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Neste Artigo

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Resumo

Aqui são apresentados métodos para entender os efeitos anticânculos do supernatante livre de células Lactobacillus (LCFS). As linhas de células cancerígenas colorretais mostram mortes celulares quando tratadas com LCFS em culturas 3D. O processo de geração de esferoides pode ser otimizado dependendo do andaime e os métodos de análise apresentados são úteis para avaliar as vias de sinalização envolvidas.

Resumo

Este manuscrito descreve um protocolo para avaliar as mortes de células cancerígenas em esferoides tridimensionais (3D) de tipos multicelulares de células cancerígenas usando supernacantes da cultura celular fermentum Lactobacillus, consideradas culturas probióticas. O uso de culturas 3D para testar o supernante livre de células Lactobacillus (LCFS) é uma opção melhor do que testar em monocamadas 2D, especialmente porque l. fermentum pode produzir efeitos anti-câncer dentro do intestino. L. fermentum supernante foi identificado por possuir efeitos anti-proliferativos aumentados contra várias células de câncer colorretal (CRC) em condições de cultura 3D. Curiosamente, esses efeitos estavam fortemente relacionados com o modelo de cultura, demonstrando a notável capacidade de L. fermentum para induzir a morte celular cancerígena. Esferoides estáveis foram gerados a partir de diversos CRCs (células cancerosas colorretais) utilizando o protocolo apresentado abaixo. Este protocolo de geração de spheroid 3D é uma economia de tempo e rentável. Este sistema foi desenvolvido para investigar facilmente os efeitos anticâncológicos do LCFS em vários tipos de spheroids CRC. Como esperado, os spheróides crc tratados com LCFS induziram fortemente a morte celular durante o experimento e expressaram marcadores moleculares específicos de apoptose, conforme analisado por qRT-PCR, manchas ocidentais e análise FACS. Portanto, este método é valioso para explorar a viabilidade celular e avaliar a eficácia de medicamentos anticâncológicos.

Introdução

Os probióticos são os microrganismos mais vantajosos no intestino que melhoram a homeostase imunológica e o metabolismo energético hospedeiro1. Os probióticos de Lactobacillus e Bifidobacterium são os mais avançados do seu tipo encontrados no intestino2,3. Investigações anteriores mostraram que Lactobacillus tem efeitos inibitórios e antiproliferativos em vários cânceres, incluindo câncer colorretal4. Além disso, os probióticos previnem doenças inflamatórias intestinais, doença de Crohn e colite ulcerativa5,6. No entanto, a maioria dos estudos com probióticos foram realizados em monocamadas bidimensionais (2D) cultivadas em superfícies sólidas.

Sistemas de cultura artificial carecem de características ambientais, o que não é natural para células cancerosas. Para superar essa limitação, foram desenvolvidos sistemas de cultura tridimensionais (3D)7,8. Células cancerígenas em 3D apresentam melhorias em termos de mecanismos biológicos básicos, como viabilidade celular, proliferação, morfologia, comunicação celular, sensibilidade a medicamentos e relevância in vivo9,10. Além disso, os esferoides são feitos de tipos multicelulares de câncer colorretal e dependem de interações célula-células e da matriz extracelular (ECM)11. Nosso estudo anterior relatou que o supernaente probiótico livre de células (CFS) produzido usando o fermentum Lactobacillus mostrou efeitos anticânculos nas culturas 3D das células de câncer colorretal (CRC)12. Propusemos que o CFS é uma estratégia alternativa adequada para testar efeitos probióticos em esferoides 3D12.

Aqui, apresentamos uma abordagem que pode acomodar tipos multicelulares de câncer colorretal 3D para a análise de efeitos terapêuticos de supernanato probiótico livre de células (CFS) em vários sistemas de imitação de câncer colorretal 3D. Este método fornece um meio para a análise de efeitos probióticos e anticâncicos relacionados in vitro.

Protocolo

1. Culturas celulares bacterianas e preparação de supernanato livre de células Lactobacillus (LCFS)

NOTA: As etapas 1.2 – 1.9 são realizadas em câmara anaeróbica.

