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Résumé

Ici, des méthodes sont présentées pour comprendre les effets anticancéreux du surnageant sans cellules de Lactobacillus (LCFS). Les lignées cellulaires du cancer colorectal montrent des décès cellulaires lorsqu’elles sont traitées avec LCFS dans des cultures 3D. Le processus de génération de sphéroïdes peut être optimisé en fonction de l’échafaudage et les méthodes d’analyse présentées sont utiles pour évaluer les voies de signalisation impliquées.

Résumé

Ce manuscrit décrit un protocole pour évaluer les décès de cellules cancéreuses dans les sphéroïdes tridimensionnels (3D) de types multicellulaires de cellules cancéreuses en utilisant des surnageants issus de la culture cellulaire Lactobacillus fermentum, considérés comme des cultures probiotiques. L’utilisation de cultures 3D pour tester le surnageant sans cellules de Lactobacillus (LCFS) est une meilleure option que les tests dans des monocouches 2D, d’autant plus que L. fermentum peut produire des effets anticancéreux dans l’intestin. L. fermentum surnageant a été identifié pour posséder des effets anti-prolifératifs accrus contre plusieurs cellules du cancer colorectal (CCR) dans des conditions de culture 3D. Fait intéressant, ces effets étaient fortement liés au modèle de culture, démontrant la capacité notable de L. fermentum à induire la mort des cellules cancéreuses. Des sphéroïdes stables ont été générés à partir de divers CRC (cellules cancéreuses colorectales) en utilisant le protocole présenté ci-dessous. Ce protocole de génération de sphéroïde 3D est un gain de temps et rentable. Ce système a été développé pour étudier facilement les effets anticancéreux du LCFS dans plusieurs types de sphéroïdes du CCR. Comme prévu, les sphéroïdes CRC traités avec LCFS ont fortement induit la mort cellulaire au cours de l’expérience et ont exprimé des marqueurs moléculaires d’apoptose spécifiques tels qu’analysés par qRT-PCR, Western blotting et ANALYSE FACS. Par conséquent, cette méthode est précieuse pour explorer la viabilité cellulaire et évaluer l’efficacité des médicaments anticancéreux.

Introduction

Les probiotiques sont les micro-organismes les plus avantageux dans l’intestin qui améliorent l’homéostasie immunitaire et le métabolisme énergétique de l’hôte1. Les probiotiques de Lactobacillus et Bifidobacterium sont les plus avancés de son genre trouvés dans l’intestin2,3. Des recherches antérieures ont montré que Lactobacillus a des effets inhibiteurs et antiprolifératifs sur plusieurs cancers, y compris le cancer colorectal4. De plus, les probiotiques préviennent les maladies inflammatoires de l’intestin, la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse5,6. Cependant, la plupart des études avec des probiotiques ont été réalisées dans des monocouches bidimensionnelles (2D) qui sont cultivées sur des surfaces solides.

Les systèmes de culture artificielle manquent de caractéristiques environnementales, ce qui n’est pas naturel pour les cellules cancéreuses. Pour surmonter cette limitation, des systèmes de culture tridimensionnels (3D) ont étédéveloppés7,8. Les cellules cancéreuses en 3D montrent des améliorations en termes de mécanismes biologiques de base, tels que la viabilité cellulaire, la prolifération, la morphologie, la communication cellule-cellule, la sensibilité aux médicaments et la pertinence in vivo9,10. De plus, les sphéroïdes sont fabriqués à partir de types multicellulaires de cancer colorectal et dépendent des interactions cellule-cellule et de la matrice extracellulaire (ECM)11. Notre étude précédente a rapporté que le surnageant sans cellules probiotiques (SFC) produit à l’aide de Lactobacillus fermentum a montré des effets anticancéreux sur des cultures 3D de cellules du cancer colorectal (CCR)12. Nous avons proposé que le SFC soit une stratégie alternative appropriée pour tester les effets probiotiques sur les sphéroïdes 3D12.

