025 x 20 µL rxns
iTaq Universal SYBR Green SupermixBiorad17251215 x 1 mL
Lactobacillus fermentumKorean Collection for Type CulturesKCTC 3112
L-Cysteine hydrochloride monohydrateSigma-AldrichC6852-25G25 g
Methyl Cellulose (3500-5600mPa·s, 2% in Water at 20°C)TCIM0185500 g
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mLApplied Biosystems434690620 plates
Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilizedMilliporeSLGS033SB250
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AADBiolegend640934100 tests
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122100 mL
Propidium IodideIntrogenP1304MP100 mg
RIPA Lysis and Extraction BufferThermo Fisher Scientific89901250 mL
RNeasy Mini Kit (250)Qiagen74106250
RPMI-1640Gibco11875-119500 mL
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redThermo Fisher Scientific25200056100 mL
Name of Materials/Equipment/SoftwareCompanyCatalog NumberComments/Description
anti - p-IκBα (B-9)Santa cruzesc-8404200 µg/mL
anti-BclxL (H-5)Santa cruzesc-8392200 µg/mL
anti-PARP 1 (C2-10)Santa cruzesc-5364350 µl ascites
anti-β-actin (C4)Santa cruzesc-47778200 µg/mL
BD FACSVerseBD BiosciencesSan Diego, CA, USA
Synergy HTX Multi-Mode Microplate ReaderBioTS1LFA
CO2 incubatorThermo fisherHERAcell 150i
Conical tube 15 mlSPL50015
Conical tube 50 mlSPL50050
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well PlateSigma-AldrichCLS7007
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well PlateSigma-AldrichCLS3471
Costar 50 mL Reagent Reservoirs, 5/Bag, SterileCostar4870
Countess Cell Counting Chamber SlidesThermofisherC10228
Countess II FL Automated Cell CounterinvitrogenAMQAF1000
EnSpire Multimode ReaderPerkin ElmerEnspire 2300
Eppendorf Research Plus Multi Channel Pipette, 8-channelEppendorf3122000051
FlowJo softwareTreeStarAshland, OR, USA
Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson immunoresearch115-035-0621.5 mL
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson immunoresearch111-035-1442.0 mL
GraphPad Prism 5GraphPad SoftwareInc., San Diego, CA, USA
ImageJNIH
ImageQuant LAS 4000 miniFujifilmTokyo, Japan
Incubated shakerLab companionSIF-6000R
Multi Gauge Ver. 3.0,FujifilmTokyo, Japan
Optical density (OD)LAMBDA UV/Vis SpectrophotometersPerkin ElmerWaltham, MA, USA
Phase-contrast microscopeOlympusTokyo, Japan
SPL microcentrifuge tube 1.5mLSPL60015
SPL Multi Channel Reservoirs, 12-Chs, PS, SterileSPL21012
StepOnePlus Real-Time PCR systemThermo Fisher ScientificWaltham, MA, USA
Vibra-Cell Ultrasonic Liquid ProcessorsSONICS-vibra cellVC 505500 Watt ultrasonic processor
Vinyl Anaerobic ChamberCOY LAB PRODUCTS

Referencias

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