  1. Prepare uma placa de ágar MRS e caldo contendo L-cisteína e esterilize por autoclaving.
  2. Pré-incubar a placa de ágar MRS em H2 câmara anaeróbica mantida a 37 °C com 20 ppm de oxigênio.
  3. Descongele o caldo bacteriano Lactobacillus e inocula a placa de ágar com a cultura bacteriana (Figura 1A (i)).
  4. Incubar bactérias por 2 a 3 dias em H2 câmara anaeróbica a 37 °C e 20 ppm de oxigênio até que sejam obtidas colônias bacterianas únicas.
  5. Lave e seque o tubo de cultura aneróbica do tipo Hungate. Autoclave o tubo de cultura a 121 °C por 15 min.
  6. Em seguida, incubar o tubo na câmara anaeróbica H2 a 37 °C e 20 ppm de oxigênio para remover oxigênio.
  7. Coloque 2 - 3 mL de caldo MRS no tubo. Sele o tubo com uma rolha de borracha de butyl e enrosque a tampa.
  8. Obtenha uma única colônia com um laço e coloque-a no tubo de cultura de 1,5 mL com 500 μL de 1x PBS. (Figura 1A (ii)).
  9. Suspenda a colônia usando uma seringa de 1 mL (Figura 1A (iii). Faça isso inserindo a agulha da seringa de 1 mL no centro da tampa do tubo, aspirando a colônia suspensa e, em seguida, reutilizando-a de volta na mídia de caldo MRS. (Figura 1A (iv)).
  10. Incubar a mídia de caldo MRS em uma incubadora de shaker por 2 dias (37 °C, 5% DE CO2, 200 rpm).
  11. Meça a densidade óptica (OD) usando um espectotômetro para monitorar as curvas de crescimento bacteriana até que a absorção em OD620 atinja 2,0.
  12. Separe as pelotas bacterianas e a mídia condicionada por centrifugação a 1.000 x g por 15 min. Lave as pelotas bacterianas coletadas com 1x PBS e resuspend em 4 mL de RPMI 1640 suplementada com soro bovino fetal de 10%. Não inclua antibióticos no meio.
  13. Mantenha as pelotas bacterianas em RPMI e incubar em uma incubadora de shaker por 4h a 37 °C com 5% de CO2 a uma velocidade de 100 rpm.
  14. Para a preparação do supernanato probiótico, remova a pelota bacteriana através de centrifugação a 1000 x g,por 15 min a 4 °C. Filtro estéril o supernanato recuperado usando um filtro de 0,22 μm e armazene a −80 °C até usar.

2. Geração de esferoides

  1. Preparando linhas de células cancerígenas colorretais
    1. Cresça as linhas celulares DLD-1, HT-29 e WiDr como monocamadas até 70-80% de confluência e incubar a placa a 37 °C em uma incubadora de CO2 de 5% (Meio de crescimento: RPMI contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% penicilina-estreptomicina).
    2. Para células cultivadas em placa de Petri de 100 mm, lave a placa duas vezes com 4 mL de 1x PBS. Adicione 1 mL de 0,25% de trippsina-EDTA e incubar a placa de Petri por 2 min a 37 °C em uma incubadora de CO2 de 5% para dissociar as células.
    3. Após a incubação, verifique se há dissociação celular sob um microscópio e neutralize a trippsina-EDTA com 5 mL de meio de crescimento.
    4. Transfira as células dissociadas para um tubo cônico de 15 mL e centrífuga por 3 min a 300 x g.
    5. Descarte o supernatante e resuspend suavemente com 3 mL de mídia de crescimento.
    6. Conte as células com azul tripano para determinar células viáveis usando um hemócito. (Figura 1B (i))
  2. Formação esferoide
    1. Em um tubo cônico de 15 mL, dilui as células de 2,1,5 para obter 1 - 2 x 105 células/mL (Figura 1B (ii))
    2. Adicione concentração final de 0,6% de metilcelulose à suspensão celular e transfira as células diluídas para um reservatório estéril.
      NOTA: Para cada linha celular, a quantidade de metilcelulose necessária deve ser titulada e determinada em conformidade.
    3. Use uma pipeta multicanal para distribuir 200 μL de células para cada poço de um acessório ultra-baixo de 96 poços de microplacão traseiro redondo. (Figura 1B (iii))
    4. Incubar a placa a 37 °C em uma incubadora de CO2 de 5% por 24 a 36 h.
    5. Após 24 - 36 h, observe a placa sob um microscópio leve para garantir a formação de esferoides.