Ici, nous présentons une approche qui peut accueillir des types multicellulaires de cancer colorectal 3D pour l’analyse des effets thérapeutiques du surnageant sans cellules probiotiques (SFC) sur plusieurs systèmes de mimétisme du cancer colorectal 3D. Cette méthode fournit un moyen pour l’analyse des effets probiotiques et anticancéreux connexes in vitro.

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Protocole

1. Cultures cellulaires bactériennes et préparation du surnageant sans cellules lactobacillus (LCFS)

REMARQUE : Les étapes 1.2 à 1.9 sont effectuées dans une chambre anaérobie.

  1. Préparer une plaque de gélose MRS et un bouillon contenant de la L-cystéine et stériliser par autoclavage.
  2. Pré-incuber la plaque de gélose MRS dans une chambre anaérobieH2 maintenue à 37 °C avec 20 ppm d’oxygène.
  3. Décongeler le stock bactérien de Lactobacillus et inoculer la plaque de gélose avec la culture bactérienne (Figure 1A (i)).
  4. Incuber les bactéries pendant 2 à 3 jours dans une chambre anaérobie H2 à 37 °C et 20 ppm d’oxygène jusqu’à l’obtention de colonies bactériennes uniques.
  5. Lavez et séchez le tube de culture anérobie de type Hungate. Autoclaver le tube de culture à 121 °C pendant 15 min.
  6. Ensuite, incuber le tube dans une chambre anaérobieH2 à 37 °C et 20 ppm d’oxygène pour éliminer l’oxygène.
  7. Placer 2 à 3 mL de bouillon MRS dans le tube. Scellez le tube avec un bouchon en caoutchouc butyle et vissez le bouchon.
  8. Obtenez une seule colonie avec une boucle et placez-la dans le tube de culture de 1,5 mL avec 500 μL de 1x PBS. (Figure 1A (ii)).
  9. Suspendre la colonie à l’aide d’une seringue de 1 mL (Figure 1A (iii)). Pour ce faire, insérez l’aiguille de la seringue de 1 mL au centre du couvercle du tube, en aspirant la colonie en suspension, puis en la réutilisant dans le bouillon MRS. (Figure 1A (iv)).
  10. Incuber le bouillon MRS dans un incubateur shaker pendant 2 jours (37 °C, 5% CO2, 200tr/min).
  11. Mesurez la densité optique (OD) à l’aide d’un spectrophotomètre pour surveiller les courbes de croissance bactérienne jusqu’à ce que l’absorbance à OD620 atteigne 2,0.
  12. Séparer les pastilles bactériennes et le milieu conditionné par centrifugation à 1 000 x g pendant 15 min. Laver les granulés bactériens collectés avec 1x PBS et ressuspendre dans 4 mL de RPMI 1640 complété par 10% de sérum bovin fœtal. N’incluez pas d’antibiotiques dans le milieu.
  13. Maintenir les granulés bactériens dans rpmI et les incuber dans un incubateur agitateur pendant 4 h à 37 °C avec 5 % de CO2 à une vitesse de 100 tr/min.
  14. Pour la préparation du surnageant probiotique, retirer la pastille bactérienne par centrifugation à 1000 x g,pendant 15 min à 4 °C. Filtrer stérilement le surnageant récupéré à l’aide d’un filtre de 0,22 μm et conserver à −80 °C jusqu’à son utilisation.

2. Génération de sphéroïdes

  1. Préparation de lignées cellulaires de cancer colorectal
    1. Cultiver les lignées cellulaires DLD-1, HT-29 et WiDr en monocouches jusqu’à 70-80% de confluence et incuber la plaque à 37 °C dans un incubateur à 5% de CO2 (Milieu de croissance: RPMI contenant 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline-streptomycine).
    2. Pour les cellules cultivées dans une boîte de Petri de 100 mm, laver la plaque deux fois avec 4 mL de 1x PBS. Ajouter 1 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % et incuber la boîte de Petri pendant 2 min à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 pour dissocier les cellules.
    3. Après l’incubation, vérifier la dissociation cellulaire au microscope et neutraliser la trypsine-EDTA avec 5 mL de milieu de croissance.
    4. Transférer les cellules dissociées dans un tube conique de 15 mL et centrifuger pendant 3 min à 300 x g.
    5. Jeter le surnageant et resussuspener doucement avec 3 mL de milieu de croissance.
    6. Comptez les cellules avec du bleu de trypan pour déterminer les cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre. (Figure 1B (i))
  2. Formation de sphéroïdes
    1. Dans un tube conique de 15 mL, diluer les cellules à partir du 2.1.5 pour obtenir 1 - 2 x 105 cellules/mL (Figure 1B (ii))
    2. Ajouter la concentration finale de méthylcellulose à 0,6 % à la suspension cellulaire et transférer les cellules diluées dans un réservoir stérile.
      REMARQUE: Pour chaque lignée cellulaire, la quantité de méthylcellulose nécessaire doit être titrée et déterminée en conséquence.
    3. Utilisez une pipette multicanal pour distribuer 200 μL de cellules à chaque puits d’une microplaque inférieure ronde à 96 puits à fixation ultra-faible. (Figure 1B (iii))
    4. Incuber la plaque à 37 °C dans un incubateur àCO 2 à 5 % pendant 24 à 36 h.
    5. Après 24 à 36 h, observez la plaque au microscope optique pour assurer la formation de sphéroïdes.

3. Traitement des cellules cancéreuses colorectales 3D avec LCFS

  1. Générez des sphéroïdes comme décrit aux étapes 2 et 3.
  2. Avant d’effectuer le traitement LCFS, décongeler le LCFS congelé à température ambiante (RT) pendant 10 à 20 min.
  3. Inoculer la solution stock LCFS dans un milieu de croissance. Diluer en série à 25 %, 12,5 % et 6 % dans le milieu de croissance (c.-à-d. 25 % de LCFS = 150 μL de milieu de croissance + 50 μL de LCFS).
  4. Retirez la plaque de culture cellulaire contenant des sphéroïdes de l’incubateur et retirez autant que possible le milieu de croissance de chaque puits à l’aide d’une pipette de 200 μL.
  5. Ajouter le milieu de croissance avec LCFS sur les cellules et incuber à 37 °C dans un incubateur àCO 2 à 5% pendant 24 à 48 h.
    REMARQUE: Le volume à utiliser dépendra de la taille de la plaque comme suit: 2 mL pour les plaques de culture cellulaire à 6 puits; 200 μL pour les plaques de culture cellulaire à 96 puits.

4. Viabilité cellulaire des sphéroïdes

  1. Préparer 8 à 10 sphéroïdes du cancer colorectal traités par LCFS dans des plaques multi-puits à paroi opaque (les tests de viabilité cellulaire sont effectués 48 h après le traitement par LCFS).
  2. Décongeler le réactif de viabilité cellulaire (voir tableau des matériaux)à 4 °C pendant la nuit.
  3. Équilibrez le réactif de viabilité cellulaire à la température ambiante avant utilisation.
  4. Avant d’effectuer le test, retirez 50% des milieux de croissance des sphéroïdes.
  5. Ajouter 100 μL de réactif de viabilité cellulaire à chaque puits.
    REMARQUE: Le volume à utiliser dépendra de la taille de la plaque comme suit: 100 μL pour les plaques de culture cellulaire à 96 puits.
  6. Mélanger vigoureusement le réactif pendant 5 min pour favoriser la lyse cellulaire.
  7. Incuber pendant 30 min – 2 h à 37 °C.
  8. Enregistrez la luminescence.