3. Tratar células cancerígenas colorretais 3D com LCFS

  1. Gerar esferoides como descrito nas etapas 2 e 3.
  2. Antes de realizar o tratamento LCFS, descongele o LCFS congelado à temperatura ambiente (RT) por 10 a 20 min.
  3. Inocular a solução de estoque LCFS em um meio de crescimento. Diluir em série para 25%, 12,5% e 6% no meio de crescimento (ou seja, 25% LCFS = 150 μL de crescimento médio + 50 μL de LCFS).
  4. Retire a placa de cultura celular contendo esferoides da incubadora e remova o máximo possível do meio de crescimento de cada poço usando uma pipeta de 200 μL.
  5. Adicione a mídia de crescimento com LCFS nas células e incubar a 37 °C em uma incubadora de CO2 de 5% para 24 - 48 h.
    NOTA: O volume a ser utilizado dependerá do tamanho da placa da seguinte forma: 2 mL para placas de cultura celular de 6 poços; 200 μL para placas de cultura celular de 96 poços.

4. Viabilidade celular para esferoides

  1. Prepare 8 - 10 esferoides de câncer colorretal tratados com LCFS em placas multi-bem de paredes opacas (ensaios de viabilidade celular são realizados 48 h após o tratamento LCFS).
  2. Descongele o reagente de viabilidade celular (ver Tabela de Materiais) a 4 °C durante a noite.
  3. Equilibre o reagente de viabilidade celular à temperatura ambiente antes do uso.
  4. Antes de realizar o ensaio, remova 50% da mídia de crescimento dos esferoides.
  5. Adicione 100 μL de reagente de viabilidade celular a cada poço.
    NOTA: O volume a ser utilizado dependerá do tamanho da placa da seguinte forma: 100 μL para placas de cultura celular de 96 poços.
  6. Misture o reagente vigorosamente por 5 minutos para promover a lise celular.
  7. Incubar por 30 min – 2 h a 37 °C.
  8. Regisso recorde a luminescência.

5. Análise quantitativa de reação em cadeia de polimerase em tempo real para esferoides

  1. Para cada condição, prepare 10 a 15 esferoides em um tubo de 2 mL e centrífuga por 3 min a 400 x g.
  2. Descarte o supernatante e lave os esferoides duas vezes em 1 mL de 1x PBS gelado.
    NOTA: Evite a centrifugação, deixe os spheróides se acalmarem.
  3. Aspire o máximo possível do PBS 1x e isole o RNA usando um kit comercialmente disponível.
  4. Sintetizar cDNA a partir de 1 μg de RNA usando um kit comercialmente disponível de acordo com o protocolo do fabricante.
  5. Prepare uma mistura mestra para executar todas as amostras em triplicado (ver Tabela 1 e Tabela 2).
  6. Execute bem a amplificação em 20 μL da mistura mestre do modelo em cada placa qPCR.
  7. Misture bem as reações e gire se necessário.
  8. Executar amostras conforme as recomendações do fabricante do instrumento(Tabela 3).

6. Mancha ocidental de esferoides

NOTA: Ao coletar esferoides, use uma pipeta de 200 μL e corte a extremidade das pontas para evitar perturbar sua estrutura.

  1. Para cada condição, prepare 30 a 40 esferoides em um tubo de 2 mL.
  2. Coloque o tubo no gelo e deixe os esferoides se acomodarem até o fundo do tubo de 2 mL.
  3. Descarte o supernatante e lave os esferoides duas vezes em 1 mL gelado 1x PBS
    NOTA: Evite a centrifugação, deixe os spheróides se acalmarem.
  4. Aspire o máximo possível do PBS 1x e adicione tampão RIPA com um coquetel inibidor de protease (10 esferoides = 30 μL de tampão RIPA).
  5. Lyse as células por pipetting para cima e para baixo e realize a sonicação para 30 s com 30 s de descanso no gelo por 10 ciclos.
  6. Centrifugar as proteínas lysates a 15000 x g para 15 min a 4 °C.
  7. Determine a concentração de proteína para cada lise celular.
  8. Antes de carregar, ferva cada célula em um tampão de amostra a 100 °C por 10 minutos.
  9. Carregue quantidades iguais de proteína nos poços do gel SDS-PAGE e execute o gel por 1 - 2 h a 100 V.
  10. Transfira a proteína do gel para a membrana PVDF.
  11. Após a transferência, bloqueie a membrana por 1h à temperatura ambiente usando um tampão de bloqueio (5% de leite desnatado + TBS com 0,05% Tween-20).
  12. Incubar a membrana com diluições de 1:1.000 de anticorpo primário(Tabela 4) em 1x TBST com tampão BSA de 5% a 4 °C durante a noite.
  13. Lave a membrana três vezes com TBST, 15 min para cada lavagem.
  14. Incubar a membrana com diluições de 1:2.500 de anticorpo secundário no tampão de bloqueio à temperatura ambiente por 2 h (ver Tabela de Materiais).
  15. Lave a membrana três vezes com TBST, 15 min para cada lavagem.
  16. Prepare a membrana para detecção de HRP com um substrato chemiluminescente.
  17. Adquira imagens quemiluminescentes.

7. Mancha de esferida de propidium (PI) de esferoides

  1. Prepare 5-10 esferoides conforme descrito na Etapa 4.1 e coloque os esferoides em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO2.
  2. Diluir um estoque de 1 mg/mL de PI 1:100 em 1x PBS.
  3. Retire 50% do meio de cada poço da placa de 96 poços.
  4. Adicione 100 μL da solução PI para cada poço e coloque os poços em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO2 por 10 a 15 min.
  5. Lave a solução PI com 1x PBS.
  6. Adicione 200 μL de meio de crescimento e tire uma imagem usando um microscópio de fluorescência. Analise a intensidade da fluorescência usando a imagem J para obter a contagem de viabilidade do esferoide.

8. Análise FACS de esferoides

  1. Gerar esferoides como descrito anteriormente.
  2. Para cada condição, prepare 30 - 40 esferoides em um tubo FACS e centrífuga por 3 min a 400 x g e RT.
  3. Aspire o supernasal e lave os esferoides em 3 mL de 1x PBS, depois centrífuga a 400 x g por 3 min a 4 °C.
  4. Aspire o supernaente e adicione 200 μL de 0,25% Trypsin-EDTA, depois incubar na RT por 2 -3 min.
    NOTA: O tempo de incubação depende do tamanho esferoide e do tipo celular.
  5. Adicione 1 mL de tampão FACS e dissocia suavemente os esferoides usando uma pipeta de 200 μL.
  6. Centrifugar as células dissociadas a 400 x g e 4 °C por 3 min.
    NOTA: Tampão FACS = 1x PBS + 2,5% FBS, filtrado usando um filtro superior de 0,22 μm.
  7. Descarte o supernasal e adicione reagente 7-AAD/Annexin V (7AAD (5 μL), Anexo V (5 μL)/amostra).
  8. Vórtice suavemente as células e incubar por 13 - 30 min no RT no escuro.
  9. Adicione 500 μL de tampão FACS e filtre as células usando tubos de teste de poliestireno cônico para remover células agregadas.
  10. Centrifugar a 400 x g e 4 °C por 3 min.
  11. Adicione 500 μL de tampão de ligação Anexo V a cada tubo e resuspend.
  12. Analise usando um citômetro de fluxo.

Resultados

Descrevemos o protocolo de obtenção de esferoides de diversas linhas de células cancerígenas colorretais. A suplementação com metilcelulose foi necessária para gerar esferoides. Também apresentamos um método de preparação do LCFS e apresentamos um modelo para estudar a correlação entre probióticos e câncer colorretal. Os protocolos de formação de spheroid e LCFS são ilustrados esquematicamente na Figura 1A,B. Como mostrado na Figura 2A,...

Discussão

O microambiente tecidual, incluindo células vizinhas e a matriz extracelular (ECM), é fundamental para a geração de tecidos e crucial no controle do crescimento celular e desenvolvimento de tecidos13. No entanto, as culturas 2D têm diversas desvantagens, como a interrupção das interações celulares, bem como alterações na morfologia celular, ambientes extracelulares e a abordagem da divisão14. Os sistemas de cultura celular 3D foram rigorosamente estudados para m...

Divulgações

Os autores não têm divulgações financeiras relevantes.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada pelo "Estabelecimento de padrões de medição para Química e Radiação", número de subvenção KRISS-2020-GP2020-0003, e "Desenvolvimento de Padrões de Medição e Tecnologia para Biomateriais e Convergência Médica", número de subvenção KRISS-2020-GP2020-0004, financiado pelo Korea Research Institute of Standards and Science. Esta pesquisa também contou com o apoio do Ministério da Ciência e TIC (MSIT), Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF-2019M3A9F3065868), Ministério da Saúde e Bem-Estar (MOHW), Instituto de Desenvolvimento da Indústria da Saúde da Coreia (KHIDI, HI20C0558), Ministério do Comércio, Indústria & Energia (MOTIE) e Instituto de Avaliação da Coreia de Tecnologia Industrial (KEIT, 20009350). ID ORCID (Hee Min Yoo: 0000-0002-5951-2137; Dukjin Kang: 0000-0002-5924-9674; Seil Kim: 0000-0003-3465-7118; Joo-Eun Lee: 0000-0002-2495-1439; Jina Lee: 0000-0002-3661-3701). Agradecemos ao Parque Chang Woo pela ajuda com experimentos.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments

10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 15-well, 15 µl		Biorad4561036Pkg of 10
Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive FilmThermo Fisher Scientific4311971100 covers
10x transfer bufferIntronIBS-BT031A1 L
10X Tris-Glycine (W/SDS)IntronIBS-BT0141 L
Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube, Polypropylene, Clear, Nonsterile, 500 Tubes/Pack, 10 Packs/CaseCorningSCT-200-C500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case
BD Difco Bacto AgarBD214010500 g
BD Difco Lactobacilli MRS BrothBDDF0881-17-5500 g
CellTiter-Glo 3D Cell viability assayPromegaG9681100μl/assay in 96-well plates
Complete Protease Inhibitor CocktailSigma-Aldrich11697498001vial of 20 tablets
Corning Phosphate-Buffered Saline, 1X without calcium and magnesium, PH 7.4 ± 0.1Corning21-040-CV500 mL
EMD Millipore Immobilon-P PVDF Transfer Membranesfisher ScientificIPVH0001026.5cm x 3.75m roll; Pore Size: 0.45um
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap CapCorning35223525/Pack, 500/Case
Fetal Bovine Serum, certified, US originThermo Fisher Scientific16000044500 mL
iScript cDNA Synthesis Kit, 25 x 20 µl rxns #1708890Biorad170889025 x 20 µL rxns
iTaq Universal SYBR Green SupermixBiorad17251215 x 1 mL
Lactobacillus fermentumKorean Collection for Type CulturesKCTC 3112
L-Cysteine hydrochloride monohydrateSigma-AldrichC6852-25G25 g
Methyl Cellulose (3500-5600mPa·s, 2% in Water at 20°C)TCIM0185500 g
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mLApplied Biosystems434690620 plates
Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilizedMilliporeSLGS033SB250
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AADBiolegend640934100 tests
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122100 mL
Propidium IodideIntrogenP1304MP100 mg
RIPA Lysis and Extraction BufferThermo Fisher Scientific89901250 mL
RNeasy Mini Kit (250)Qiagen74106250
RPMI-1640Gibco11875-119500 mL
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redThermo Fisher Scientific25200056100 mL
Name of Materials/Equipment/SoftwareCompanyCatalog NumberComments/Description
anti - p-IκBα (B-9)Santa cruzesc-8404200 µg/mL
anti-BclxL (H-5)Santa cruzesc-8392200 µg/mL
anti-PARP 1 (C2-10)Santa cruzesc-5364350 µl ascites
anti-β-actin (C4)Santa cruzesc-47778200 µg/mL
BD FACSVerseBD BiosciencesSan Diego, CA, USA
Synergy HTX Multi-Mode Microplate ReaderBioTS1LFA
CO2 incubatorThermo fisherHERAcell 150i
Conical tube 15 mlSPL50015
Conical tube 50 mlSPL50050
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well PlateSigma-AldrichCLS7007
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well PlateSigma-AldrichCLS3471
Costar 50 mL Reagent Reservoirs, 5/Bag, SterileCostar4870
Countess Cell Counting Chamber SlidesThermofisherC10228
Countess II FL Automated Cell CounterinvitrogenAMQAF1000
EnSpire Multimode ReaderPerkin ElmerEnspire 2300
Eppendorf Research Plus Multi Channel Pipette, 8-channelEppendorf3122000051
FlowJo softwareTreeStarAshland, OR, USA
Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson immunoresearch115-035-0621.5 mL
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson immunoresearch111-035-1442.0 mL
GraphPad Prism 5GraphPad SoftwareInc., San Diego, CA, USA
ImageJNIH
ImageQuant LAS 4000 miniFujifilmTokyo, Japan
Incubated shakerLab companionSIF-6000R
Multi Gauge Ver. 3.0,FujifilmTokyo, Japan
Optical density (OD)LAMBDA UV/Vis SpectrophotometersPerkin ElmerWaltham, MA, USA
Phase-contrast microscopeOlympusTokyo, Japan
SPL microcentrifuge tube 1.5mLSPL60015
SPL Multi Channel Reservoirs, 12-Chs, PS, SterileSPL21012
StepOnePlus Real-Time PCR systemThermo Fisher ScientificWaltham, MA, USA
Vibra-Cell Ultrasonic Liquid ProcessorsSONICS-vibra cellVC 505500 Watt ultrasonic processor
Vinyl Anaerobic ChamberCOY LAB PRODUCTS

Referências

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