5. Analyse quantitative en temps réel de la réaction en chaîne de la polymérase pour les sphéroïdes

  1. Pour chaque condition, préparer 10 à 15 sphéroïdes dans un tube de 2 mL et centrifuger pendant 3 min à 400 x g.
  2. Jetez le surnageant et lavez les sphéroïdes deux fois dans 1 mL de PBS glacé 1x.
    REMARQUE: Évitez la centrifugation, laissez les sphéroïdes s’installer.
  3. Aspirer autant de PBS 1x que possible et isoler l’ARN à l’aide d’un kit disponible dans le commerce.
  4. Synthétisez l’ADNc à partir de 1 μg d’ARN à l’aide d’un kit disponible dans le commerce selon le protocole du fabricant.
  5. Préparez un mélange principal pour exécuter tous les échantillons en trois exemplaires (voir tableau 1 et tableau 2).
  6. Effectuez l’amplification dans un mélange maître de 20 μL dans chaque puits de plaque qPCR.
  7. Mélangez bien les réactions et faites tourner si nécessaire.
  8. Exécuter des échantillons conformément aux recommandations du fabricant de l’instrument (Tableau 3).

6. Western blotting des sphéroïdes

REMARQUE: Lors de la collecte des sphéroïdes, utilisez une pipette de 200 μL et coupez l’extrémité des pointes pour éviter de perturber leur structure.

  1. Pour chaque condition, préparez 30 à 40 sphéroïdes dans un tube de 2 mL.
  2. Placez le tube sur de la glace et laissez les sphéroïdes se déposer au fond du tube de 2 mL.
  3. Jeter le surnageant et laver les sphéroïdes deux fois dans 1 mL glacé 1x PBS
    REMARQUE: Évitez la centrifugation, laissez les sphéroïdes s’installer.
  4. Aspirer autant de PBS que possible et ajouter un tampon RIPA avec un cocktail d’inhibiteurs de protéase (10 sphéroïdes = 30 μL de tampon RIPA).
  5. Lysez les cellules en pipetant de haut en bas et effectuez une sonication pendant 30 s avec 30 s de repos sur la glace pendant 10 cycles.
  6. Centrifuger les lysates de protéines à 15000 x g pendant 15 min à 4 °C.
  7. Déterminer la concentration en protéines pour chaque lysate cellulaire.
  8. Avant le chargement, faire bouillir chaque lysate de cellule dans un tampon d’échantillon à 100 °C pendant 10 min.
  9. Chargez des quantités égales de protéines dans les puits du gel SDS-PAGE et faites fonctionner le gel pendant 1 à 2 h à 100 V.
  10. Transférer la protéine du gel à la membrane PVDF.
  11. Après le transfert, bloquer la membrane pendant 1 h à température ambiante à l’aide d’un tampon bloquant (5% de lait écrémé + TBS avec 0,05% de Tween-20).
  12. Incuber la membrane avec 1:1 000 dilutions d’anticorps primaires (Tableau 4) dans 1x TBST avec un tampon BSA à 5% à 4 °C pendant la nuit.
  13. Lavez la membrane trois fois avec TBST, 15 min pour chaque lavage.
  14. Incuber la membrane avec 1:2 500 dilutions d’anticorps secondaires dans le tampon bloquant à température ambiante pendant 2 h (voir Tableau des matériaux).
  15. Lavez la membrane trois fois avec TBST, 15 min pour chaque lavage.
  16. Préparer la membrane pour la détection HRP avec un substrat chimiluminescent.
  17. Acquérir des images chimiluminescentes.

7. Coloration à l’iodure de propidium (PI) des sphéroïdes

  1. Préparer 5 à 10 sphéroïdes comme décrit à l’étape 4.1 et placer les sphéroïdes dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2.
  2. Diluer un stock de 1 mg/mL de PI 1:100 dans 1x PBS.
  3. Retirer 50 % du milieu de chaque puits de la plaque de 96 puits.
  4. Ajouter 100 μL de la solution PI à chaque puits et placer les puits dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 10 à 15 min.
  5. Lavez la solution PI avec 1x PBS.
  6. Ajouter 200 μL de milieu de croissance et prendre une image à l’aide d’un microscope à fluorescence. Analysez l’intensité de fluorescence à l’aide de l’image J pour obtenir le nombre de viabilité du sphéroïde.

8. Analyse FACS des sphéroïdes

  1. Générez des sphéroïdes comme décrit précédemment.
  2. Pour chaque condition, préparez 30 à 40 sphéroïdes dans un tube FACS et centrifugez pendant 3 min à 400 x g et RT.
  3. Aspirer le surnageant et laver les sphéroïdes dans 3 mL de 1x PBS, puis centrifuger à 400 x g pendant 3 min à 4 °C.
  4. Aspirer le surnageant et ajouter 200 μL de 0,25% de trypsine-EDTA, puis incuber à RT pendant 2 à 3 min.
    REMARQUE: Le temps d’incubation dépend de la taille du sphéroïde et du type de cellule.
  5. Ajouter 1 mL de tampon FACS et dissocier délicatement les sphéroïdes à l’aide d’une pipette de 200 μL.
  6. Centrifuger les cellules dissociées à 400 x g et 4 °C pendant 3 min.
    REMARQUE: Tampon FACS = 1x PBS + 2,5% FBS, filtré à l’aide d’un filtre supérieur de 0,22 μm.
  7. Jeter le surnageant et ajouter le réactif 7-AAD/Annexin V (7AAD (5 μL), Annexin V (5 μL)/échantillon).
  8. Vortexez doucement les cellules et incubez pendant 13 à 30 minutes à RT dans l’obscurité.
  9. Ajouter 500 μL de tampon FACS et filtrer les cellules à l’aide de tubes à essai coniques en polystyrène pour éliminer les cellules agrégées.
  10. Centrifuger à 400 x g et 4 °C pendant 3 min.
  11. Ajouter 500 μL de tampon de liaison Annexin V à chaque tube et resuspend.
  12. Analysez à l’aide d’un cytomètre en flux.

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Résultats

Nous décrivons le protocole d’obtention de sphéroïdes à partir de diverses lignées cellulaires de cancer colorectal. Une supplémentation en méthylcellulose était nécessaire pour générer des sphéroïdes. Nous présentons également une méthode de préparation de LCFS et présentons un modèle pour étudier la corrélation entre les probiotiques et le cancer colorectal. Les protocoles de formation de sphéroïdes et de préparation LCFS sont illustrés schématiquement à la Figure 1A

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Discussion

Le microenvironnement tissulaire, y compris les cellules voisines et la matrice extracellulaire (ECM), est fondamental pour la génération de tissus et crucial dans le contrôle de la croissance cellulaire et du développement tissulaire13. Cependant, les cultures 2D présentent plusieurs inconvénients, tels que la perturbation des interactions cellulaires, ainsi que des altérations de la morphologie cellulaire, des environnements extracellulaires et de l’approche de la division

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucune information financière pertinente.

Remerciements

Cette recherche a été soutenue par les programmes « Établissement de normes de mesure pour la chimie et le rayonnement », numéro de subvention KRISS-2020-GP2020-0003, et « Développement de normes et de technologies de mesure pour les biomatériaux et la convergence médicale », numéro de subvention KRISS-2020-GP2020-0004, financé par l’Institut coréen de recherche sur les normes et les sciences. Cette recherche a également été soutenue par le ministère des Sciences et des TIC (MSIT), la Fondation nationale de recherche de Corée (NRF-2019M3A9F3065868), le ministère de la Santé et du Bien-être (MOHW), l’Institut coréen de développement de l’industrie de la santé (KHIDI, HI20C0558), le ministère du Commerce, de l’Industrie et de l’Énergie (MOTIE) et l’Institut coréen d’évaluation de la technologie industrielle (KEIT, 20009350). NUMÉRO ORCID (Hee Min Yoo: 0000-0002-5951-2137; Dukjin Kang : 0000-0002-5924-9674; Seil Kim : 0000-0003-3465-7118; Joo-Eun Lee : 0000-0002-2495-1439; Jina Lee : 0000-0002-3661-3701). Nous remercions Chang Woo Park pour son aide dans les expériences.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments

10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 15-well, 15 µl		Biorad4561036Pkg of 10
Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive FilmThermo Fisher Scientific4311971100 covers
10x transfer bufferIntronIBS-BT031A1 L
10X Tris-Glycine (W/SDS)IntronIBS-BT0141 L
Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube, Polypropylene, Clear, Nonsterile, 500 Tubes/Pack, 10 Packs/CaseCorningSCT-200-C500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case
BD Difco Bacto AgarBD214010500 g
BD Difco Lactobacilli MRS BrothBDDF0881-17-5500 g
CellTiter-Glo 3D Cell viability assayPromegaG9681100μl/assay in 96-well plates
Complete Protease Inhibitor CocktailSigma-Aldrich11697498001vial of 20 tablets
Corning Phosphate-Buffered Saline, 1X without calcium and magnesium, PH 7.4 ± 0.1Corning21-040-CV500 mL
EMD Millipore Immobilon-P PVDF Transfer Membranesfisher ScientificIPVH0001026.5cm x 3.75m roll; Pore Size: 0.45um
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap CapCorning35223525/Pack, 500/Case
Fetal Bovine Serum, certified, US originThermo Fisher Scientific16000044500 mL
iScript cDNA Synthesis Kit, 25 x 20 µl rxns #1708890Biorad170889025 x 20 µL rxns
iTaq Universal SYBR Green SupermixBiorad17251215 x 1 mL
Lactobacillus fermentumKorean Collection for Type CulturesKCTC 3112
L-Cysteine hydrochloride monohydrateSigma-AldrichC6852-25G25 g
Methyl Cellulose (3500-5600mPa·s, 2% in Water at 20°C)TCIM0185500 g
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mLApplied Biosystems434690620 plates
Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilizedMilliporeSLGS033SB250
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AADBiolegend640934100 tests
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122100 mL
Propidium IodideIntrogenP1304MP100 mg
RIPA Lysis and Extraction BufferThermo Fisher Scientific89901250 mL
RNeasy Mini Kit (250)Qiagen74106250
RPMI-1640Gibco11875-119500 mL
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redThermo Fisher Scientific25200056100 mL
Name of Materials/Equipment/SoftwareCompanyCatalog NumberComments/Description
anti - p-IκBα (B-9)Santa cruzesc-8404200 µg/mL
anti-BclxL (H-5)Santa cruzesc-8392200 µg/mL
anti-PARP 1 (C2-10)Santa cruzesc-5364350 µl ascites
anti-β-actin (C4)Santa cruzesc-47778200 µg/mL
BD FACSVerseBD BiosciencesSan Diego, CA, USA
Synergy HTX Multi-Mode Microplate ReaderBioTS1LFA
CO2 incubatorThermo fisherHERAcell 150i
Conical tube 15 mlSPL50015
Conical tube 50 mlSPL50050
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well PlateSigma-AldrichCLS7007
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well PlateSigma-AldrichCLS3471
Costar 50 mL Reagent Reservoirs, 5/Bag, SterileCostar4870
Countess Cell Counting Chamber SlidesThermofisherC10228
Countess II FL Automated Cell CounterinvitrogenAMQAF1000
EnSpire Multimode ReaderPerkin ElmerEnspire 2300
Eppendorf Research Plus Multi Channel Pipette, 8-channelEppendorf3122000051
FlowJo softwareTreeStarAshland, OR, USA
Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson immunoresearch115-035-0621.5 mL
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson immunoresearch111-035-1442.0 mL
GraphPad Prism 5GraphPad SoftwareInc., San Diego, CA, USA
ImageJNIH
ImageQuant LAS 4000 miniFujifilmTokyo, Japan
Incubated shakerLab companionSIF-6000R
Multi Gauge Ver. 3.0,FujifilmTokyo, Japan
Optical density (OD)LAMBDA UV/Vis SpectrophotometersPerkin ElmerWaltham, MA, USA
Phase-contrast microscopeOlympusTokyo, Japan
SPL microcentrifuge tube 1.5mLSPL60015
SPL Multi Channel Reservoirs, 12-Chs, PS, SterileSPL21012
StepOnePlus Real-Time PCR systemThermo Fisher ScientificWaltham, MA, USA
Vibra-Cell Ultrasonic Liquid ProcessorsSONICS-vibra cellVC 505500 Watt ultrasonic processor
Vinyl Anaerobic ChamberCOY LAB PRODUCTS

Références

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